Affinitätschromatographie-basierte Reinigung von adeno-assoziierten Virusvektoren

Beginnen Sie mit einem filtrierten Zelllysat, das adeno-assoziierte Virusvektoren (AAV) und vom Wirt stammende Verunreinigungen enthält.

Lysat durch eine Heparin-basierte Affinitäts-Säule leiten.

Die viralen Kapsidproteine binden elektrostatisch an die negativ geladenen Heparin-Gruppen.

Spülen Sie die Säule mit einem Puffer, um nicht gebundene Verunreinigungen zu entfernen.

Ein Puffer, der ein Tensid enthält, wird zugegeben, um membranöses Zelltrümmermaterial aufzulösen.

Nochmals mit dem detergentfreien Puffer spülen.

Führen Sie einen mit Kationen angereicherten Puffer ein, um ein ionisches Milieu zu schaffen, und waschen Sie anschließend mit einem Puffer mit mäßiger Salzkonzentration, um schwach gebundene Verunreinigungen freizusetzen.

Fügen Sie einen Puffer mit hohem Salzgehalt hinzu, um die Wechselwirkungen zwischen Kapsid und Heparin zu stören und die viralen Partikel zu eluieren.

Sammeln Sie die Elutionsfraktionen, die angereicherte intakte Viruspartikel enthalten, und überführen Sie sie in Zentrifugalkonzentratoren mit Filtermembranen.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen, um überschüssiges Pufferlösung zu entfernen, und sammeln Sie die konzentrierten viralen Fraktionen in einem Röhrchen.

Spülen Sie die Membran mit dem Puffer, um restliche Viruspartikel zu gewinnen und die Ausbeute zu maximieren.

Den rohen Lysat bei vier Grad Celsius über Nacht auftauen.

Nach dem Auftauen filtrieren Sie die Probe mit einem 0,22-Mikrometer-Filter. Unmittelbar vor den Reinigungsschritten passivieren Sie den Zentrifugal-Konzentrator, indem Sie vier Milliliter Filter-Vorbehandlungspuffer pro verwendeter Heparin-Sepharose-Säule hinzufügen. Platzieren Sie den Schlauch in einer peristaltischen Pumpe.

Führen Sie nacheinander die Lösungen und Medien durch. Bereiten Sie die Chromatographie vor, indem Sie eine fünf Milliliter umfassende Heparin-Sepharose-Säule an den Schlauch anschließen und 25 Milliliter Bazell-DMEM durch die Säule leiten. Anschließend geben Sie 0,2 Mikromolar der filtrierten Rohlysatprobe mit einer Fließgeschwindigkeit von ein bis zwei Tropfen pro Sekunde auf die Säule.

Spülen Sie die Säule nacheinander, um fünf Milliliter jeweils fünfmal mit 300 Millimolar Natriumchlorid HBSS, mit Magnesium und Calcium, zu eluieren, und beschriften Sie die fünf Elutionen als E1 bis E5. Wenn bereit, zentrifugieren Sie den Zentrifugal-Konzentrator, der den Vorbehandlungspuffer enthält, bei 900 × g für zwei Minuten. Entsorgen Sie den Durchlauf. Spülen Sie den Filter des Zentrifugal-Konzentrators mit vier Millilitern HBSS mit Magnesium und Calcium, indem Sie ihn bei 1000 × g für zwei Minuten zentrifugieren.

Fügen Sie dann die Elutionsfraktion E2 dem Zentrifugal-Konzentrator hinzu und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang mit 1000 × g. Entsorgen Sie den Durchlauf. Zentrifugieren Sie auf die gleiche Weise die Elutionsfraktion E3 in den Zentrifugal-Konzentrator, bis das konzentrierte Virus etwa ein Milliliter beträgt.

Entnehmen Sie das konzentrierte Virus mit einer gefilterten P200-Spitze aus dem Zentrifugal-Konzentrator und sammeln Sie es in einem sterilen 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Nach der Sammlung des Virus spülen Sie den Zentrifugal-Konzentrator mit 200 Mikrolitern HBSS mit Magnesium und Calcium aus. Pipettieren Sie 30 Sekunden lang kräftig auf und ab, um eventuell an der Membran haftendes Virus zu lösen, und sammeln Sie das konzentrierte Virus in demselben 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Mischen Sie das Reagenzglas gründlich.