Reinigung der viralen Integrase mittels Affinitätschromatographie

Beginnen Sie mit einer Suspension bakterieller Zellen, die viralen Polyhistidin-markierten Integrationsenzym exprimieren.

Sonizieren Sie die Suspension, um die bakteriellen Membranen zu disruptieren und die Integrationsenzyme freizusetzen.

Überführen Sie das Lysat in ein Ultrazentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie mit hoher Geschwindigkeit, um den Zelltrümmern zu pelletieren, und sammeln Sie den Überstand.

Nehmen Sie als Nächstes eine Chromatographiesäule, die mit nickelbeladener Harz gefüllt ist, und equilibrieren Sie sie mit Puffer.

Laden Sie das geklärte Lysat auf die Säule auf.

Proteine mit Histidinen binden schwach an Nickel, während polyhistidinmarkierte Integrase stark bindet.

Spülen Sie mit Puffer, um ungebundene Proteine zu entfernen, und geben Sie dann Elutionspuffer mit linear ansteigender Imidazolkonzentration hinzu.

Imidazol konkurriert mit Histidin um die Nickelformierung und setzt die Integrationsstelle frei.

Sammeln Sie die Fraktionen und überführen Sie Aliquots in Röhrchen mit Lade-Puffer.

Erhitzen, um die Proteine zu denaturieren, und anschließend auf ein Polyacrylamidgel auftragen.

Führen Sie die Elektrophorese durch und analysieren Sie die Proteinbanden.

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