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Mikrobiologie
0 Aufrufe • 3:07 Min. • August 31st, 2026
Nehmen Sie eine Mikroinjektionsschale mit einem Tropfen Embryokulturmedium in der Mitte, der mit Mineralsöl bedeckt ist, um Verdunstung zu verhindern.
Stellen Sie die Schale unter ein inverses Mikroskop.
Platzieren Sie eine Mikroinjektionskapillare und eine Haltepipette an einem Mikromanipulator-Setup unter dem Mikroskop.
Die Mikroinjektionskapillare wird mit einer Suspension von Lentiviren-Vektoren, die das Transgen tragen, beladen.
Anschließend befruchtete Rattenembryonen in das Medium überführen.
Befestigen Sie ein Embryo mit der Haltepipette, indem Sie Saugkraft anwenden.
Unter höherer Vergrößerung die Mikroinjektionskapillare durch die extrazelluläre Glykoproteinhülle des Embryos, die Zona pellucida, einführen und die Lentivirus-Suspension in den perivitellinen Raum injizieren.
Anschließend die injizierten Embryonen in eine Kulturschale überführen und inkubieren.
Das Virus dringt in das Embryo ein und setzt sein Genom, das das Transgen enthält, in das Zytoplasma frei.
Anschließend wird es revers transkribiert in DNA und integriert sich in das Genom des Embryos, wodurch das Transgen eingefügt wird.
Die transduzierten Embryonen sind nun bereit für die Verarbeitung.
Für die Mikroinjektion von lentiviralen Vektoren unter die Zona pellucida von Ein-Zell-Stadium-Embryonen verwenden Sie einen Pipettenzieher, um Mikroinjektions-Kapillaren aus Borosilikatglas mit einem Filament herzustellen. Führen Sie jedes Mal nach einem Wechsel des Filaments oder bei Verwendung einer neuen Glas-Kapillare einen Rampentest durch, um die optimalen Parameter einzustellen.
Als Nächstes etwa zwei µL frisch aufgetauter lentiviraler Lösung pro Injektionspipette mit einer Mikroladepipette unter einer biosicheren Abzugshaube aufnehmen. Einen Tropfen von 100 µL M2-Medium in die Mitte des Deckels einer 60 mm Petrischale geben. Das Medium mit Mineralspacht abdecken und die Haltepipette sowie die mit Virus beladene Injektionskapillare an einem Mikromanipulator befestigen.
Platzieren Sie die Mikroinjektionsschale unter ein invertiertes Mikroskop und übertragen Sie 15 bis 20 Ein-Zell-Stadium-Embryonen in den M2-Tropfen in der Mikroinjektionsschale. Halten Sie einen Embryo mit der Haltepipette fest und verwenden Sie die 400-fache Vergrößerung sowie die Glas-Kapillare, um die lentivirale Lösung unter die Zona pellucida in den perivitellinen Raum zu injizieren, wobei die Kapillare nach der Abgabe des Virus einen Moment lang unter der Zona pellucida verbleibt. Nachdem alle Embryonen injiziert wurden, verwenden Sie eine feine Pipette, um die injizierten Zellen in die Kulturschale zurückzubringen, und stellen Sie die Schale bis zur Implantation in den Zellkultur-Inkubator zurück.