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Mikrobiologie
0 Aufrufe • 2:44 Min. • August 31st, 2026
Beginnen Sie mit einer Mischung aus Plasmiden, die in einem Nährmedium suspendiert sind.
Das erste Plasmid trägt ein rekombinantes adenoassoziiertes Virus (AAV)-Genom, das das Gen der Interesse codiert.
Das zweite Plasmid kodiert die Rep- und Cap-Proteine.
Das dritte Plasmid kodiert für Hilfsproteine.
Fügen Sie ein Transfektionsmittel zur Plasmidlösung hinzu. Gut mischen und inkubieren.
Das positiv geladene Transfektionsmittel bindet an die negativ geladene Plasmid-DNA und bildet Komplexe.
Fügen Sie die Komplexe einer Monolayer von Säugetierzellen hinzu. Inkubieren Sie.
Die Komplexe gelangen über Endozytose in die Zellen.
Innerhalb der Zellen führen die plasmidcodierten Gene zur Expression viraler Proteine.
Das Rep-Protein repliziert das virale Genom, während die Cap-Proteine die Kapsidhüllen bilden.
Das Rep-Protein verpackt zusammen mit Hilfsproteinen das replizierte virale Genom in Kapside und bildet dadurch vollständige AAV-Partikel.
Die rekombinanten AAV-Vektoren, die das Gen von Interesse tragen, sind bereit für Anwendungen in der Genübertragung.
Nachdem rAAV9-Konstrukte erzeugt und HEK293-Zellen gemäß dem Textprotokoll kultiviert wurden, am ersten Tag für die Transfektion der Zellen 70 Mikrogramm AAV-Rep/Cap-Plasmid, 70 Mikrogramm rAAV9-Plasmid und 200 Mikrogramm Ad-Hilfsplasmid in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen kombinieren. 49 Milliliter DMEM bei Raumtemperatur ohne FBS zum Röhrchen geben und gut mischen. Anschließend, um ein Vier-zu-eins-Verhältnis von PEI zu DNA-Lösung herzustellen, 1.360 Mikroliter PEI zum Röhrchen geben und gut mischen.
Die Lösung 15 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation fünf Milliliter der Lösung zu jeder 150-Milliliter-Zellkulturplatte hinzufügen. Die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 für 50 bis 72 Stunden kultivieren.