Bestätigung der viralen Transduktion in rezellularisierter Rattenleber mittels immunhistochemischer Färbung

Beginnen Sie mit gefrorenem rekellularisiertem Rattengewebegewebe, das humane Hepatozyten enthält und in Kryomedium eingebettet ist.

In diesem Gewebe exprimieren die transduzierten Hepatozyten das smaragdgrüne fluoreszierende Protein (EmGFP), ein Reporterprotein, das durch den viralen Vektor kodiert wird.

Verwenden Sie ein Kryotom, um dünne Schnitte anzufertigen, die die zelluläre und histologische Architektur erhalten. Übertragen Sie die Schnitte auf einen Objektträger.

Behandeln Sie die Schnitte mit einem milden Detergens, um die Zellmembran permeabilisierbar zu machen.

Applizieren Sie einen anti-EmGFP-Primärantikörper, der spezifisch an das fluoreszierende Reportergegenprotein bindet, das in transduzierten Zellen exprimiert wird.

Spülen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.

Führen Sie einen sekundären Antikörper ein, der mit einem roten Fluorophor konjugiert ist und an den primären Antikörper bindet, und waschen Sie anschließend.

Fügen Sie einen DNA-spezifischen blauen Fluoreszenzfarbstoff hinzu, der an zelluläre DNA bindet.

Unter einem Fluoreszenzmikroskop bestätigt die Kolokalisation der roten Fluoreszenz mit blau angefärbten Kernen, dass die transduzierten Hepatozyten im Lebergewebe das virale Reportergenprotein erfolgreich exprimieren.

Schneiden Sie mit einem Skalpell Proben aus jedem Leberlappen, die etwa einen halben Zentimeter dick und 1,5 bis 2 Zentimeter lang sind. Inkubieren Sie die Schnitte in 4 % Paraformaldehyd mit 4 % Saccharose für 90 Minuten bei vier Grad Celsius.

Anschließend die Proben dreimal mit PBS je eine Minute lang waschen. Im Anschluss an die Waschschritte die Proben über Nacht in 8 % Saccharose bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag die Proben in Kryoschneidformen geben, die etwas Fixiermedium enthalten.

Vermeiden Sie das Einführen von Luftblasen. Sobald die Proben beladen sind, decken Sie sie vollständig mit Fixiermedium ab und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Bereiten Sie nach dem Einfrieren 10 µm dicke Kryoschnitte der Proben mit einem Kryotom vor.

Färben Sie die Proben nach Bedarf, um die Rezellularisierung zu bestätigen.