C. elegans Positive Butanone Learning, kurzfristige und langfristige Assoziative Speicher Assays

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, das Kurz- und Langzeitgedächtnis einer erlernten positiven Assoziation zwischen Nahrung und dem Chemotaktik-Attraktans Butan bei C. elegans als Modellorganismus zu testen. Dies wird erreicht, indem zunächst synchronisierte, gut genährte junge adulte Würmer eine Stunde lang hungern.

Anschließend werden die Würmer in Gegenwart von Nahrung und Butanon trainiert, wobei eine Massenpräsentation für die kurzzeitige assoziative Erinnerung und eine gestaffelte Präsentation für die langzeitige assoziative Erinnerung verwendet wird. Nach der Konditionierung wird die Chemotaxis gegenüber Butanon gemessen und mit der naiven Chemotaxis verglichen. Um die Gedächtnisspeicherung zu untersuchen, werden Ergebnisse erhalten, die die Dauer der kurz- und langzeitigen assoziativen Erinnerung an die gelernte Assoziation zwischen Nahrung und Butanon auf der Grundlage von Veränderungen im Lernindex zeigen.

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen aus den Bereichen kognitives Altern und Erkrankungen beantworten, beispielsweise, welche genetischen Signalwege für die neuronale Funktion während des normalen Alterns und bei neurodegenerativen Erkrankungen erforderlich sind, und wie Lernen und Gedächtnis verbessert werden können. Unter Bedingungen kognitiver Beeinträchtigung werden Würmer mit Standardmethoden auf 100 Millimeter hohen Nähragarplatten vorbereitet, die mit einem Milliliter OP50 E. coli bestückt sind. Verwenden Sie junge adulte Tiere mit einer Dichte von etwa 5.000 Würmern oder weniger pro Platte.

Sammeln Sie die Würmer, indem Sie vorsichtig M-neun-Puffer auf die Platte gießen und die Würmer durch Schwenken lösen. Versuchen Sie, die Bewegung zu minimieren, da diese unerwünschte Bakterien lösen könnte. Neigen Sie anschließend die Platte und entnehmen Sie die Puffer-Wurm-Mischung aus der Ecke.

Unter Verwendung einer P-1000-Pipette die Würmer in ein 15-Milliliter-Konischglas überführen. Dabei darauf achten, die Würmer nicht gegen die Wandung zu pipettieren, falls Würmer auf der Platte verbleiben.

Wiederholen Sie diesen Schritt ein- bis zweimal. Lassen Sie die Würmer durch Schwerkraft auf den Boden des Gefäßes absinken. Eine Zentrifugation wird nicht empfohlen, um optimale Ergebnisse zu erzielen.

Nach dem Absitzen entfernen Sie das Überstandmedium durch Vakuum und waschen mit mindestens drei bis vier Milliliter M-neun-Puffer. Arbeiten Sie schnell, um einer Nährstoffverarmung vorzubeugen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei Mal, sodass insgesamt drei Waschschritte durchgeführt werden.

Zu diesem Zeitpunkt kann eine Gruppe von Würmern beiseitegestellt werden, um als naive Gruppe in den später demonstrierten Chemotaxis-Assays zu dienen. Fügen Sie drei bis vier Milliliter M9-Puffer zu dem Röhrchen hinzu und lassen Sie die Würmer eine Stunde lang bei Raumtemperatur hungern. Bereiten Sie die Konditionierungsplatten vor, indem Sie zwei Mikroliter 10 % Butan in 95 % Ethanol auf die Innenseite der Deckel von 60-Millimeter-NGM-Platten aufstreichen, die zuvor mit 500 Mikrolitern OP50 E. coli beimpft wurden. Entfernen Sie den Überstand von dem Röhrchen mit den hungrigen Würmern und verwenden Sie eine P1000-Pipette, um 100 bis 200 Mikroliter Würmer auf jede Konditionierungsplatte zu übertragen. Inkubieren Sie die Konditionierungsplatten nach der Konditionierung eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Spülen Sie die Würmer mit etwa einem Milliliter M-neun-Puffer von den Platten ab und überführen Sie sie in ein 15-Milliliter-Konischglas. Wiederholen Sie die zuvor gezeigten schonenden Waschmethoden, bis der Puffer klar erscheint. Nach dem Waschen kann eine Teilmenge der Würmer entnommen und im Chemotaxis-Assay getestet werden, um die Zeit-Null-Gruppe für das einmalige assoziative Lernen darzustellen, um Platten für zusätzliche Zeitpunkte vorzubereiten.

Überführen Sie 100 bis 200 Mikroliter Würmer auf besiedelte 60 Millimeter NGM-Platten. Inkubieren Sie diese nach der Behandlung für 0,51 oder zwei Stunden bei Raumtemperatur. Nach jedem Zeitpunkt waschen Sie die Würmer vorsichtig von den Platten in ein 15-Milliliter-Konischgefäß und ein- bis zweimal mehr.

Mit M9-Puffer und unter Anwendung der gleichen schonenden Waschverfahren wird das kurzzeitige assoziative Gedächtnis mithilfe des Chemotaxis-Assays getestet, der später demonstriert wird. Bereiten Sie die Konditionierungsplatten und die Würmer wie für das Kurzzeit-Training gezeigt vor, lassen Sie die Würmer jedoch nur 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Sammeln Sie die Würmer nach der Inkubation, wie zuvor gezeigt.

Überführen Sie sie in NICHT BEFRACHTETE 60-Millimeter-NGM-Platten. Inkubieren Sie die Würmer 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf den unbeimpften Platten. Nach der Hungerphase waschen Sie die Würmer mit M-Neun-Puffer und geben sie zurück in das 15-Milliliter-Konischglas. Wiederholen Sie diese Schritte, bis insgesamt sieben Konditionierungsblöcke und sechs Hungerblöcke abgeschlossen sind.

Wenn die Konditionierung abgeschlossen ist, spülen Sie die Würmer von den Konditionierungsplatten zurück in ein kegelförmiges Reagenzglas. Wie zuvor gezeigt, kann eine Wurmgruppe verwendet werden, um unmittelbar nach der Konditionierung die assoziative Lernfähigkeit über sieben zeitlich verteilte Trainingsdurchgänge zu testen. Überführen Sie die verbleibende Wurmpopulation auf 100 Millimeter HGM-Platten, die mit einem Milliliter OP50 beimpft sind.

Erneut 100 bis 200 Mikroliter Würmer pro Platte auftragen, um sicherzustellen, dass ausreichend Bakterien vorhanden sind, um die Population zu ernähren. Inkubieren Sie die Platten nach der Konditionierung bei 20 Grad Celsius für 1624 oder 40 Stunden, was den Zeitpunkten für langanhaltendes assoziatives Gedächtnis entspricht, um das langanhaltende assoziative Gedächtnis für die Nahrung Butan-Kennung zu testen. Spülen Sie die Würmer vorsichtig von den Platten in ein 15-Milliliter-Konischgefäß und waschen Sie sie erneut ein- bis zweimal mit M-Neun-Puffer nach jedem Zeitpunkt, bevor Sie die Würmer im Chemo-Texas-Assay testen.

Um die Chemotaxis-Testplatten vorzubereiten, markieren Sie die Unterseite unbesetzter 100-Millimeter-NGM-Platten an drei Stellen nahe dem Rand wie hier gezeigt. Geben Sie je einen Mikroliter einer einmolaren Natriumazid-Lösung auf die Stellen für das Duftstoffsignal und die Kontrolle. Führen Sie dies nicht mehr als 15 Minuten vor Beginn des Assays durch, um die Diffusion der lähmenden Substanzen zu minimieren.

Nächster Fleck: jeweils einen Mikroliter 95 % Ethanol und 10 % Butanon auf die entsprechenden Stellen der markierten Testplatte auftragen. Daraufhin das zuvor aufgetragene Natriumazid bedecken. So viel wie möglich von dem M9-Puffer aus dem Röhrchen mit den gesetzten Würmern entfernen.

Verwenden Sie eine P-20-Pipette mit einem vorgeschnittenen Spitzenende, um 15 Mikroliter Würmer in drei Intervallen zu je fünf Mikrolitern am Ursprung der Testplatte abzugeben. Danach drehen Sie die Ecke eines Kim-Tuchs zu einer kleinen Spitze zusammen und verwenden Sie diese, um den überschüssigen M-9-Puffer vorsichtig abzutupfen, wobei Sie darauf achten, das Agar nicht zu verletzen.

Das Entfernen des überschüssigen Puffers setzt die Würmer auf die Testplatte frei. Falls eine Bildgebung zur Zählung der Würmer verwendet wird, liefert ein Bild des Ursprungs unmittelbar nach dieser Freisetzung die Gesamtanzahl der Tiere pro Testplatte. Inkubieren Sie die Chemotaxis-Testplatte eine Stunde bei Raumtemperatur nach der Inkubation und zählen Sie die Anzahl der Würmer am Ursprung sowie an den Ethanol- und Butanon-Stellen, sowie die Gesamtanzahl der Würmer auf der Testplatte.

Im Allgemeinen befinden sich durch Natriumazid paralysierte Würmer innerhalb eines Radius von einem Zentimeter um die Flecken und erscheinen steif und gerade. Bei vielen übereinanderliegenden Tieren können die Würmer manuell gezählt oder mithilfe von Bildgebungs- und Analyse-Software quantifiziert werden. Wir bevorzugen letzteres aufgrund der einfacheren Handhabung und Zuverlässigkeit der Ergebnisse.

Nachdem die Würmer an den Ausgangspunkten der Ethanol- und Butanon-Flecken quantifiziert wurden, berechnen Sie den KeyAx-Index wie hier gezeigt. Der typische naive Chemotaxis-Index für Wildtyp-Würmer, die auf 10 % Butanon reagieren, liegt bei etwa 0,2. Mast- oder getrennt durchgeführtes Training erhöht den Chemotaxis-Index im Allgemeinen auf 0,7 bis 0,8 zum Zeitpunkt null, was einen Lernindex von etwa 0,6 ergibt.

Die naive Chemotaxis ist äußerst empfindlich gegenüber der richtigen Wurmpflege. Diese Abbildung zeigt den deutlichen Unterschied im CI zwischen gut genährten und verhungerten naiven Würmern und unterstreicht die Bedeutung einer korrekten Technik. Die Gedächtnisspeicherung spiegelt sich in der Zeit wider, die benötigt wird, bis der Chemo-Texas-Index bei Wildtyp-Tieren auf naiven Level zurückkehrt, wenn der Lernindex null beträgt.

Das kurzfristige assoziative Gedächtnis beginnt etwa eine Stunde nach einer etwa zwei Stunden dauernden Massentrainingsphase abzunehmen und ist im Vergleich unabhängig vom Transkriptionsfaktor kreb. Das langfristige assoziative Gedächtnis nimmt typischerweise erst 16 Stunden nach einem bis zu 40 Stunden dauernden Raumtraining signifikant ab und ist Creb-abhängig. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass Chemotaxis-Assays durch Hunger oder übermäßige Gerüche in der Umgebung beeinflusst werden können und dass sowohl das Gedächtnis als auch die Würmer durch zu starke physikalische Erschütterung gestört werden können.