Visualisierung der transkriptionellen Supprimierung in virusinfizierten Zellen

Beginnen Sie mit Deckgläsern, die Säugetierzellen enthalten, die zuvor mit einem Uridin-Analogon behandelt wurden, wobei eine Gruppe mit dem Virus infiziert ist und die andere nicht infiziert ist.

In virusinfizierten Zellen binden virale Proteine an die Wirtstranskriptionsmaschinerie und hemmen die RNA-Produktion des Wirts, während bei nicht infizierten Zellen die RNA-Synthese ununterbrochen bleibt.

Spülen Sie mit einem Puffer. Geben Sie Paraformaldehyd hinzu, um die Zellen zu fixieren, und spülen Sie anschließend. Geben Sie ein Detergens hinzu, um die Zellmembranen permeabilisieren, und spülen Sie danach erneut.

Überführen Sie die Deckgläser in eine feuchte Kammer.

Fügen Sie die Click-Färbungslösung, die fluoreszierendes Azid, einen Katalysator und ein Reduktionsmittel enthält, hinzu und inkubieren Sie dann im Dunkeln.

Das Reduktionsmittel aktiviert den Katalysator, wodurch das fluoreszierende Azid an die mit Uridin markierte neu synthetisierte RNA binden kann.

Spülen Sie die Deckgläser in Puffer, tauchen Sie sie in Wasser und entfernen Sie überschüssige Feuchtigkeit.

Unter Verwendung eines Antifade-Einbettmediums die Deckgläser auf einen Objektträger aufbringen und an der Luft trocknen