Reinigung der viralen Integrase mittels Heparin-Affinitätschromatographie

Beginnen Sie mit einer gereinigten Fraktion des viralen Integrase-Enzyms, die restliche bakterielle Nuklease als Verunreinigung enthält.

Laden Sie die Probe auf eine Heparin-Sepharose-Säule, die zuvor mit einem Puffer mit niedrigem Salzgehalt zum Binden vorgereinigt wurde.

Während die Mischung durch die Säule fließt, bindet die Integrise stärker an den Heparin-Liganden als die kontaminierende Nuklease.

Als Nächstes erhöhen Sie schrittweise die Salzkonzentration im Puffer, der durch die Säule fließt.

Bei niedrigen Salzkonzentrationen eluieren schwach gebundene Nukleasen zuerst, während stark gebundene Integrases bei höheren Salzkonzentrationen später eluieren.

Sammeln Sie die eluierten Fraktionen einzeln, um die kontaminierende Nuklease vom Integrationsenzym zu trennen.

SDS-PAGE-Puffer zu jeder Fraktion hinzufügen und erhitzen, um die Proteine zu denaturieren. Die Proben auf ein SDS-PAGE-Gel laden und eine elektrophoretische Trennung durchführen.

Das angefärbte Gel beobachten.

Identifizieren Sie die Fraktionen, die ein ausgeprägtes Integraseband ohne sichtbare kontaminierende Proteine enthalten, was auf eine offensichtliche Reinheit hinweist.

Um eine Fraktionierung des Prototyp-Foamy-Virus-I