Generierung eines GFP-markierten rekombinanten Respiratorischen Synzytial-Virus unter Verwendung eines T7-Expressionssystems

Beginnen Sie mit einer Plasmidmischung, die Hilfsplasmide enthält, die für RSV-Replikations- und Transkriptionsproteine kodieren, sowie ein separates Plasmid, das eine vollständige, GFP-exprimierende RSV-Antigenom-cDNA trägt.

Jedes Plasmid steht unter Kontrolle eines T7-Promotors.

Fügen Sie ein liposomales Transfektionsreagenz hinzu und inkubieren Sie, um die Komplexbildung zu ermöglichen.

Führen Sie diese Komplexe in genetisch veränderte Hamsternierenzellen ein, die T7-RNA-Polymerase exprimieren, und inkubieren Sie sie.

Die Plasmidkomplexe gelangen in die Zellen, wo die T7-RNA-Polymerase die RSV-Plasmide transkribiert.

Dies erzeugt virale mRNA-Moleküle, die Replikations- und Transkriptionsproteine kodieren, und erzeugt positiv-sinnige RSV-antigenomische RNA.

Unter Verwendung der Wirtszellmaschinerie produzieren diese mRNAs virale Replikations- und Transkriptionsproteine, die einen funktionalen RSV-Polymerase-Komplex bilden.

Der RSV-Polymerasekomplex wandelt anschließend die RNA mit positiver Polarität in virale genomische RNA um.

Diese genomische RNA leitet die Synthese viraler mRNA-Moleküle an, die für strukturelle Proteine und GFP kodieren.

Unter einem Fluoreszenzmikroskop bestätigt grün