Reinigung rekombinanter Viruspartikel aus transfizierten menschlichen Nierenzellen

Beginnen Sie mit einem Zelllysat, das zelluläre DNA enthält, die mit zellulären Proteinen und viralen Partikeln aggregiert ist.

Fügen Sie Magnesiumionen hinzu, gefolgt von einer Nuklease, um den enzymatischen Abbau der zellulären DNA zu aktivieren und DNA-Protein-Aggregate aufzulösen.

Zentrifugieren, um Trümmer zu trennen, und das Überstand entnehmen, der virale Partikel enthält.

Schichten Sie das Überstand auf ein diskontinuierliches Iodixanol-Gradient mit von oben nach unten zunehmenden Konzentrationen und füllen Sie das Gefäß anschließend mit Puffer.

Ultrazentrifugieren, um die Komponenten basierend auf ihrer Dichte zu trennen. Die Viruspartikel sammeln sich an der Grenzfläche zwischen den Schichten mit hoher und mittlerer Dichte an.

Führen Sie eine Nadel an dieser Grenzfläche ein und sammeln Sie die Viruspartikel in einem Reagenzglas auf.

Fügen Sie ein Puffermittel mit stabilisierenden Bestandteilen hinzu, das die Aggregation von Viruspartikeln verhindert.

Überführen Sie die Lösung dann in ein Gefäß mit einem Membranfilter.

Zentrifugieren Sie, um die viralen Partikel oberhalb des Filters zu konzentrieren.

Fügen Sie den Puffer mit Zusatz des stabilisierenden Agents hinzu und zentrifugieren Sie erneut, um gereinigte virale Partikel zu erhalten.

Um die transfizierten Zellen zu gewinnen, lösen Sie die Zellen durch Auf- und Abpipettieren mit dem Kulturmedium und suspendieren Sie sie. Überführen Sie dann die Zellsuspensionen in sterile 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 × g für fünf Minuten.

Anschließend fünf Milliliter PBS zu jedem Röhrchen hinzufügen und die Zellpellets resuspendieren, bevor alle Suspensionen in einem 50-Milliliter-Röhrchen vereinigt werden. Nach dem Zentrifugieren der Zellen bei 500 × g für fünf Minuten das Überstand entfernen. Zur Reinigung des AAV das Pellet in 10 Milliliter Lysepuffer resuspendieren.

Gefrieren Sie das Lysat bei minus 80 Grad Celsius oder in einem Trockeneis-Ethanol-Bad. Tauchen Sie es anschließend bei 37 Grad Celsius auf. Vortexen Sie das Lysat eine Minute lang, bevor Sie den Gefrier- und Auftauvorgang noch zweimal wiederholen.

Fügen Sie anschließend einklinigen Chlorid in einer Konzentration von einem Millimolar zum aufgetauten Lysat hinzu. Dann geben Sie Nuklease in einer Endkonzentration von 250 Einheiten pro Milliliter zu. Inkubieren Sie die Lösung bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten, um die DNA-Protein-Aggregation aufzulösen.

Zentrifugieren Sie die Probe bei 4.800 × g und vier Grad Celsius für 20 Minuten. Sammeln Sie anschließend den Überstand. In der Zwischenzeit bereiten Sie eine 17 %ige Iodixanol-Gradientenlösung vor, indem Sie fünf Milliliter 10× PBS mit 0,05 Millilitern einer einmolaren Magnesiumchloridlösung, 0,125 Millilitern einer einmolaren Kaliumchloridlösung, 12,5 Milliliter Dichtegradientenmedium und 10 Millilitern einer fünfmolaren Natriumchloridlösung mischen.

Verwenden Sie Wasser, um das Gesamtvolumen auf 50 Milliliter einzustellen. Nachdem Sie 25 %, 40 % und 60 %ige Gradientenlösungen gemäß dem Textprotokoll hergestellt haben, geben Sie mit einer Nadel und Spritze fünf Milliliter 17 %ige Gradientenlösung in ein Polypropylenröhrchen. Darauf folgen jeweils fünf Milliliter der 25 %igen, 40 %igen und 60 %igen Gradientenlösung.

Die Lyse auf die Gradientenlösung aufschichten. Dann die Zentrifugenröhrchen mit Lysepuffer auffüllen und mit einem Korken verschließen. Den Gradienten 90 Minuten bei 185.000 × g und 16 °C zentrifugieren.

Nach dem Zentrifugieren verwenden Sie eine Spritze, um die virale Fraktion bei 40 % zu gewinnen, indem Sie eine 21-Gauge-Nadel in den Schnittpunkt zwischen den Fraktionen bei 40 % und 60 % einführen und die 25 %-Schicht vollständig vermeiden. Mischen Sie die virale Fraktion mit sterilisierter Polyoxyethylen-polyoxypropylen-Lösung (PEG-PPG-Blockcopolymer) in PBS bis zu einem Gesamtvolumen von 15 Milliliter. Geben Sie das Gemisch in ein Filterröhrchen mit einer Molekulargewichts-Trenngrenze von 100 Kilodalton.

Anschließend die Probe bei 2.000 × g und vier Grad Celsius 30 Minuten lang zentrifugieren. Die Lösung vom Boden des Röhrchens abgießen. Danach das Filterröhrchen mit PEG-PPG auf 15 Milliliter auffüllen.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 2.000 × g und vier Grad Celsius für 20 Minuten. Nachdem Sie das Nachfüllen und Zentrifugieren noch zweimal wiederholt haben, sammeln Sie die gereinigte rAAV9-Virusfraktion, die sich weiterhin oberhalb des Filters befindet.