Reinigung der viralen Integrase mittels Affinitätschromatographie

Beginnen Sie mit einer Suspension bakterieller Zellen, die viralen Polyhistidin-markierten Integrationsenzym exprimieren.

Sonizieren Sie die Suspension, um die bakteriellen Membranen zu disruptieren und die Integrationsenzyme freizusetzen.

Überführen Sie das Lysat in ein Ultrazentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie mit hoher Geschwindigkeit, um den Zelltrümmern zu pelletieren, und sammeln Sie den Überstand.

Nehmen Sie als Nächstes eine Chromatographiesäule, die mit nickelbeladener Harz gefüllt ist, und equilibrieren Sie sie mit Puffer.

Laden Sie das geklärte Lysat auf die Säule auf.

Proteine mit Histidinen binden schwach an Nickel, während polyhistidinmarkierte Integrase stark bindet.

Spülen Sie mit Puffer, um ungebundene Proteine zu entfernen, und geben Sie dann Elutionspuffer mit linear ansteigender Imidazolkonzentration hinzu.

Imidazol konkurriert mit Histidin um die Nickelformierung und setzt die Integrationsstelle frei.

Sammeln Sie die Fraktionen und überführen Sie Aliquots in Röhrchen mit Lade-Puffer.

Erhitzen, um die Proteine zu denaturieren, und anschließend auf ein Polyacrylamidgel auftragen.

Führen Sie die Elektrophorese durch und analysieren Sie die Proteinbanden.

Identifizieren Sie Fraktionen, die reines Integrase enthalten, ohne kontaminierende Proteine, und vereinen Sie sie, um gereinigtes virales Integrase zu erhalten.

Beginnen Sie damit, einen Pellet aus E. coli, der die Prototyp-Foamy-Virus-Integrase exprimiert, auf Eis aufzutauen. Verwenden Sie ein Ultraschallgerät mit einem 0,5 Zoll durchmessenden Biohorn und einer konisch zulaufenden Mikrospitze mit 0,125 Zoll Durchmesser, um 30 Sekunden bei 30 % Amplitude zu sonifizieren, wobei sich der Probengefäß auf Eis befindet. Nach der Sonifikation überführen Sie die Zellprobe in ein kaltes Ultrazentrifugenröhrchen und zentrifugieren 60 Minuten bei 120.000 × g und vier Grad Celsius.

Nach der Zentrifugation sollte ein deutliches Pellet sichtbar sein, und der Überstand kann eine gelbe Farbe aufweisen. Überführen Sie den Überstand in einen kalten 50-Milliliter-Kegelrohr. Richten Sie anschließend die 110 Millimeter lange, fünf Millimeter durchmessende FPLC-Säule mit 1,5 Milliliter nickelbeladener Harzmasse ein.

Verbinden Sie zunächst die Säule mit dem FPLC-Gerät und leiten Sie Puffer zu. Das Gerät sollte Echtzeitdaten zur Leitfähigkeit und zur UV-Absorption bei 280 Nanometern aufzeichnen. Die Leitfähigkeits- und UV-Messwerte sollten sich stabilisieren.

Falls erforderlich, lassen Sie weiterhin Puffer durch die Säule fließen, bis die Messwerte stabil sind. Laden Sie die Proteinprobe mithilfe einer Superloop auf die Säule mit einer Flussrate von 0,15 Milliliter pro Minute und einer maximalen Druckbegrenzung von 0,5 Megapascal. Befestigen Sie die Superloop am AKTA FPLC.

Nach dem Waschen der Säule und der Elution der Proteine entnehmen Sie 15-Mikroliter-Aliquote des anfänglichen Durchflusses, des Waschschritts und der Peak-Fraktionen bei 280 Nanometer Absorption und geben jeweils 15 Mikroliter 2X SDS-PAGE-Probelösungspuffer zu jeder Probe hinzu. Erhitzen Sie die Proben drei Minuten lang zum Kochen. Geben Sie jeweils 10 Mikroliter jeder Probe zusammen mit vier Mikrolitern vorgefärbter Proteinstandards auf 10 %ige SDS-PAGE-Gele.

Überprüfen Sie das Gel visuell, um Fraktionen zu identifizieren, die nahezu reines Integrase des prototypischen Schäumungsvirus enthalten. Kombinieren Sie diese Fraktionen und notieren Sie das Volumen während des Pipettierens. Dies sind typischerweise acht bis zehn Milliliter.