Immortalisierung von Endothelzellen durch retrovirale Transduktion viraler Onkogene

Nehmen Sie ein Medium, das Retroviruspartikel enthält, welche virale Onkogene und ein Antibiotikaresistenzgen kodieren.

Zentrifugieren Sie das Medium, um Zelltrümmer zu entfernen.

Sammeln Sie das Überstand enthaltende Viruspartikel und geben Sie ihn auf eine Kultur von Endothelzellen.

Incubieren, um den viralen Eintritt zu ermöglichen.

Die virale RNA wird in DNA umgeschrieben, die in das Wirtsgenom integriert wird.

Das Antibiotikaresistenzgen erzeugt ein Resistenzprotein. Die Onkogene produzieren Proteine, die an Tumorsuppressorproteine binden, welche die Zellteilung kontrollieren, und inaktivieren diese, wodurch die Lebensdauer der Zelle verlängert wird.

Ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium.

Erneut inkubieren, um eine stabile Integration der viralen DNA sicherzustellen.

Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen.

Ein enzymatisches Dissoziationssystem hinzufügen, um die Zellen zu lösen.

Übertragen Sie die Zellsuspension, zentrifugieren Sie diese und entfernen Sie das Überstand.

Suspendieren Sie das Pellet und überführen Sie es in einen Kolben.

Fügen Sie ein Antibiotikum dem Medium hinzu.

Nur Zellen, die das Antibiotikaresistenzprotein exprimieren, überleben, wodurch Zellen ausgewählt werden, die durch virale Onkogenproteine immortalisiert wurden.

Nach einer Übernachtinkubation sammeln Sie das Medium aus der PA317-Zellkultur und klären es durch Zentrifugation bei 300 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Ersetzen Sie das EGM-Medium aus der 50 % konfluenten Endothelzellenkultur durch 12 Milliliter des geklärten PA317-Mediums. Inkubieren Sie die Zellen vier Stunden lang.

Danach ersetzen Sie sechs Milliliter des PA317-Mediums durch sechs Milliliter frisches EGM-Medium und inkubieren die Zellen über Nacht. Anschließend entfernen Sie das Medium aus der Endothelzellkultur und versorgen die Zellen mit 12 Milliliter frischem EGM. Fahren Sie mit der Inkubation der Zellen für weitere 48 Stunden fort.

Um Endothelzellen umzusiedeln, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 12 Milliliter kationsfreier PBS. Geben Sie anschließend drei Milliliter einer kommerziellen enzymatischen Dissoziationslösung hinzu und inkubieren Sie die Zellen 3 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Überführen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Konischgefäß und zentrifugieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 300 × g.

Nach dem Pellettieren die Zellen in frischem EGM-Medium resuspendieren und die Suspension gleichmäßig auf drei T75-Flaschen aufteilen. Das Volumen der Kulturen auf 12 Milliliter EGM pro Flasche einstellen. Anschließend 200 Mikrogramm pro Milliliter G418 hinzufügen, um transduzierte endotheliale Zellen auszuwählen.