Multiple-Maus Neuroanatomische Magnetic Resonance Imaging

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mittels Mehrfach-MRT des Maushirns eine Hochdurchsatz-Phänotypisierung mit lebenden oder fixierten Mäusen durchzuführen. Dazu wird zunächst jede Maus anästhesiert. Danach wird für die in-vivo-Bildgebung jede Maus auf einen passenden Schlitten gelegt, bevor sie in ein Ladearray eingesetzt und in der Bohrung des Magneten positioniert wird.

Oder für die Ex-vivo-Bildgebung eine transkardiale Perfusion durchführen, die Schädelstruktur isolieren und diese in Bildgebungsrohre geben, die anschließend in einem 16-Kanal-Solenoid-Spulenarray positioniert werden, das sich in der Magnetbohrung befindet. Letztendlich können dreidimensionale Magnetresonanztomographie-Volumina erhalten werden, die hochwertige Aufnahmen des Gehirns liefern, die für die Phänotypisierung sowie für große und kleine Strukturen im Mausgehirn geeignet sind. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Histologie besteht darin, dass die grobe Anatomie der Proben erhalten bleibt, solange sie noch im Schädel sind, und dass eine vollständige Abdeckung des Gehirns sowie eine dreidimensionale Analyse ermöglicht wird.

Mithilfe dieser Methode lassen sich zentrale Fragen in den biomedizinischen Wissenschaften beantworten, beispielsweise der Zusammenhang zwischen Genen und anatomischen Unterschieden, die Phänotypen im Mausmodell einer Krankheit darstellen. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Technik sind, die Entwicklung maßgeschneiderter Vorrichtungen zum Beladen von Mäusen und von Hochfrequenzspulenarrays, die für die hochdurchsatzfähige Bildgebung des Gehirns erforderlich sind, als anspruchsvoll empfinden. Bevor mit diesem Protokoll begonnen wird, müssen zunächst alle Genehmigungen für die Massetierhaltung von der zuständigen Tierversuchskommission Ihrer Institution, der lokalen Tierversuchskommission, dem Ausschuss für Tierversuche und Tierschutz oder einer entsprechenden Einrichtung eingeholt werden, sowie grundlegende Verfahren wie die Identifizierung und das Wiegen der Tiere durchgeführt werden.

Die Aufnahmen der Tiere sollten unter einem生物安全柜durchgeführt werden. Danach transferieren Sie die Tiere in einen autoklavierbaren Kunststoffbehälter, um sie zur MRI-Induktionskammer zu transportieren. Betäuben Sie die zu scannenden Tiere in der vorgewärmten Induktionskammer mit 4 % ISO-Fluoran und vier Litern Sauerstoff pro Minute.

Die Tiere sind vollständig anästhesiert, sobald sie nicht mehr auf einen Pfotenquetsch reagieren. Bei Bedarf kann das Fell von der Brust mit einem Enthaarungsmittel wie Nair entfernt werden, um einen besseren Kontakt mit den EKG- und Temperaturüberwachungsgeräten herzustellen, die in den speziell angefertigten Schlitten integriert sind. Außerdem sollten Augentropfen wie künstliche Tränenflüssigkeit auf die Augen aufgetragen werden, um Austrocknung zu verhindern, und etwa 0,3 Milliliter physiologische Kochsalzlösung subkutan injiziert werden.

Um die Tiere zu hydratisieren. Platzieren Sie nun die Mäuse auf individuellen Schlitten mit integrierten EKG-Atmungs- und Temperatursonden. Achten Sie darauf, die vorderen und hinteren Gliedmaßen in die Vertiefungen auf den Schlitten einzusetzen.

Wenn eine EKG-Überwachung erforderlich ist, stellen Sie sicher, dass die haarfreien Bereiche an der Bauchseite der Maus mit den EKG-Sonden ausgerichtet sind. Immobilisieren Sie jedes Tier mit einem Kopfgurt und einem Nasengurt und schieben Sie dann jeden Schlitten in ein offenes 50-Milliliter-Kegelrohr. Bis zu sieben lebende Mäuse können in einer einzigen Bildgebungssequenz für die Untersuchung vorbereitet werden. Bringen Sie anschließend die Kegelrohre auf dem Ladearray an.

Stellen Sie sicher, dass alle physiologischen Überwachungsleitungen angeschlossen sind, sobald alle Tiere geladen sind. Stellen Sie die Isofluran-Konzentration in der Magnetbohrung auf 2 % und die Sauerstoffzufuhr auf acht Liter pro Minute ein. Bringen Sie nun das Lade-Array zum Magnet und positionieren Sie es auf dem Schienensystem.

Verwenden Sie das Schienensystem, um die Ladeeinheit mit dem Mausenest zu koppeln, das dafür konzipiert ist, die Mäuse einheitlich in jede Hochfrequenzspule zu positionieren, die sich in der Mitte der Magnetbohrung befindet. Wenn die Einheit vollständig in den Magnet eingeführt ist, docken die Zentrifugenröhrchen an das Narkose-Zufuhrsystem innerhalb der HF-Spulen an. Wie hier zu sehen, wird ISOF-Fluor in Kombination mit Sauerstoff vom Mausenest über einen Schlauch entlang der Achse jeder einzelnen Spule zum Versuchsobjekt geleitet. Diese Narkosegas-Mischung strömt durch die Röhrchen an den Mäusen vorbei und wird von einer aktiven Absaugvorrichtung aufgefangen, die an der Rückseite der Ladeeinheit befestigt ist.

Abhängig von den physiologischen Werten der Tiere, wie Atmung und Temperatur, sollten die Isofluran- und Fluor-Konzentrationen zwischen 0,9 und 2 % liegen. Führen Sie nun eine Aufnahme der Tiere mittels einer schnellen Bin-Echo-Sequenz durch. Die Dauer jedes dreidimensionalen Scans beträgt etwa drei Stunden bei einer resultierenden Bildauflösung von 125 Mikrometern. Achten Sie darauf, die EKG-Werte, die Atmung und die Temperatur jedes Tieres während des gesamten Scans zu überwachen.

Die Tiere sollten während der Scan-Sitzung außerdem mit einem Strom warmer Luft warmgehalten werden. Sobald der Scan abgeschlossen ist, entfernen Sie das Beladungsarray vom Magnet und platzieren Sie es in eine warme Induktionskammer, die mit 100 % Sauerstoff gefüllt ist. Entladen Sie die Tiere aus den Röhren und überführen Sie sie in verschließbare Kunststoffbehälter, um sie anschließend in einen biologischen Sicherheitswerkbank zu transportieren.

Stellen Sie die Tiere schließlich in einen warmen, zugfreien Käfig und lassen Sie sie sich von der Anästhesie zur ex vivo-Bildgebung am Tier erholen. Betäuben Sie die Tiere zunächst vollständig durch eine intraperitoneale Injektion einer Kombination aus Ketamin und Xylazin. Bevor Sie mit der Perfusion beginnen, überprüfen Sie die chirurgische Anästhesietiefe durch Zehen- oder Pfotenquetschung.

Öffnen Sie die Brusthöhle und führen Sie eine Nadel oder einen Sicherheits-Infusionsset mit Flügel in den linken Ventrikel des Herzens ein. Schneiden Sie dann den rechten Vorhof auf, um die transkardiale Perfusion zu beginnen. Spülen Sie zunächst mit 30 Millilitern phosphatgepufferter Salzlösung (1 x PBS) bei Raumtemperatur, die mit einem Mikroliter Heparin pro Milliliter und zwei Millimolar Pro-Hands gemischt wurde, bei einer Flussrate von etwa 100 Millilitern pro Stunde.

Dies sollte etwa 20 Minuten dauern. Als nächstes eine Fixierung mit 30 Milliliter Raumtemperatur-4%-Paraformaldehyd, gemischt mit zwei Millimolar Pro Händen, bei 100 Milliliter pro Stunde durchführen. Nun das Tier enthaupten und die Haut, den Unterkiefer, die Ohren sowie die knorpelige Nasenspitze entfernen.

Anschließend wird die verbleibende Schädelstruktur in 4 % Paraformaldehyd, gemischt mit zwei Millimolar Pro-Hands, gegeben und über Nacht bei vier Grad Celsius belassen. Am nächsten Tag wird das Präparat in eine Lösung aus 1 x phosphatgepufferter Salzlösung, versetzt mit 0,02 % Natriumazid und zwei Millimolar Pro-Hands, zur Konservierung überführt. Die hochauflösende dreidimensionale MRT-Aufnahme bei sieben Tesla sollte mindestens vier Tage, jedoch nicht länger als zweieinhalb Monate erfolgen.

Nach der Perfusion. Legen Sie die zu bildgebenden Gehirne in eine 16-Kanal-Solenoidspulen-Array-Anordnung und platzieren Sie diese in dem Scanner. Scannen Sie nun die Proben mit einer schnellen Spin-Echo-Sequenz.

Diese Scan-Dauer beträgt ungefähr 12 Stunden, und die endgültigen Bilder weisen eine isotrope Auflösung von 32 Mikrometern auf. Nach Abschluss des Scans entfernen Sie die Proben aus der Bildgebungs-Spule und legen jeden Schädel zur Konservierung repräsentativ für den In-vivo-Zustand in eine 10 %ige Formalinlösung mit zwei Millimolar Pro-Hands. Mehrere Maus-Hirnbilder aus einem dreistündigen Scan sind hier dargestellt.

Diese Abbildung zeigt drei Betrachtungsachsen für jedes der sieben durchgescannten Mäuse. Dargestellt ist hier ein repräsentatives ex vivo Gehirnbild mit 32 Mikrometer isotroper Auflösung. Und hier sehen wir eine 3D-Darstellung eines ex vivo Bildvolumens, sobald dies beherrscht ist.

Diese In-vivo-Technik kann bei korrekter Durchführung innerhalb von drei bis vier Stunden durchgeführt werden. Forscher aus zahlreichen biomedizinischen Bereichen können diese Technik nutzen, um Krankheiten wie Lupus, die Huntington-Krankheit und Alzheimer-Krankheit im Mausmodell zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man lebende und fixierte Versuchstiere alike abbilden kann, um hochwertige Gehirnbilder mittels MRT zu erhalten.

Vielen Dank fürs Zuschauen.