JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Mikrobiologie
0 Aufrufe • 3:55 Min. • September 30th, 2026
Nehmen Sie eine Kultur menschlicher Krebszellen, die ein endogenes Zielprotein exprimieren, und entfernen Sie das Medium.
Nehmen Sie eine Suspension eines rekombinanten Adenovirus, das ein Gen trägt, welches das mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte Zielprotein kodiert.
Geben Sie eine kleine Menge der viralen Suspension zu den Zellen, um einen engen Kontakt zwischen dem Virus und der Zelloberfläche sicherzustellen.
Inkubieren Sie gelegentlich unter Schütteln, um die virale Anheftung zu ermöglichen.
Fügen Sie zusätzliches Medium zur Kultur hinzu.
Führen Sie anschließend einen siRNA–Calciumphosphat-Komplex ein, um die mRNA des endogenen Zielproteins gezielt anzusteuern, und inkubieren Sie die Probe.
Das Calciumphosphat verbessert die Aufnahme des siRNA, und das siRNA wird in das RISC geladen.
Der siRNA–RISC-Komplex bindet anschließend an die Ziel-mRNA und spaltet diese, wodurch die Proteinsynthese gehemmt wird.
Gleichzeitig dringt das Adenovirus in die Zelle ein und setzt seine DNA frei, die die Expression des mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Zielproteins steuert.
Dies ermöglicht die Depletion des endogenen Zielproteins und gleichzeitige Ersetzung durch das mit einem Fluorophor ma
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