Isolierung von Ribosomen übersetzen enthaltend Peptidyl-tRNAs für funktionelle und strukturelle Analysen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Struktur und Funktion reiner Ribosomen, die eine einzigartige peptidyl-tRNA enthalten, zu analysieren. Dies wird erreicht, indem In-vitro-Translationsassays mit freisetzenden Faktoren depletierten, zellfreien Extrakten und biotinmarkierten mRNA-Molekülen durchgeführt werden, um angehaltene Peptidyl-tRNA-Ribosomen-Komplexe zu erzeugen, die an die biotinmarkierten mRNA-Moleküle gebunden sind. In einem zweiten Schritt werden streptavidinbeschichtete paramagnetische Kügelchen mit den In-vitro-Translationsassays vermischt, um deren Wechselwirkung mit den im mRNA-Molekül befindlichen Biotinmolekülen zu ermöglichen.

Anschließend werden die Kügelchen mittels Magnetfeldern extrahiert, wodurch die an die mRNA gebundenen, gestoppten Peptid-tRNA-Ribosomen-Komplexe aus der Gesamtreaktion herausgezogen werden. Danach können die gereinigten Peptid-tRNA-Ribosomen-Komplexe mit Translationsfaktoren wie Freisetzungsfaktoren, translationshemmenden Antibiotika oder chemischen modifizierenden Agenzien versetzt werden, um ihre Funktion zu analysieren. Es werden Ergebnisse erhalten, die eine Hemmung der Hydrolyse der Peptid-tRNAs sowie deren Korrelation mit strukturellen Veränderungen der Ribosomen zeigen, basierend auf Peptidyltransferase-Aktivitäts- oder Translationsabschluss-Assays unter Verwendung von SDS- oder Tris-Racine-Page-Gelen sowie Modifikationsschutz-Assays mit Harnstoff-Page-Gelen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Differenzzentrifugation besteht darin, dass die isolierten Proben hauptsächlich Ribosomen enthalten, die jeweils nur eine Population von pep-tRNA aufweisen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Genexpression zu beantworten, beispielsweise nach der Natur naszierender Polypeptide und danach, wie Antibiotika die Ribosomenfunktion beeinflussen, etwa durch Modulation des Translationsprozesses. Um dieses Verfahren zu beginnen, beschaffen Sie zwei Gramm eines trockenen Bakterienpellets von E. coli aus Kulturen in der logarithmischen Wachstumsphase.

Washen Sie das Pellet, indem Sie es in einem Liter Puffer resuspendieren, gefolgt von einer Zentrifugation bei 5.000 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach Durchführung von zwei Waschschritten resuspendieren Sie das resultierende bakterielle Pellet in 40 Milliliter Puffer und lysieren die Bakterienzellen mittels einer French-Press unter Anwendung eines Drucks von 6.000 PSI. Dieser Druck entspricht 600 Einheiten unter Verwendung eines Kolbens mit einem Zoll Durchmesser.

Sammeln Sie die aufgeschlossene Suspension in einem sauberen 50-Milliliter-Glasröhrchen. Behandeln Sie die aufgeschlossene Suspension mit ein Millimolar DIO-Triol oder DTT, und zentrifugieren Sie die Probe bei 30.000 ×g für 30 Minuten. Entfernen Sie das resultierende Überstand und wiederholen Sie den Zentrifugationsvorgang.

Speichern Sie das Überstandsvolumen, das aus der zweiten Zentrifugation erhalten wurde, und portionieren Sie den endgültigen Überstand in Mikroröhrchen. Schließlich gefrieren Sie die Aliquots schnell ein, indem Sie eine Trockeneis-Ethanol-Mischung oder flüssigen Stickstoff verwenden, und lagern Sie die Proben bei minus 60 oder minus 80 Grad Celsius.

Beginnen Sie die Herstellung zellfreier Extrakte, die an RF zwei verarmt sind, indem Sie 4,5 Milliliter Protein-A-Sphäros-4B-Suspensionsperlen mit fünf Millilitern eines anti-RF-zwei-Antiserums mischen. Rühren Sie die Mischung eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Rad um. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 2.500 ×g, um die Perlen vom Antiserum zu trennen.

Entfernen Sie den Überstand. Die Kügelchen enthalten nun die Anti-RF-Zwei-Antikörper und werden als Anti-RF-Zwei-Kügelchen bezeichnet. Waschen Sie die Kügelchen durch Resuspension in einem Milliliter Puffer B.

Zentrifugieren Sie die Kügelchen anschließend wie zuvor, um die Anti-RF-zwei-Kügelchen vom Puffer B zu trennen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal. Nach dem Waschen mischen Sie ein Milliliter des zellfreien Extrakts mit 150 Mikrolitern Anti-RF-zwei-Kügelchen und inkubieren die Mischung zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Rad. Zentrifugieren Sie danach das Gemisch bei 10.000 G, um den zellfreien Extrakt von den Kügelchen zu trennen.

Entfernen Sie den Überstand und behandeln Sie ihn erneut mit weiteren 150 Mikrolitern Anti-RF-zwei-Perlen, bevor Sie die Inkubation und das erneute Herunterziehen wiederholen. Geben Sie die endgültige RF-zwei-verarmte zellfreie Extraktlösung in Mikroröhrchen zu je 100 Mikrolitern ab. Gefrieren Sie die Aliquots mit einer Trockeneis-Ethanol-Mischung oder flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bei minus 60 oder minus 80 Grad Celsius.

Bereiten Sie die PCR-Reaktion vor, indem Sie die Plasmidvorlage, die die zu transkribierenden Sequenzen enthält, mit Oligo-Desoxyribonukleotiden, dNTPs, intakter DNA-Polymerase und Strategie-PCR-Puffer kombinieren. Sobald die PCR-Probe vorbereitet ist, führen Sie die Amplifikationsreaktion durch und präzipitieren die DNA, um die PCR-Produkte zu reinigen, indem Sie ein Zehntelvolumen von drei molarer Natriumacetat-Lösung (pH 5,2) und zwei Volumina eiskaltem Ethanol hinzufügen. Nachdem der Präzipitationsschritt einmal wiederholt wurde, lösen wir die resultierende DNA in 100 Mikrolitern mit Diethylopyrocarbonat behandeltem Wasser oder dsy-behandeltem Wasser auf.

Überprüfen Sie die Integrität der PCR-Produkte mittels Elektrophorese in Agarosegelen. Typischerweise liefert dieses Verfahren 100 Mikrogramm eines 600 Basenpaare langen DNA-Produkts. Bereiten Sie eine 100-Mikroliter-In-vitro-Transkriptionsreaktion in DEPC-behandeltem Wasser vor, indem Sie fünf Mikrogramm des durch PCR erzeugten DNA-Fragments mit biotinmarkierten Ribonukleotiden UTP und T7-Enzymmix mischen.

Die Reaktionsmischung drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Um die Menge an erhaltenen mRNA zu quantifizieren, die DNA-Vorlage durch Zugabe von DNAse, frei von RNAase, entfernen. Die Reaktion 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Um die mRNA-Produkte zu reinigen, präzipitieren Sie die RNA zweimal, indem Sie ein Zehntelvolumen dreimolarer Natriumacetat-Lösung (pH 5,2) und zwei Volumina kalten Ethanol hinzufügen, und resuspendieren Sie die präzipitierte mRNA in 100 Mikrolitern mit DPCI behandeltem Wasser. Überprüfen Sie die Integrität der biotinmarkierten mRNA-Produkte mittels Elektrophorese in Aros-Gelen. Diese Methode liefert üblicherweise zwischen ein und zwei Milligramm eines 600 Nukleotide langen, biotinmarkierten mRNA-Produkts, um mit der Isolierung von translatierenden Ribosomen, die eine Peptid-tRNA enthalten, zu beginnen. Eine 500-Mikroliter-In-vitro-Translationsreaktionsmischung wird in mit DEY behandeltem Wasser hergestellt.

Bereiten Sie zunächst das in dem begleitenden schriftlichen Protokoll beschriebene gepufferte Reaktionsgemisch vor und geben Sie dann jeweils 75 M der Aminosäuren hinzu, mit Ausnahme derjenigen, die durch eine radioaktive Aminosäure ersetzt wird. Anschließend geben Sie 20 bis 50 Mikroliter des RF zwei verarmten zellfreien Extrakts zur Pufferlösung mit den Aminosäuren hinzu. Inkubieren Sie das Gemisch fünf Minuten bei Raumtemperatur, um die Aktivierung der Ribosomen zu ermöglichen.

Nach der Aktivierung der Ribosomen 10 bis 15 Mikrogramm biotinmarkierter mRNA zur Probe hinzufügen. Die Reaktionsmischung 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Bereiten Sie derweil drei Milliliter Streptavidin-paramagnetische Kügelchen oder SMB in Puffer C vor. Nach der Inkubation geben Sie die SMP-Suspension zum Übersetzungsreaktionsgemisch hinzu. Inkubieren Sie die neue Suspension 10 Minuten bei Raumtemperatur. Trennen Sie die SMB vom Gemisch ab, indem Sie ein Magnetfeld mithilfe von magnetischen Separationsvorrichtungen anwenden. Resus.

Suspendieren Sie das SMB in Puffer C und trennen Sie die Kügelchen erneut mithilfe des Magnethalters. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal, suspendieren Sie die Kügelchen anschließend in 500 Mikrolitern Puffer C. Bewahren Sie die Suspension auf Eis auf und führen Sie das nächste Verfahren unverzüglich durch. Um das Peptid-tRNA sichtbar zu machen, mischen Sie 10 Mikroliter der in Puffer C suspendierten SMB mit 10 Mikrolitern Lade-Puffer und trennen Sie die an die Kügelchen gebundenen Komponenten durch Laufenlassen der Proben in 10 %igen Tris-Tric-Polyacrylamid-Gelen.

Trocknen Sie die Gele mithilfe eines Vakuum-Gel-Trockners. Überprüfen Sie anschließend die Integrität und Reinigung der Peptid-tRNA, indem Sie das getrocknete Gel einem Röntgenfilm aussetzen. Zur Analyse der ribosomalen RNA mischen Sie 190 Mikroliter einer zwei Millimolar EDTA-Lösung, hergestellt mit DPCi-behandeltem Wasser, 200 Mikroliter Phenol, das mit Wasser equilibriert wurde, und 10 Mikroliter einer Kügelchensuspension.

Versetzen Sie die resultierende Suspension durch kräftiges Wirbelmischen. Trennen Sie die anorganische Phase von der organischen Phase durch Zentrifugation bei 10.000 G für drei Minuten. Sammeln Sie bei Raumtemperatur die obere wässrige Schicht in einem neuen Mikroröhrchen, fällen Sie die RNA aus der wässrigen Schicht durch Zugabe eines Zehntels Volumens von drei molarer Natriumacetat-Lösung (pH 5,21), 1 Mikroliter einer 20 Milligramm pro Milliliter Glykogen-Lösung und zwei Volumina eiskaltem Ethanol. Lösen Sie die präzipitierte RNA in 10 Mikrolitern dpci-behandeltem Wasser wieder auf.

Überprüfen Sie die Integrität der ribosomalen RNAs mittels Elektrophorese auf Nitrosegelen. Üblicherweise ergibt eine 50-Mikroliter-Portion der Zellsuspension ein Mikrogramm ribosomaler RNA. Hier werden die Ergebnisse einer Reihe von Analysen zur Beurteilung der Qualität und Funktionalität isolierter, translatierender Ribosomen vorgestellt.

Die Beobachtung eines eindeutigen Bands in Polyacrylamidgelen weist auf das Vorhandensein von Polypeptiden hin, die an die biotinmarkierten mRNA-Moleküle gebunden sind, die an das SMB angeheftet sind. Die Reinigung ribosomaler RNAs. Mithilfe dieses Verfahrens lässt sich ebenfalls der Nachweis erbringen, dass Ribosomen an diese biotinmarkierten mRNA-Moleküle gebunden sind.

Die Zugabe von Puromycin, einem Antibiotikum, das die Peptidyltransferase-Aktivität des Ribosoms induziert, führt zum Bruch der naszierenden Peptid-tRNAs. Dies zeigt sich als Verschiebung des Migrationsmusters des isolierten Polypeptids in Polyacrylamidgelen. Zusammen weisen diese Daten darauf hin, dass an die SMB gebundene, biotinmarkierte mRNA funktionstüchtige Ribosomen mit Peptid-tRNAs enthält.

Die Isolierung von translatierenden Ribosomen, die spezifische Peptid-tRNAs enthalten, ermöglicht die Untersuchung der Wirkung von Peptid-tRNA-Antibiotika und anderen Molekülen auf die Ribosomenfunktion und -struktur. In den hier dargestellten Beispielen hemmen das Antibiotikum S-Parsamycin und die Aminosäure Tryptophan die hydrolytische Spaltung des naszenten TNAC-tRNA-Peptid-tRNA durch RF2 in den isolierten Ribosomen.

Die Wechselwirkung von Tryptophan oder Sparsomycin mit dem Ribosom induziert ebenfalls strukturelle Veränderungen in einigen Nukleotiden, die die 23 S-R-R-N-A des translatierenden Ribosoms bilden. Ist die Methode einmal beherrscht, kann der Hauptteil dieser Technik innerhalb von fünf Stunden ordnungsgemäß durchgeführt werden, wenn man diese Vorgehensweise befolgt. Andere Methoden wie die Kryo-EM oder zusätzliche strukturelle Analysen können durchgeführt werden, um weitere Fragen zur Struktur von Ribosomen, die einzigartige Pepin-RNA enthalten, zu beantworten.