JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologie
0 Ansichten • 3:33 Min. • August 31st, 2026
Nehmen Sie eine humane Zellkultur.
Fügen Sie Lentiviren hinzu, die eine konditionale, gegen die Wirt-mRNA gerichtete shRNA unter einem Tetracyclin-reaktiven Promotor, der mit einem Operator verbunden ist, kodieren.
Das Lentivirus trägt außerdem Gene für einen Tetracyclin-Repressor und ein Antibiotikaresistenzprotein, die unter einem konstitutiven Promotor platziert sind.
Inkubieren, um die Übertragung der viralen RNA in die Wirtszellen zu ermöglichen.
Die RNA wandelt sich in cDNA um und integriert sich in das Wirts-Genom ein.
Waschen, Medium hinzufügen und inkubieren, um die Expression des Tetracyclin-Repressors und des Antibiotikaresistenzproteins zu ermöglichen, wodurch transduzierte Zellen generiert werden. Der Tetracyclin-Repressor bindet an den Operator und unterdrückt die Expression der shRNA.
Waschen, antibiotisch ergänztes Medium hinzufügen und inkubieren.
Transduzierte Zellen exprimieren das Antibiotikaresistenzprotein, wodurch ihr selektives Überleben in Gegenwart des Antibiotikums ermöglicht wird.
Fügen Sie Doxycyclin, ein Tetracyclin-Analogon, der Kultur hinzu.
Doxycyclin bindet an den Tetracyclin-Repressor und verhindert dessen Bindung an den Operator, wodurch die shRNA-Expression ermöglicht wird.
Die shRNA wird in siRNA verarbeitet, die in den RISC eingelagert wird und die Ziel-mRNA abbaut.
Dadurch werden doxycyclinabhängige, bedingte Knockdown-Zellen erzeugt.
Um stabile Zelllinien zu erzeugen, säen Sie HCT-116-Darmkrebszellen und MDA-MB-231-Brustkrebszellen in eine 12-Loch-Platte mit jeweils 50.000 Zellen pro Loch aus.
Bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Wenn die Zellen 60–70 % konfluent sind, die Zellen mit PBS waschen und ein Milliliter virushaltiges Medium zu jedem Brunnen hinzufügen. Am nächsten Tag das virushaltige Medium vorsichtig durch Aspiration entfernen.
Danach die Zellen mit PBS waschen und Medium mit tetracyklinfreiem FBS hinzufügen. Nach 72 Stunden die Zellen erneut wie zuvor waschen und Medium, ergänzt mit einem Mikrogramm pro Milliliter Puromycin, zur Selektion der virus-transduzierten Zellen hinzufügen. Die virus-transduzierten Zellen durch Kultivierung in Gegenwart von Puromycin über drei bis 14 Tage auswählen.
Beobachten Sie eine partielle Abtötung der Zellen durch Puromycin in den Vertiefungen mit virus-transduzierten Zellen. Nicht transduzierte Zellen wachsen in Gegenwart von Puromycin nicht.
Überprüfen Sie die Effizienz des konditionalen Knockdowns in den Puromycin-resistenten Kolonkarzinomzellen HCT-116 und Brustkrebszellen MDA-MB-231, indem Sie Medium mit verschiedenen Konzentrationen von Doxycyclin hinzufügen und die Zellen 72 Stunden lang kultivieren.