Bestimmung des Lentivirustiters mittels eines Enzyme-Linked Immunosorbent Assays

Verwenden Sie lentivirale Vektoren, die das HIV-1-p24-Antigen enthalten, ein Proteinmarker, der für den Nachweis verwendet wird.

Fügen Sie ein Detergens hinzu, um p24 zu lysieren und freizusetzen, und verdünnen Sie die Probe anschließend seriell.

Verwenden Sie eine Mikroplatte, die mit anti-p24 monoklonalen Antikörpern beschichtet und mit einem Blockierungsmittel versehen ist, um unspezifische Bindung zu verhindern.

Fügen Sie die Probenverdünnungen und p24-Standards als Referenzen hinzu.

Inkubieren, um die Wechselwirkung von p24 mit den Antikörpern über ein spezifisches Epitop zu ermöglichen, anschließend nicht gebundene Komponenten entfernen.

Inkubieren Sie mit anti-p24 polyklonalen Antikörpern, die an verschiedene Epitope auf p24 binden. Entfernen Sie alle nicht gebundenen Antikörper.

Fügen Sie Peroxidase-markierte Antikörper hinzu, die an die polyklonalen Antikörper binden. Entfernen Sie ungebundene Antikörper.

Fügen Sie ein Peroxidase-Substrat hinzu, das in ein farbiges Produkt umgewandelt wird.

Fügen Sie eine Säure hinzu, um die Peroxidase zu inaktivieren und das Produkt zu stabilisieren.

Messen Sie die Absorption, die der Farbintensität entspricht und proportional zur p24-Konzentration ist.

Erstellen Sie den Standardgraphen und schätzen Sie die Probenkonzentrationen ein, um die virale Titer zu bestimmen.

Bestreichen Sie eine Hochbindungs-96-Well-Platte mit 100 µL monoklonalem anti-p24-Antikörper in einer Verdünnung von 1:1.500 gemäß dem Protokoll des NIH AIDS Vaccine Program für das HIV-1 p24 Antigen Capture Assay Kit. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag waschen Sie die Platte dreimal mit jeweils 200 µL 0,05 % Tween-20 in kaltem PBS.

Um nicht-spezifische Bindungen zu vermeiden, blockieren Sie die Platte mit 200 µL 1 % Rinderserumalbumin eine Stunde bei Raumtemperatur. Anschließend waschen Sie die Platte dreimal mit jeweils 200 µL 0,05 % Tween-20 in kaltem PBS. Danach bereiten Sie die konzentrierten und nicht-konzentrierten Vektorproben auf eine Endkonzentration von 10 % vor, indem Sie den Vektor mit doppelt destilliertem Wasser und Triton X-100 verdünnen.

Bereiten Sie anschließend die HIV-1-Standards durch zweifache serielle Verdünnung beginnend bei fünf Nanogramm pro Milliliter vor. Nach der Verdünnung der konzentrierten und nicht konzentrierten Vektorproben pipettieren Sie diese in dreifacher Ausführung auf die Platte und inkubieren sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag waschen Sie die Platte, geben dann 100 Mikroliter polyklonales Kaninchen-Anti-p24-Antikörper in jedes Loch und inkubieren vier Stunden bei 37 Grad Celsius.

Nach sechs Waschungen die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit Ziegen-Anti-Kaninchen-Horseradish-Peroxidase inkubieren. Nach mehrfachem Waschen die Platte 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit TMB-Peroxidase-Substrat inkubieren. Eine normale Salzsäure hinzufügen, um die Reaktion zu stoppen. Die Absorption bei 450 Nanometern mit einem Absorptions-Plattenreader messen.