Bestimmung der viralen RNA-Verteilung in Wirtszellen mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung

Beginnen Sie mit einem Objektträger, der permeabilisierte, virusinfizierte Wirtszellen enthält, wobei virale RNAs zwischen den nukleären und zytoplasmatischen Kompartimenten verteilt sind.

Fügen Sie einen Vorhybridisierungspuffer hinzu und inkubieren Sie unter feuchten Bedingungen.

Im Puffer blockieren Blockierreagenzien unspezifische Bindungsstellen, während RNase-Inhibitoren RNasen inaktivieren und die Integrität der RNA bewahren.

Entfernen Sie den Puffer und geben Sie denaturierte, mit Digoxigenin markierte Oligonukleotidsonden hinzu, die komplementär zur viralen RNA sind.

Im Dunkeln inkubieren, um die Hybridisierung von Probe und RNA zu ermöglichen, anschließend wiederholt waschen.

Fügen Sie ein Fixativ hinzu, um die Probe-RNA-Hybride zu stabilisieren, und waschen Sie anschließend wiederholt. Geben Sie einen mit Detergens angereicherten Puffer hinzu, um die Zellpermeabilität aufrechtzuerhalten.

Fügen Sie einen mit einem grünen Fluorophor konjugierten Anti-Digoxigenin-Antikörper hinzu, der mit Digoxigenin interagiert, und waschen Sie anschließend wiederholt ab.

Fixieren Sie die Zellen, um die Komplexe zu erhalten, und waschen Sie sie anschließend erneut.

Fügen Sie einen DNA-Bindungsfarbstoff hinzu, um die Kerne anzufärben. Spülen Sie überschüssigen Farbstoff wiederholt ab.

Abdecken Sie mit einem Deckglas und versiegeln Sie es.

Unter einem konfokalen Mikroskop die grüne Fluoreszenz sichtbar machen, die die Verteilung der viralen RNA zwischen Zellkern und Zytoplasma der Wirtszelle widerspiegelt.

Nach drei PBS-Spülungen, wie gezeigt, die Proben erneut für 10–15 Minuten in 4 % Formaldehyd in PBS fixieren, bevor eine zweite Permeabilisierung wie gezeigt durchgeführt wird. Danach die Objektträger mit Aluminiumfolie abdecken, um das fluoreszierende Signal zu erhalten und eine Photobleiche zu verhindern.

Und waschen Sie die Zellen mit 2x Salin-Natriumcitrat, bevor Sie 45 Mikroliter Hybridisierungslösung hinzufügen. Nach einer Stunde bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer destilliertes Wasser zu den Antisense-Oligonukleotiden der gewünschten Sequenz hinzufügen, um das Denaturierungsvolumen auf 10 Mikroliter aufzufüllen. Die Oligonukleotide bei 95 Grad Celsius fünf Minuten lang denaturieren, bevor pro Objektträger 35 Mikroliter frische Hybridisierungslösung zugegeben werden.

Dann inkubieren Sie die Proben 10–24 Stunden in der befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius, geschützt mit Folie. Am nächsten Tag waschen Sie die Zellen zweimal mit jeweils 10-minütigen Waschungen in 2X Salin-Natriumcitrat bei Raumtemperatur, gefolgt von einer 10-minütigen Wäsche in 1X Salin-Natriumcitrat bei 25 Grad Celsius.

Nach der letzten Waschung die Zellen mit vorab gekühltem 4 % Formaldehyd in PBS für 10–15 Minuten auf Eis fixieren, gefolgt von drei Waschungen mit frischem PBS. Anschließend die Proben wie gezeigt permeabilisieren und danach eine Stunde bei vier Grad Celsius mit Anti-Digoxigenin-FITC und vorab gekühltem 0,1 % BSA in PBS inkubieren. Am Ende der Inkubation die Objektträger dreimal mit frischem PBS waschen und die Proben mit vorab gekühltem 4 % Paraformaldehyd in PBS für 10–15 Minuten bei vier Grad Celsius fixieren.

Nach drei Waschungen in PBS die Kerne mit 0,4 Mikrogramm pro Milliliter DAPI und vorgekühltem 0,5 % Triton-X in PBS für 15 Minuten auf Eis inkubieren, gefolgt von drei abschließenden Waschungen in PBS. Die Objektträger mit fluoreszierenden Kügelchen entsprechend den experimentellen Anforderungen und in geeignetem Eindeckmedium eindecken. Nach dem Entfernen des überschüssigen Eindeckmediums mit sterilen Tüchern jede Deckglasabdeckung mit mehreren Schichten farblosem Nagellack versiegeln und ein Fluoreszenzmikroskop verwenden, um die erfolgreiche Durchführung des Experiments zu bestätigen.

Anschließend können Bilder mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen werden, um innerhalb einer Stunde bis zu einer Woche nach der Präparation bei einer 630-fachen Vergrößerung Bilder der Proben zu sammeln.