Name: In-vitro-Bildung von Biofilmen in einem 8-well Chamber Slide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-20T18:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Lernen Sie die In-vitro-Bildung von Bakterien-Biofilmen in einem 8-well Chamber Slide für mikrobiologische Forschung. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Biofilm-Morphologie mittels konfokaler Mikroskopie.

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Die Arbeit wurde von NIDCD / NIH R01DC003915 zu LO Bakaletz finanziert.

1. In-vitro-Bildung von Biofilmen <ol><li> Bakterienkolonien (die auf geeigneten Agar über Nacht angebaut worden), wurden in den Medien ausgesetzt, und die OD 490 wurde auf 0,65 eingestellt </li><li> Die daraus resultierende Bakteriensuspension wurde dann 1:6 (1 ml Bakteriensuspension + 5 ml vorgewärmten Medium) und bei 37 ° C mit 5% CO 2 für ca. 3 Stunden, um bis Mitte der log-Phase zu erreichen. </li><li> Verdünnen Sie die Mitte der log-Wachstumsphase Federung 1:2500 mit vorgewärmten Medien und Platz 200 ul der Verdünnung in jedes Well einer 8-well Kammer schieben. </li><li> Bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Nach ca. 16 Stunden, absaugen Medium Ecke jeder Kammer und 200 ul frisch, vorgewärmten Medium - verzichten entlang Wand der Kammer, um nicht Scherkräfte innerhalb der Kammer, die den Biofilm stören könnten zu schaffen. </li><li> Wenn Inkubation länger als 24 Stunden, ändern Medium alle 12 Stunden oder nach Bedarf, um bakterielle Lebensfähigkeit zu erhalten. </li></ol> 2. Visualisierung von Biofilm <ol><li> Absaugen Medium aus jeder Kammer, wie oben beschrieben, und waschen Wohnsitz Biofilm zweimal vorsichtig mit steriler Kochsalzlösung. </li><li> Add 200 ul Baclight Live / Dead Fleck (3 ul Komponente A + 3 ul Komponente B pro ml Kochsalzlösung) in jede Vertiefung und inkubieren bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Schützen Kultur aus Licht von diesem Punkt an. </li><li> Saugen Sie den Fleck und waschen zweimal vorsichtig mit steriler Kochsalzlösung nach wie vor. </li><li> Add 200 ul neutral gepuffertem Formalin in jede Vertiefung und inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf Probe zu beheben. </li><li> Entfernen Fixativ und ordnungsgemäß entsorgen gemäß den Richtlinien des Instituts. </li><li> Zweimal waschen mit Kochsalzlösung und entsorgen Sie die Waschflüssigkeiten, dass Formalin wie oben enthalten. </li><li> Entfernen Sie die Kunststoff-Brunnen aus der Folie mit ausreichend Kochsalzlösung in jede Vertiefung, so dass bei einem Deckglas auf die Dichtung gelegt wird, keine Luftblasen vorhanden sind. </li><li> Deckglas und die Ränder des Deckglases mit Eindeckmedium. Nagellack kann verwendet werden, um die Folien Siegel jedoch die Folien werden nicht als dauerhaft sein werden. </li><li> Lassen Sie die Versiegelung für ca. 1 Stunde trocknen, bevor über-Mikroskopie untersucht. </li></ol> 3. Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2481/2481fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Representative 3D zusammengesetzte Bilder eines Biofilms in einem 8-well Kammer schieben gebildet. Die Bakterien wurden mit Live / Dead Fleck wobei lebende Bakterien bezeichnet fluoreszieren grün und tote Bakterien leuchten rot. (A) Zusammengesetztes Bild der gesamten Biofilm zeigt eine besondere Architektur mit Türmen und Wasserkanälen. (B) Gleiche Biofilm als in (A), jetzt im Querschnitt gesehen.

<ol><li>Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms+in+otitis+media%3A+evidence+and+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Infect+Dis+J%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms in otitis media: evidence and relevance.</a> Pediatr Infect Dis J. 26, Suppl 10. S17-S19 (2007).</li>
<li>Heydorn, A., Nielsen, A. T., Hentzer, M., Sternberg, C., Givskov, M., Ersboll, B. K., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).</li>
</ol>

Das Verständnis der Mechanismen, durch die Biofilme bilden, sowie die Charakterisierung ihrer Matrix-Komponenten, ist ein Gebiet von großem Interesse. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um zu identifizieren Proteine ​​oder andere Bestandteile, um die strukturelle Integrität des Biofilms sowie die Identifizierung und Target-Proteine, die sich auf eine therapeutische Anwendung kann zu verleihen beizutragen. Die Inkubationszeiten und Verdünnungen in der oben beschriebenen Protokoll sind für eine optimale Bildung von Biofilmen durch nontypeable Haemophilus influenzae (NTHI) gegründet. Einige Vorarbeiten erforderlich sein, um diese Schritte für andere Bakterienarten zu optimieren (dh erste Verdünnung und Inkubationszeit benötigt bis Mitte der log-Phase Wachstum zu erzielen). Die 1:2500 Verdünnung für die erste Aussaat der Kammern wurde gegründet, um sicherzustellen, dass eine robuste Biofilm würde in der Kammer gleitet wie durch diesen Organismus induziert und innerhalb der Inkubationszeiten angegeben entwickeln, ohne den Biofilm überwuchern die Kammer und / oder anstrengende verfügbaren Nährstoffe . Dementsprechend kann die anfängliche Verdünnung und oder Inkubationszeiten müssen für andere Bakterienarten eingestellt werden.

<table><tbody><tr><td>Schokolade-II-Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>B21267X</td><td></td></tr><tr><td>8-Well-Kammernobjektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-656-18</td><td></td></tr><tr><td>BacLight Live/Dead Bakterienvitalitätskit</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9439023</td><td></td></tr><tr><td>BHI</td><td>Fisher Scientific</td><td>211059</td><td></td></tr><tr><td>Hämin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5533</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7004</td><td></td></tr><tr><td>Permaslip-Einbettmedium</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9693613</td><td></td></tr></tbody></table>

in-vitro-bildung von biofilmen in einem 8-well chamber slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

Die chronische Charakter vieler Erkrankungen ist die Bildung von bakteriellen Biofilmen, die widerspenstigen zu herkömmlichen Antibiotika-Therapie zugeschrieben werden. Biofilme sind Gemeinde-assoziierten Bakterien an der Oberfläche und eingehüllt in eine Matrix. Die Rolle der extrazellulären Matrix ist vielfältig, einschließlich der Förderung der Nährstoff-Akquisition und bietet erheblichen Schutz gegen Umwelteinflüsse (z. B. Host-Immunantwort). In dem Bemühen um ein besseres Verständnis darüber, wie die Bakterien in einem Biofilm auf Belastungen der Umwelt haben wir ein Protokoll verwendet haben, worin wir bakterielle Biofilme, die in einem 8-well Kammer schieben gebildet haben visualisieren reagieren zu erwerben. Die Biofilme wurden mit dem Baclight Live / Dead Fleck gefärbt und mit einem konfokalen Mikroskop, um die relative Biofilm Größe und Struktur unter verschiedenen Inkubationsbedingungen zu charakterisieren. Z-Stapel-Aufnahmen wurden durch konfokale Mikroskopie gesammelt und analysiert COMSTAT. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um den Mechanismus und die Kinetik durch die Biofilme zu bilden, zu identifizieren sowie Komponenten, die wichtig für Biofilm-Struktur und Stabilität sind.

Dieser Artikel beschreibt das Verfahren für die Bildung und Visualisierung eines bakteriellen Biofilms in einem 8-well Kammer schieben gewachsen

In-vitro-Bildung von Biofilmen in einem 8-well Chamber Slide

Die chronische Natur vieler Erkrankungen wird auf die Bildung bakterieller Biofilme zurückgeführt, die gegenüber einer traditionellen Antibiotikatherapie resistent sind. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, bakterielle Biofilme in den Vertiefungen eines Kammerobjektträgers anzuzüchten. Jede Vertiefung wird zunächst mit Bakterien in einem Nährmedium beimpft und anschließend bei 37 Grad Celsius kultiviert. Sobald die Biofilme gebildet sind, werden die Zellen mit einem Vitalfarbstoff angefärbt.Die Biofilme werden anschließend gewaschen und fixiert, und die Vertiefungen mit einem Deckglas versiegelt. Abschließend können die Zellen mittels konfokaler Mikroskopie untersucht und die Morphologie verschiedener Biofilme charakterisiert werden. Ein Vorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie Durchflusskammern besteht darin, dass die Volumina deutlich geringer sind und somit die Menge an experimentellen Verbindungen, die verwendet wird, reduziert wird.Außerdem können in einer 8-Well-Kammerplatte mehr Variablen gleichzeitig verglichen werden als in einer 3-Kammer-Flusszelle. Diese Methode könnte helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Mikrobiologie zu beantworten, beispielsweise zur Kinetik der Biofilmbildung. Sie kann zudem Einblicke in mehrere Erkrankungen liefern, die einen Biofilmbestandteil aufweisen, wie beispielsweise chronische Otitis media, zystische Fibrose und chronische Blaseninfektionen, um nur einige zu nennen.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da es zahlreiche Schritte gibt, in denen der vorhandene Biofilm künstlich gestört werden kann. Daher ist eine visuelle Demonstration dieser Methode entscheidend, da die Schritte zum Entfernen und Hinzufügen von Flüssigkeit schwer zu erlernen sind und die Gefahr, den Biofilm durch Scherkräfte zu stören, an diesen Stellen des Protokolls am größten ist. Die Durchführung des Verfahrens demonstriert heute Liz, eine Doktorandin aus dem Labor. Inokulieren Sie Bakterien in flüssigem Kulturmedium und inkubieren Sie die Kultur, bis sie die mittlere log-Phase erreicht hat. Verdünnen Sie die Suspension der mittleren log-Phase im Verhältnis 1 zu 2.500 in vorgewärmtem Medium für nontypisierbares Haemophilus influenzae, das in diesem Beispiel verwendet wird.Dies ergibt 40.000 koloniebildende Einheiten pro Milliliter als Ausgangskonzentration. Überführen Sie 200 Mikroliter der verdünnten Kultur aseptisch in jedes Loch einer sterilen 8-Loch-Kammerobjektträgers. Inkubieren Sie den Objektträger bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator mit 5 % Kohlendioxid, um den Bakterien 16 bis 18 Stunden lang die Bildung von Biofilmen zu ermöglichen.Entfernen Sie die Kammer von dem Inkubator und aspirieren Sie das Medium aus der Ecke jeder Kammer. Ersetzen Sie es anschließend durch 200 Mikroliter frisches, vorgewärmtes Medium. Achten Sie darauf, das neue Medium entlang der Wand der Kammern zuzugeben, um die Biofilme nicht zu stören.Bringen Sie den Objektträger zurück in den Inkubator und lassen Sie die Kulturen bis zur gewünschten Dichte wachsen. Ersetzen Sie das Medium alle acht bis 16 Stunden, um die Lebensfähigkeit der Bakterien aufrechtzuerhalten. Um die Biofilme sichtbar zu machen, entfernen Sie zunächst die Kulturüberstände wie zuvor beschrieben und waschen die Biofilme vorsichtig zweimal mit 200 µL steriler Kochsalzlösung.Nachdem die Biofilme gewaschen wurden, 200 Mikroliter Live-Dead-Färbung mit Hintergrundbeleuchtung in jede Vertiefung eines acht-Vertiefungen-Kammerrutschs geben. Insgesamt zwei Milliliter der Färbelösung ansetzen. Den Objektträger 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.Ab diesem Schritt sicherstellen, dass der Objektträger vor Licht geschützt wird. Den Objektträger 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Färbung der Zellen die Lebend-Tot-Färbung entfernen und jede Vertiefung zweimal mit Salzlösung waschen.Wie zuvor gezeigt, 200 Mikroliter neutral gepuffertes Formalin zu jedem Brunnen hinzufügen und den Objektträger mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die Probe zu fixieren. Nach dieser Inkubation das Fixiermittel entfernen und entsorgen und die Biofilme zweimal mit Kochsalzlösung waschen. Die Kunststoffbrunnen vom Objektträger nehmen und etwa 150 Mikroliter Kochsalzlösung zu jedem hinzufügen. Die Brunnen abdecken, indem ein Deckglas auf die Dichtung gelegt wird, wobei sichergestellt werden muss, dass keine Blasen entstehen, und die Ränder des Deckglases mit Einbettmedium versiegeln.Alternativ kann Nagellack verwendet werden, um die Deckglasabdeckung abzudichten. In diesem Beispiel verwenden wir Nagellack. Um die Verfahrensschritte besser veranschaulichen zu können, sollte man dem Dichtmittel mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur zum Trocknen lassen, bevor man die Biofilme unter dem Mikroskop untersucht. Diese Aufnahme ist eine dreidimensionale Rekonstruktion von Zack-Bildern eines lebend-tot-gefärbten H. influenzae-Biofilms, die mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen wurden.Der hier gezeigte Biofilm ist ein Beispiel für einen Biofilm, der von NTHI nach 24-stündigem Wachstum in der Kammerplatte gebildet wurde. Mithilfe dieser Technik waren die Bakterien zum Zeitpunkt der Fixierung lebensfähig, wie die grüne Fluoreszenz und das Fehlen roter Fluoreszenz zeigen. Die Architektur des Biofilms ist deutlich erkennbar, mit zahlreichen Türmen innerhalb der Biofilmstruktur und vielen Wasserkanälen. Die Seitenansicht in Panel B zeigt die relative Höhe des Biofilms, der zu diesem Zeitpunkt gebildet wurde. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Flüssigkeiten langsam in die Vertiefung hinzuzufügen und wieder zu entfernen, um die Entstehung von Scherkräften zu minimieren, die den im Brunnen vorhandenen Biofilm stören könnten. Indem dieses Verfahren befolgt wird, können weitere Methoden wie Immunfärbungen für spezifische Proteine von Interesse oder die Markierung mit Lektinen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der biochemischen Bestandteile innerhalb der von den Bakterien im Biofilm gebildeten Matrix zu beantworten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Acht-Well-Kammernrutsche verwendet, um die Bildung bakterieller Biofilme zu untersuchen.

in-vitro-biofilm-formation-in-an-8-well-chamber-slide

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Der Test beschreibt ein schnelles Mittel zur frühen Bildung von Biofilmen in Bakterien und Pilzen zu messen. Diese Methode verwendet eine Mikrotiterplatte als Substrat für die mikrobielle Bildung von Biofilmen und der Biofilm wird visualisiert Kristallviolett Belastung. Der Test liefert entweder eine qualitative oder quantitative Assay für die frühe Bildung von Biofilmen.

Mikrotiterschale Biofilmbildung Assay

Quelle: Beaudoin, T., et al. Visualisierung der Auswirkungen von Sputum auf die Biofilmentwicklung mit einem Kammer-Coverglass-Modell. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video demonstriert die Verwendung eines kammerbasierten Deckglases zur Untersuchung der Auswirkungen von Patienten durch Mukoviszidose abgeleiteten Spötterwirtsfaktoren auf die Entwicklung bakterieller Biofilme.

Eine Kammerabdeckungsglas-Methode zur In-vitro-Bakterienbiofilmbildung

In diesem Video demonstrieren wir die Herstellung von in vitro Biofilm durch S. aureus in einer Poly-L-Lysin-beschichteten Multiwell-Platte. Die biofilmförmige Platte kann für nachgelagerte Experimente verwendet werden.

In vitro Biofilmsynthese durch Staphylococcus aureus

Das Video zeigt einen Festphasen-Adhärenz-Assay zur Beurteilung der Biofilmbildung. In einer Multi-Well-Platte haften Bakterien in mit Gallensalz angereicherten Medien an festen Oberflächen und bilden Biofilme, was durch Kolorimetrie durch Kristallviolettfärbung und Ethanolbehandlung bestätigt wird.

Ein Festphasen-Adhärenz-Assay zur Beurteilung der Biofilmbildung

Das Ziel dieser Verfahren ist es, die Papier Verwendung eines mikrofluidischen Systems für die Entwicklung von Mehrarten Biofilmen, die typischerweise bei humanen supragingivale Plaque identifiziert Arten enthalten beschreiben. Methoden, um die Biofilmarchitektur Biofilm Lebensfähigkeit und ein Konzept für die Ernte Biofilm für kulturabhängig oder kulturunabhängige Analysen hervorgehoben zu beschreiben.

Verwendung eines Hochdurchsatz-<em&gt; In-vitro-</em&gt; Mikrofluidik-System auf die mündliche Multi-Spezies-Biofilme entwickeln

Diese Studie präsentiert die Entwicklung reproduzierbarer Methoden zur Untersuchung von Biofilm-Inhibitoren und deren Auswirkungen auf die Bacillus subtilis-Vielzelligkeit.

Methodologien für das Studium<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilme als Modell für kleine Molekül-Inhibitoren Biofilm Charakterisieren

Dieses Protokoll beschreibt die Visualisierung der Biofilmentwicklung nach Exposition gegenüber Wirtsfaktoren unter Verwendung eines Objektträgerkammermodells. Dieses Modell ermöglicht die direkte Visualisierung der Biofilmentwicklung sowie die Analyse von Biofilmparametern mit Hilfe von Computersoftwareprogrammen.

Visualisierung der Auswirkungen von Sputum auf Biofilm-Entwicklung eines Modells mit Kammerdeckgläser

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines Geräts anpassbare automatisierte mikrofluidischen Biofilmbildung in Candida Albicans unter physiologischen Bedingungen Host zu visualisieren.

Visualisierung der Biofilmbildung in Candida Albicans ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät

Dieses Protokoll stellt die Methodik zur Durchführung von Biofilmwachstums- und Biomassemessungen unter Verwendung von selbstmontierten Tiefbrunnen-PCR-Plattengeräten für ein statisches Biofilm-Screening mit 96-Well-Deckel mit hohem Durchsatz vor.

Erzeugung größerer bakterieller Biofilm-Biomasse mit PCR-Plate Deep Well Microplate Devices

Dieses Protokoll liefert einen modularen BSL-2-Workflow, der Kristall-Violett-Biomasse-Assays, Zeitraffer-Phasenkontrastkinetik, konfokale 3D/Matrix-Kartierung, SEM-Ultrastruktur und ein Modul zur Hamsterinfektion in vivo kombiniert, um die funktionelle Rolle des Leptospira-Biofilms zu kultivieren, quantifizieren, charakterisieren und untersuchen und so eine standardisierte Bewertung von Mutanten und Anti-Biofilm-Interventionen in Laboren ermöglicht.

Ein modularer Arbeitsablauf für quantitative, strukturelle und funktionale Analyse von Leptospira-Biofilmen

Lernen Sie die In-vitro-Bildung von Bakterien-Biofilmen in einem 8-well Chamber Slide für mikrobiologische Forschung. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Biofilm-Morphologie mittels konfokaler Mikroskopie.

In-vitro-Bildung von Biofilmen in einem 8-well Chamber Slide

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