Erzeugung von rekombinanten Lentiviren in Säugetierzellen

Beginnen Sie mit einer Kultur von Säugetierzellen in einem Medium mit geringem Serumanteil.

Fügen Sie den DNA-Lipid-Komplex den Zellen hinzu.

Der Komplex enthält lentivirale Verpackungsplasmide und ein Expressionsplasmid, das das Gen von Interesse kodiert.

Inkubieren, um den zellulären Eintritt des Komplexes zu ermöglichen.

Ersetzen Sie das Medium, um das restliche Transfektionsreagenz zu entfernen, und inkubieren Sie die Zellen.

Innerhalb der Zelle gelangen die Plasmid-DNAs in den Zellkern und leiten die Synthese von viraler RNA an, die das Gen von Interesse sowie virale Komponenten wie Kapsid- und Hüllproteine, Reverse Transkriptase und Integrase trägt.

Diese Komponenten assemblieren zu rekombinanten lentiviralen Partikeln, die von der Wirtsmembran abknospen.

Sammeln Sie das Medium, das die freigesetzten viralen Partikel enthält.

Zentrifugieren Sie, um Zelltrümmer zu pelletieren, und filtrieren Sie das virale Überstand, um verbleibende Kontaminationen zu entfernen.

Zentrifugieren Sie mit hoher Geschwindigkeit, um intakte virale Partikel zu pelletieren.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das virale Pellet in einem kleinen Volumen frischem Medium.

Speichern Sie das konzentrier