Bestimmung der viralen RNA-Verteilung in Wirtszellen mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung

Beginnen Sie mit einem Objektträger, der permeabilisierte, virusinfizierte Wirtszellen enthält, wobei virale RNAs zwischen den nukleären und zytoplasmatischen Kompartimenten verteilt sind.

Fügen Sie einen Vorhybridisierungspuffer hinzu und inkubieren Sie unter feuchten Bedingungen.

Im Puffer blockieren Blockierreagenzien unspezifische Bindungsstellen, während RNase-Inhibitoren RNasen inaktivieren und die Integrität der RNA bewahren.

Entfernen Sie den Puffer und geben Sie denaturierte, mit Digoxigenin markierte Oligonukleotidsonden hinzu, die komplementär zur viralen RNA sind.

Im Dunkeln inkubieren, um die Hybridisierung von Probe und RNA zu ermöglichen, anschließend wiederholt waschen.

Fügen Sie ein Fixativ hinzu, um die Probe-RNA-Hybride zu stabilisieren, und waschen Sie anschließend wiederholt. Geben Sie einen mit Detergens angereicherten Puffer hinzu, um die Zellpermeabilität aufrechtzuerhalten.

Fügen Sie einen mit einem grünen Fluorophor konjugierten Anti-Digoxigenin-Antikörper hinzu, der mit Digoxigenin interagiert, und waschen Sie anschließend wiederholt ab.

Fixieren Sie die Zellen, um die Komplexe zu erhalten, und waschen Sie sie anschließend erneut.

Fügen Sie einen DNA-Bindungsfarb