Bestimmung der viralen Replikationskapazität mittels eines radioaktiv markierten Reverse-Transkriptase-Assays

Entnehmen Sie Kulturüberstände, die Nachkommaviren enthalten, die von Wirtszellen freigesetzt wurden, die entweder mit einer Testvariante von HIV-1 oder mit einer Wildtyp-Kontrolle infiziert wurden.

Das Testvirus trägt eine Genvariante, die die Replikationseffizienz verändert und die Produktion von Nachkommenvirionen beeinflusst.

Fügen Sie die Überstände einer Reverse-Transkriptionsmischung hinzu, die ein radioaktiv markiertes Nukleotid, ein nicht markiertes Nukleotid, eine RNA-Vorlage, einen Primer, Cofaktoren, ein Detergens und Stabilisatoren enthält.

Inkubieren, um die Bildung des Template-Primer-Komplexes zu ermöglichen, während das Detergens Virionen lysiert und die Reverse Transkriptase (RT) freisetzt.

RT synthetisiert DNA aus dem Template-Primer-Komplex unter Einbau des radioaktiv markierten Nukleotids.

Überführen Sie die Proben auf eine Nukleinsäure-bindende Membran und trocknen Sie sie an der Luft, um die radioaktiv markierte DNA zu immobilisieren.

Mehrfach unter Rühren mit Puffer und Ethanol waschen, um ungebundene Bestandteile zu entfernen.

Trocknen Sie die Membran luftdicht und wickeln Sie sie ein. Belichten Sie sie auf einem strahlungsempfindlichen Screen und detektieren Sie