Name: Isolierung von Ribosomen übersetzen enthaltend Peptidyl-tRNAs für funktionelle und strukturelle Analysen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-25T16:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von Ribosomen mit Peptidyl-tRNAs durch in vitro Translation und magnetische Extraktion. Diese Methode ermöglicht präzise funktionelle und strukturelle Analysen der Translation.

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LRC-V. will dieses Papier, die Erinnerung an Dr. Adriel D. Johnson, ein wunderbarer Professor, dessen Priorität Nummer eins war immer die Ausbildung der Studierenden zu widmen. Wir vermissen Dich, Adriel. Wir sind dankbar, dass Jacqueline Moreno für ihre Hilfe bei der Durchführung der Experimente in dieser Studie beschrieben. Diese Studie wurde durch einen Zuschuss zur Verfügung gestellt von der National Science Foundation, MCB-0615390 CY unterstützt und durch eine Anschubfinanzierung zur Verfügung gestellt, um LRC-V. von der University of Alabama in Huntsville.

1. Zellfreie Extrakt Vorbereitung. <ol><li> Zwei Gramm eines trockenen Escherichia coli Bakterien-Pellet aus der mittleren logarithmischen Phase Kulturen gewaschen, zweimal, mit einem halben Liter Puffer erhalten A mit 10 mM Tris-Acetat, pH 8,0, 14 mM Magnesium-Acetat, 60 mM Kaliumacetat und 50 ug / mL phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) durch Zentrifugation bei 5000 X g für 5 min bei 4 ° C. Nach dem Waschen wird das Bakterienpellet in 40 ml Puffer A resuspendiert </li><li> Die Bakterienzellen werden unterbrochen mit einem Französisch Presse, Anwendung 6000 psi Druck. Dieser Druck entspricht 600 Einheiten mit einem Ein-Zoll-Kolben. Die gestört Suspension wird in ein sauberes Glasröhrchen (50 ml) gesammelt. </li><li> Die gestört Suspension wird mit 1 mM Dithiothreitol (DTT) behandelt und bei 30.000 xg für 30 min zentrifugiert. Die Zentrifugation Vorgang wird solange wiederholt, wobei die resultierende Überstand. Der letzte Überstand wird verzichtet (1 mL) in Röhrchen. Schließlich werden die Aliquots eingefroren mit einem Trockeneis-Ethanol-Gemisch oder flüssigem Stickstoff, und bei -60 ° C gelagert oder -80 ° C. </li></ol> 2. Vorbereitung von zellfreien Extrakten von RF2 Depleted. <ol><li> 4,5 ml Protein A-Sepharose 4B Gülle Perlen werden mit 5 ml eines Anti-RF2 anti-Serum mit einem rotierenden Rad bei Raumtemperatur für eine Stunde gemischt. Die Mischung wird bei 2500 xg zentrifugiert, um die Perlen aus dem Antiserum zu trennen. Nach Verwerfen des Überstandes werden diese Kügelchen, die anti-RF2 Antikörper (anti-RF2 Perlen) später durch Resuspendieren in 1 ml Puffer B mit 35 mM Tris-Acetat pH 7,8, 10 mM Magnesium-Acetat, 30 mM Ammoniumacetat, 60 mM Kalium-Glutamat und 5 ug / ml Leupeptin Proteinase-Inhibitor. Die Anti-RF2 Kügelchen werden dann aus dem Puffer B durch Zentrifugation mit den gleichen oben angegebenen Bedingungen getrennt. Der Waschvorgang wird zweimal wiederholt. </li><li> Ein ml der zellfreien Extrakt wird mit 150 ul Anti-RF2 Perlen mit einem sich drehenden Rad, bei 4 ° C gemischt, für zwei Stunden. Die Mischung wird bei 10.000 xg zentrifugiert, um den zellfreien Extrakt aus den Perlen zu trennen. Der Überstand wird entfernt und behandelt erneut mit einem anderen 150 ul Anti-RF2 Perlen. Dieses Verfahren wird noch einmal mit den daraus resultierenden zellfreien Extrakt-Lösung wiederholt. Die endgültige zellfreien Extrakt-Lösung verzichtet wird (100 ul) in Röhrchen. Die Aliquots eingefroren mit einem Trockeneis-Ethanol-Gemisch oder flüssigem Stickstoff, und bei -60 ° C gelagert oder -80 ° C. </li></ol> 3. Erstellung eines DNA-Vorlage. <ol><li> Bereiten Sie eine 1 mL PCR-Reaktion durch Mischen 600 Femtomol der Plasmid-Vorlage mit den Sequenzen übersetzt werden (Abb. 1), mit 0,4 Nanomol jedes der Oligodesoxynukleotide in Abb. 1, 0,2 Mikromol je dNTP und 50 U angegeben Taq- DNA-Polymerase in den Puffer durch Stratagene Co. geliefert Führen Sie die Amplifikationsreaktion unter folgenden Bedingungen: 94 ° C für 2 min, (94 ° C für 30 s, 55 ° C für 30 s, 72 ° C für 1 min; für 30 Zyklen) und 72 ° C für 12 min. </li><li> Purify der PCR-Produkte durch Fällung der DNA durch Zugabe von 1 / 10 Volumen 3 M Natriumacetat, pH 5,2 und 2 Volumen eiskaltem Ethanol. Wiederholen Sie die Niederschläge Verfahren noch einmal. Die DNA in 100 ul von Diethyl-(DEPC) behandelt-Wasser. Normalerweise liefert dieses Verfahren 100 ug eines 600 bp DNA-Produkt. </li><li> Überprüfen Sie die Integrität der PCR-Produkte durch Elektrophorese auf Agarosegelen. </li></ol> 4. Vorbereitung von Biotin markiert mRNA. <ol><li> Bereiten Sie eine 100 ul in vitro Transkriptions-Reaktion in DEPC behandeltem Wasser durch Mischen von 5 ug des PCR-generierten DNA-Fragment mit 0,5 Mikromol ATP, CTP, GTP, 0,3 Mikromol UTP, 50 Nanomol Biotin-16-UTP und 10 ul von T7 Enzym-Mix in der Puffer von Promega Co. geliefert Inkubieren der Reaktionsmischung bei 37 ° C für 3 Stunden. Zur Quantifizierung der Menge an mRNA erhalten, sollten die DNA-Matrize durch Zugabe von RNase-freier DNase beseitigt werden. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 ° C für 10 min. </li><li> Purify die mRNA-Produkte durch Fällung der RNA durch Zugabe von 1 / 10 Volumen 3 M Natriumacetat, pH 5,2, und 2 Volumina kaltem Ethanol. Wiederholen Sie die Niederschläge Verfahren noch einmal. Resuspendieren des mRNA in 100 ul DEPC-Wasser behandelt. In der Regel bezeichnet dieses Verfahren Renditen zwischen 1-2 mg eines 600 nt Biotin mRNA Produkt. </li><li> Überprüfen Sie die Integrität der Biotin-markierten mRNA-Produkte durch Elektrophorese auf Agarosegelen. </li></ol> 5. Isolierung von Ribosomen übersetzen enthaltend ein Peptidyl-tRNA. <ol><li> Bereiten Sie 500 mL einer in vitro Translation Reaktionsgemisch in DEPC behandeltem Wasser durch Mischen 10-15 pg Biotin-markierten mRNA mit 75 Nanomol jedes der neunzehn Aminosäuren-alle außer die Aminosäure, die von einer radioaktiven Aminosäure ersetzt werden , 50 uCi einer radioaktiven Aminosäure (37MBq), und 20-5 0 ul von RF2-abgereicherten zellfreien Extrakt, in einer gepufferten Reaktionsgemisch mit 40 mM Tris-Acetat, pH 8,0, 10 mM Magnesium-Acetat, 175 mM Kaliumacetat, 10 mM Ammoniumacetat, 2 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 mM GTP, 30 mM Phosphoenolpyruvat (PEP), 0,3 U / ml Pyruvatkinase (PK), 3,5% Polyethylenglykol 8000, 1 mM Spermidin, 20 pg / mL Folinsäure und 250 ug / ml tRNA aus E. coli. Inkubieren der Reaktionsmischung bei 37 ° C für 10 Minuten. Die Reihenfolge der Zugabe der Reaktionspartner ist sehr wichtig. Der zellfreie Extrakt muss zuerst mit der Pufferlösung mit den Aminosäuren und die endgültige Mischung für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert, um die Aktivierung der Ribosomen können gemischt werden. Später werden die Biotin-markierten mRNAs aufgenommen. Für strukturelle Analysen mit chemischen Modifikation Verfahren ist die Zugabe eines radioaktiven Aminosäure nicht erforderlich. </li><li> Hinzufügen, um die Übersetzung Reaktionsgemisch - 3 ml Streptavidin paramagnetischen Kügelchen (SMB) in Puffer C suspendiert, das 35 mM Tris-Acetat, pH 8,0, 10 mM Magnesium-Acetat, 175 mM Kaliumacetat, 10 mM Ammoniumacetat und 1 mM DTT. Inkubieren Sie die neue Suspension bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Trennen Sie die SMB aus dem Gemisch durch Anlegen eines Magnetfeldes (MF) mit magnetischen Trennung steht. </li><li> Resuspendieren SMB in Puffer C und trennen Sie die Perlen wieder mit dem MF. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang zweimal. Resuspendieren der Beads in 500 ul Puffer C, speichern Sie die Suspension auf Eis, und führen Sie das nächste Verfahren sofort. </li></ol> 6. Analyse der isolierten Ribosomen enthaltend die Peptidyl-tRNA. Für Peptidyl-tRNA <ol><li> Mix 10 ul des SMB (suspendiert in Puffer C) mit 10 ul einer Be-Puffer mit 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,5% (v / v) Glycerin, 4% Natriumdodecylsulfat, 2 mM DTT und 0,2 mg / mL Bromphenolblau. Lösen Sie die Komponenten an die Perlen, indem Sie die Proben in 10% Tris-Tricin Polyacrylamidgelen. </li><li> Trocknen Sie die Gele mit Hilfe eines Vakuum-Gel-Trockner. </li><li> Überprüfen Sie die Integrität und die Reinigung der Peptidyl-tRNA, indem die getrockneten Gel ein Röntgenfilm. </li></ol> Für die ribosomale RNA <ol start="4"><li> Add 190 &amp;mgr; l 2 mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA)-Lösung mit DEPC-behandeltem Wasser hergestellt, und 200 ul Phenol equilibriert mit Wasser auf 10 mL einer Bead-Suspension. Mix der Suspension durch kräftiges Vortexen und trennen Sie die anorganische Phase von der organischen Phase durch Zentrifugation bei 10.000 xg für 3 min bei Raumtemperatur. Sammeln Sie die Top-Wasserschicht in einem neuen Mikroröhrchen. </li><li> Fällung der RNA aus dem Wasser-Schicht, indem 1 / 10 Volumen 3 M Natriumacetat, pH 5,2, 1 ul 20 mg / ml Glykogen-Lösung und 2 Volumen eiskaltem Ethanol. Die RNA in 10 ul DEPC-behandeltem Wasser. </li><li> Überprüfen Sie die Integrität der ribosomalen RNAs durch Elektrophorese auf Agarosegelen. Normalerweise liefert 50 ul Perlen Aufhängung 1 g der ribosomalen RNA. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse einer Reihe von Analysen der Bewertung der Qualität und Funktionalität der Übersetzung Ribosomen isoliert unter Verwendung des Verfahrens beschrieben. Die Beobachtung einer einzigartigen Band in Polyacrylamidgelen gelöst weist auf das Vorhandensein von Polypeptiden gebunden an die Biotin-markierten mRNAs an der SMB (Abbildung 2A). Die Reinigung der ribosomalen RNAs mit diesem Verfahren stellt die Anwesenheit von Ribosomen gebunden, diese Biotin-markierten mRNAs, sowie (Abbildung 2B). Die Zugabe von Puromycin, ein Antibiotikum, das die Peptidyl-Transferase-Aktivität des Ribosoms induziert, führt zu Spaltung der entstehenden Peptidyl-tRNAs 1. Dies wird als eine Verschiebung der Migration Muster des isolierten Polypeptids in Polyacrylamidgelen (Abb. 2C) beobachtet. Zusammen zeigen diese Daten, die Biotin-markierten mRNAs an der SMB funktionellen Ribosomen enthalten, mit Peptidyl-tRNAs. Die Isolierung des Übersetzens Ribosomen mit spezifischen Peptidyl-tRNAs ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen der Peptidyl-tRNAs, Antibiotika und anderen Molekülen, auf ribosomalen Funktion (Abbildung 3A), und am Ribosom Struktur (Abbildung 3B). In der hier vorgestellten Beispiele das Antibiotikum Sparsomycin und der Aminosäure Tryptophan (Trp) hemmen die hydrolytische Spaltung der entstehenden tnaC-tRNA Peptidyl-tRNA induziert durch RF2 in den isolierten Ribosomen (Abb. 3A). Das Zusammenspiel von Sparsomycin oder Trp mit dem Ribosom induziert auch strukturelle Veränderungen in einigen Nukleotiden, dass die 23S rRNA der Ribosomen übersetzen (Abb. 3B) darstellen. Zusammenfassend beschrieb das biologische Material unter Verwendung des Verfahrens hier sind nützlich bei der Beschaffung von zusätzlichen Verständnis der strukturellen Kontakte zu einer Hemmung der ribosomalen Funktion auf ihre Wechselwirkung mit verschiedenen molekularen Faktoren beteiligt. ove_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Vorgehensweise zur Herstellung und Reinigung der Übersetzung Ribosomen mit Peptidyl-tRNAs. DNA-Fragmente ca. 650 bp in der Länge, mit der tnaC Gens und seiner angrenzenden Region, in der Abbildung dargestellt, werden als Vorlagen bei der Vorbereitung mRNAs mit Biotin, [(bio) UMP] mRNA verwendet. Diese DNA-Fragmente werden durch PCR-Verfahren unter Verwendung der Oligodesoxynukleotide an der Spitze der Figur angegeben hergestellt. Die unterstrichenen Buchstaben kennzeichnen die Lage des T7-Promotors in der Nukleotid-Primer kodiert. Bold Buchstaben geben die Shine-Dalgarno Sequenz, in der Übersetzung der tnaC mRNA-Sequenzen verwendet wird. Der T7-Promotor in das DNA-Fragment wird durch T7-RNA-Polymerase, die zur Transkription (Pfeil) der tnaC Sequenz und die nicht-kodierenden Sequenz stromabwärts erkannt wird. Die Transkription ist beendet, wenn RNA-Polymerase erreicht das 3'-Ende des DNA-Fragments, nach dem rpoBC Terminator-Sequenzen (rpoBC "t"). Die Stamm-Schleife-Struktur der rpoBC Terminator schützt die mRNA aus dem 3'-5 'exoribonuclease Aktivität im zellfreien Extrakten in der in vitro Translation Reaktionen eingesetzt. Die isolierte [(bio) UMP] mRNAs werden verwendet, um ins Stocken geraten, Übersetzung Ribosomen erzeugen, mit der in vitro Translation-Assays. Die tnaC Sequenz in der [(bio) UMP] mRNA wird von einem Ribosom, die bei der letzten Aminosäure eingebaut wird Ständen, wegen der Abwesenheit der Release Factor (RF2) aus dem Reaktionsgemisch übersetzt. Das Ribosom-[(bio) UMP] mRNA-Komplexe werden von der gesamten Reaktionsmischung mit Streptavidin-Magnetic-Beads (SMB), die die Biotin-markierte Nukleotide in die mRNA eingebaut binden isoliert. Der kleine und mittelständische Unternehmen gebunden Ribosom-[(bio) UMP] mRNA-Komplexe sind aus der gesamten Reaktionsmischung durch ein Magnetfeld (MF) extrahiert. <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Strukturelle und funktionelle Analysen der isolierten Komplexe. A) In-vitro-Translation-Reaktionen wurden mit durchgeführt [(bio) UMP] mRNAs, in denen das Startcodon des tnaC Gen durch ein Stop-Codon ersetzt wurde. Die Endprodukte wurden isoliert mittels Streptavidin-Beads, wie in Abb. 1 zu ersehen. Reaktionsprodukte und isolierten Moleküle wurden dann durch Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen analysiert. Die tnaC-tRNA und tnaC Peptid-Bands sind markiert. B) Gesamt-RNA wurde aus den festgefahrenen Komplexe mit Phenol-Extraktion Verfahren isoliert. Jeder isolierte RNA wurde durch Elektrophorese in Agarosegelen aufgelöst. Ribosomalen RNAs (rRNA) sind angegeben. C) isolierten Komplexen mit tnaC-tRNAs wurden inkubiert mit (+) oder ohne (-) 0,02 mM Puromycin (Puro) bei Raumtemperatur für 10 min. Die tnaC Peptid wurden während der Übersetzung mit [35S]-Methionin (A) oder [3H]-Prolin (B) gekennzeichnet. <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Strukturelle und funktionelle Analysen von Ribosomen mit tnaC-tRNA, die gegen das Antibiotikum Sparsomycin oder die Aminosäure Tryptophan gebunden sind. A) isolierten Komplexen mit tnaC-tRNAs wurden mit (+) oder ohne (inkubiert -) Sparsomycin (Spar) oder Tryptophan (Trp) bei Raumtemperatur für 5 min. Später wurden die Mischungen mit RF2 gemischt und bei 37 ° C für 20 min. B) Analyse der Methylierung Veränderungen in 23S rRNA-Moleküle durch Bindung innerhalb des Ribosoms induziert. Isolierte Komplexe wurden mit (+) oder ohne vorinkubiert (-) 2 mM Trp oder Spar für 5 min bei 37 ° C. Dann wurde ein Alkylierungsmittel Dimethylsulfat, zugegeben und die Mischungen bei Raumtemperatur für weitere 20 min inkubiert. Gesamt-RNA wurde extrahiert und Primer-Extension-Assays wurden mit [32P]-markierten Oligodesoxynukleotids komplementär zu den Nukleotiden der 23S rRNA, die 100 Nukleotide beabstandet sind, hinter das modifizierte Nukleotid durchgeführt. Die Endprodukte der Erweiterung Assays wurden durch Elektrophorese in Polyacrylamidgelen aufgelöst. Die 23S rRNA Nukleotide durch die Anwesenheit von Trp oder Spar betroffen sind angegeben.

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</ol>

Diese Isolation Verfahren in diesem Bericht beschrieben wird, in hohem Maße reproduzierbar. Leider kann das Vorhandensein von kurzen Peptidyl-tRNAs aus dem gleichen translatierten Sequenzen produziert nicht bequem vermieden werden, wie Peptidyl-tRNAs kann auf 15-20% der gesamten isolierten Materials (Abbildung 2C) entsprechen. Diese Verunreinigungen können in der Konzentration zu erhöhen, wenn höhere Konzentrationen von Biotin-markierten mRNA verwendet wurden oder wenn die zellfreie Extrakte eingesetzt alt sind oder wurden mehrmals wieder verwendet werden. Daher ist es sehr wichtig, um die Qualität und Konzentration der Komponenten der in-vitro-Translation Reaktionen zu kontrollieren. Alternativ rekonstituierte kommerziellen hohen Wirkungsgrad zellfreie Extrakte zur Verfügung, die für die gleichen Zwecke (PURE-System) 18 verwendet werden. Mit dieser Methode ist Biotin-16-UMP zufällig entlang der Länge der Ziel-mRNA eingearbeitet. Es besteht die Möglichkeit, dass einige ORFs mit Uridin Verträge eingearbeitet haben diese modifizierte Nukleotid, in ihren Sequenzen die ihre Übersetzung. Variable relativen Konzentrationen von biotin-16-UTP/UTP müssen während der Synthese der mRNA getestet werden, um die effizienteste Übersetzung zu erhalten. Alternative Methoden der Biotin-Markierung verwendet werden, gezielt das 5&#39;-Ende, das stabilste Ende der mRNAs. (I) Biotin kann das 5&#39;-Ende der mRNA mit 3&#39;-NH2ATP (3&#39;-Amino-, 3&#39;-desoxy-Triphosphat) und T4 RNA-Ligase 19 befestigt werden. (Ii) 5&#39;-Ende mit Biotin markierte Oligonukleotid kann das 5&#39;-Ende der mRNA mit Hilfe der T4-RNA-Ligase sowie 20 befestigt werden. (Iii) 3&#39;-Ende Biotin-markierten Oligodesoxynukleotide die an die komplementäre Sequenz am 5&#39;-Ende der mRNA entsprechen könnten auch verwendet werden, um die Übersetzung von Komplexen zu isolieren. Diese Biotin markiert Oligodesoxynukleotide konnte die SMB befestigt werden, bevor die Isolation. Später wurde der SMB, die Biotin-markierten Oligodesoxynukleotide befestigt konnte mit der Übersetzung Reaktionsgemisch, um die Interaktion mit ihren komplementären mRNA-Sequenzen ermöglichen gemischt werden. Nach der Isolierung der Hybrid-RNA-DNA-Region - Hybridisierung und den Bereich zwischen dem Biotin-markierten Oligodesoxynukleotids und die mRNA-Sequenz - konnten abgebaut werden mittels RNAse H, trennt die festgefahrenen Komplexe aus der Streptavidinbeads. Diese alternative Methode können der Komplexe in Zukunft strukturelle Analysen mit höherer Auflösung Methoden eingesetzt werden.

<table><tbody><tr><td>Tris-Basis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumacetat</td><td>Fluka</td><td>63049</td><td></td></tr><tr><td>Potassiumglutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumacetat</td><td>Fluka</td><td>09688</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Protein A Sepharose 4B-Suspensionsperlen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9424</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin-Inhibitor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9783</td><td></td></tr><tr><td>Taq-DNA-Polymerase</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>201223</td><td></td></tr><tr><td>T7-Maxiprep-Kit</td><td>Promega Corp.</td><td>P1300</td><td></td></tr><tr><td>SMB</td><td>Promega Corp.</td><td>Z5482</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-16-UTP</td><td>Roche Group</td><td>1388908</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7002</td><td></td></tr><tr><td>PK</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7768</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenglykol 8000</td><td>Fluka</td><td>81268</td><td></td></tr><tr><td>Folinsäure</td><td>Fluka</td><td>47612</td><td></td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Fluka</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>tRNA aus &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5816</td><td></td></tr><tr><td>L-Aminosäuren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LAA21</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fluka</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische Trennvorrichtungen</td><td>Promega Corp.</td><td>Z5342</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von ribosomen übersetzen enthaltend peptidyl-trnas für funktionelle und strukturelle analysen

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Vor kurzem haben strukturelle und biochemische Studien viele der molekularen Ereignisse, die in den Ribosomen treten bei der Hemmung der Proteinsynthese durch Antibiotika und während entstehenden Polypeptidsynthese detailliert. Einige dieser Antibiotika und regulatorischen entstehenden Polypeptide meist in Form von Peptidyl-tRNAs, hemmen entweder die Bildung der Peptidbindung oder Übersetzung Beendigung 1-7. Diese hemmenden Ereignisse kann die Bewegung des Ribosoms zu stoppen, bezeichnet ein Phänomen der &quot;translationalen verhaften&quot;. Übersetzung Verhaftung durch entweder ein Antibiotikum oder einer entstehenden Polypeptid induziert wurde gezeigt, dass die Expression von Genen in verschiedenen zellulären Funktionen wie Zellwachstum, Antibiotika-Resistenz, Protein-Translokation und Zellstoffwechsel 8-13 beteiligt zu regulieren. Wissen, wie Antibiotika und regulatorischen entstehenden Polypeptide verändern ribosomalen Funktion ist unerlässlich, wenn wir die komplette Rolle des Ribosoms in der Übersetzung, in jedem Organismus zu verstehen. Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die verwendet werden, um zu reinigen, ausschließlich für die Analyse, der Umsetzung dieser Ribosomen eine spezifische mRNA und mit einer spezifischen Peptidyl-tRNA 14 kann. Dieses Verfahren beruht auf selektiven Isolierung des Übersetzens Ribosomen gebunden an ein Biotin-markierten mRNA basieren. Diese translationale Komplexe sind aus anderen Ribosomen in der gleichen Mischung getrennt, mit Streptavidin paramagnetischen Kügelchen (SMB) und ein Magnetfeld (MF). Biotin-markierten mRNAs werden von run-off-Transkription Tests unter Verwendung als Vorlagen PCR-generierten DNA-Fragmente, die T7 Transkriptions-Promotoren enthalten synthetisiert. T7-RNA-Polymerase enthält Biotin-16-UMP aus Biotin-UTP; unter unseren Bedingungen etwa zehn Biotin-16-UMP-Moleküle sind in einem 600 nt mRNA mit einem 25% UMP Inhalte integriert. Diese Biotin-markierten mRNAs werden dann isoliert und in ein in vitro-Translation-Assays mit dem Release Faktor 2 (RF2) durchgeführt abgereicherte zellfreien Extrakten von Escherichia coli-Stämme, die Wildtyp-oder mutierte Ribosomen erhalten. Ribosomen übersetzen die Biotin-markierten mRNA-Sequenzen sind in der Stop-Codon Region ins Stocken geraten, wegen der Abwesenheit der RF2-Protein, das normalerweise erreicht Übersetzung Kündigung. Stalled Ribosomen mit den neu synthetisierten Peptidyl-tRNA isoliert und entfernt von der Übersetzung Reaktionen mit SMB und ein MF. Diese Kügelchen binden nur Biotin-haltigen Nachrichten. Die isolierte, translationale Komplexe können verwendet werden, um die strukturellen und funktionellen Eigenschaften von Wildtyp-oder mutierte ribosomale Komponenten oder Peptidyl-tRNA-Sequenzen, sowie die Bestimmung Ribosom Interaktion mit Antibiotika oder anderen molekularen Faktoren 1,14-16 zu analysieren. Um zu untersuchen, die Funktion dieser isolierten Ribosomen-Komplexe können Peptidyl-Transferase-Assays in Anwesenheit des Antibiotikums Puromycin 1 durchgeführt werden. Zur Untersuchung struktureller Veränderungen in der translationalen Komplexe können etablierte Verfahren eingesetzt, wie i sein) Vernetzung auf bestimmte Aminosäuren 14 und / oder ii) Alkylierung Schutz Assays 1,14,17.

Ein wesentliches Hindernis für biochemische Analysen von Ribosomen, die im Entstehen begriffenen Peptidyl-tRNAs hat das Vorhandensein von anderen Ribosomen in der gleichen Proben, Ribosomen nicht in der Übersetzung der spezifischen mRNA-Sequenz, die analysiert werden beteiligt. Wir entwickelten eine einfache Methode, um zu reinigen, ausschließlich, den Ribosomen, welche die entstehenden Peptidyl-tRNA von Interesse.

Isolierung von Ribosomen übersetzen enthaltend Peptidyl-tRNAs für funktionelle und strukturelle Analysen

In jüngster Zeit haben strukturelle und biochemische Studien viele der molekularen Ereignisse detailliert beschrieben, die im Ribosom während der Hemmung der Proteinsynthese ablaufen ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Struktur und Funktion reiner Ribosomen, die eine einzigartige peptidyl-tRNA enthalten, zu analysieren. Dies wird erreicht, indem In-vitro-Translationsassays mit freisetzenden Faktoren depletierten, zellfreien Extrakten und biotinmarkierten mRNA-Molekülen durchgeführt werden, um angehaltene Peptidyl-tRNA-Ribosomen-Komplexe zu erzeugen, die an die biotinmarkierten mRNA-Moleküle gebunden sind. In einem zweiten Schritt werden streptavidinbeschichtete paramagnetische Kügelchen mit den In-vitro-Translationsassays vermischt, um deren Wechselwirkung mit den im mRNA-Molekül befindlichen Biotinmolekülen zu ermöglichen.Anschließend werden die Kügelchen mittels Magnetfeldern extrahiert, wodurch die an die mRNA gebundenen, gestoppten Peptid-tRNA-Ribosomen-Komplexe aus der Gesamtreaktion herausgezogen werden. Danach können die gereinigten Peptid-tRNA-Ribosomen-Komplexe mit Translationsfaktoren wie Freisetzungsfaktoren, translationshemmenden Antibiotika oder chemischen modifizierenden Agenzien versetzt werden, um ihre Funktion zu analysieren. Es werden Ergebnisse erhalten, die eine Hemmung der Hydrolyse der Peptid-tRNAs sowie deren Korrelation mit strukturellen Veränderungen der Ribosomen zeigen, basierend auf Peptidyltransferase-Aktivitäts- oder Translationsabschluss-Assays unter Verwendung von SDS- oder Tris-Racine-Page-Gelen sowie Modifikationsschutz-Assays mit Harnstoff-Page-Gelen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Differenzzentrifugation besteht darin, dass die isolierten Proben hauptsächlich Ribosomen enthalten, die jeweils nur eine Population von pep-tRNA aufweisen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Genexpression zu beantworten, beispielsweise nach der Natur naszierender Polypeptide und danach, wie Antibiotika die Ribosomenfunktion beeinflussen, etwa durch Modulation des Translationsprozesses. Um dieses Verfahren zu beginnen, beschaffen Sie zwei Gramm eines trockenen Bakterienpellets von E. coli aus Kulturen in der logarithmischen Wachstumsphase.Washen Sie das Pellet, indem Sie es in einem Liter Puffer resuspendieren, gefolgt von einer Zentrifugation bei 5.000 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach Durchführung von zwei Waschschritten resuspendieren Sie das resultierende bakterielle Pellet in 40 Milliliter Puffer und lysieren die Bakterienzellen mittels einer French-Press unter Anwendung eines Drucks von 6.000 PSI. Dieser Druck entspricht 600 Einheiten unter Verwendung eines Kolbens mit einem Zoll Durchmesser.Sammeln Sie die aufgeschlossene Suspension in einem sauberen 50-Milliliter-Glasröhrchen. Behandeln Sie die aufgeschlossene Suspension mit ein Millimolar DIO-Triol oder DTT, und zentrifugieren Sie die Probe bei 30.000 ×g für 30 Minuten. Entfernen Sie das resultierende Überstand und wiederholen Sie den Zentrifugationsvorgang.Speichern Sie das Überstandsvolumen, das aus der zweiten Zentrifugation erhalten wurde, und portionieren Sie den endgültigen Überstand in Mikroröhrchen. Schließlich gefrieren Sie die Aliquots schnell ein, indem Sie eine Trockeneis-Ethanol-Mischung oder flüssigen Stickstoff verwenden, und lagern Sie die Proben bei minus 60 oder minus 80 Grad Celsius.Beginnen Sie die Herstellung zellfreier Extrakte, die an RF zwei verarmt sind, indem Sie 4,5 Milliliter Protein-A-Sphäros-4B-Suspensionsperlen mit fünf Millilitern eines anti-RF-zwei-Antiserums mischen. Rühren Sie die Mischung eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Rad um. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 2.500 ×g, um die Perlen vom Antiserum zu trennen.Entfernen Sie den Überstand. Die Kügelchen enthalten nun die Anti-RF-Zwei-Antikörper und werden als Anti-RF-Zwei-Kügelchen bezeichnet. Waschen Sie die Kügelchen durch Resuspension in einem Milliliter Puffer B.Zentrifugieren Sie die Kügelchen anschließend wie zuvor, um die Anti-RF-zwei-Kügelchen vom Puffer B zu trennen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal. Nach dem Waschen mischen Sie ein Milliliter des zellfreien Extrakts mit 150 Mikrolitern Anti-RF-zwei-Kügelchen und inkubieren die Mischung zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Rad. Zentrifugieren Sie danach das Gemisch bei 10.000 G, um den zellfreien Extrakt von den Kügelchen zu trennen.Entfernen Sie den Überstand und behandeln Sie ihn erneut mit weiteren 150 Mikrolitern Anti-RF-zwei-Perlen, bevor Sie die Inkubation und das erneute Herunterziehen wiederholen. Geben Sie die endgültige RF-zwei-verarmte zellfreie Extraktlösung in Mikroröhrchen zu je 100 Mikrolitern ab. Gefrieren Sie die Aliquots mit einer Trockeneis-Ethanol-Mischung oder flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bei minus 60 oder minus 80 Grad Celsius. Bereiten Sie die PCR-Reaktion vor, indem Sie die Plasmidvorlage, die die zu transkribierenden Sequenzen enthält, mit Oligo-Desoxyribonukleotiden, dNTPs, intakter DNA-Polymerase und Strategie-PCR-Puffer kombinieren. Sobald die PCR-Probe vorbereitet ist, führen Sie die Amplifikationsreaktion durch und präzipitieren die DNA, um die PCR-Produkte zu reinigen, indem Sie ein Zehntelvolumen von drei molarer Natriumacetat-Lösung (pH 5,2) und zwei Volumina eiskaltem Ethanol hinzufügen. Nachdem der Präzipitationsschritt einmal wiederholt wurde, lösen wir die resultierende DNA in 100 Mikrolitern mit Diethylopyrocarbonat behandeltem Wasser oder dsy-behandeltem Wasser auf.Überprüfen Sie die Integrität der PCR-Produkte mittels Elektrophorese in Agarosegelen. Typischerweise liefert dieses Verfahren 100 Mikrogramm eines 600 Basenpaare langen DNA-Produkts. Bereiten Sie eine 100-Mikroliter-In-vitro-Transkriptionsreaktion in DEPC-behandeltem Wasser vor, indem Sie fünf Mikrogramm des durch PCR erzeugten DNA-Fragments mit biotinmarkierten Ribonukleotiden UTP und T7-Enzymmix mischen.Die Reaktionsmischung drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Um die Menge an erhaltenen mRNA zu quantifizieren, die DNA-Vorlage durch Zugabe von DNAse, frei von RNAase, entfernen. Die Reaktion 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.Um die mRNA-Produkte zu reinigen, präzipitieren Sie die RNA zweimal, indem Sie ein Zehntelvolumen dreimolarer Natriumacetat-Lösung (pH 5,2) und zwei Volumina kalten Ethanol hinzufügen, und resuspendieren Sie die präzipitierte mRNA in 100 Mikrolitern mit DPCI behandeltem Wasser. Überprüfen Sie die Integrität der biotinmarkierten mRNA-Produkte mittels Elektrophorese in Aros-Gelen. Diese Methode liefert üblicherweise zwischen ein und zwei Milligramm eines 600 Nukleotide langen, biotinmarkierten mRNA-Produkts, um mit der Isolierung von translatierenden Ribosomen, die eine Peptid-tRNA enthalten, zu beginnen. Eine 500-Mikroliter-In-vitro-Translationsreaktionsmischung wird in mit DEY behandeltem Wasser hergestellt.Bereiten Sie zunächst das in dem begleitenden schriftlichen Protokoll beschriebene gepufferte Reaktionsgemisch vor und geben Sie dann jeweils 75 M der Aminosäuren hinzu, mit Ausnahme derjenigen, die durch eine radioaktive Aminosäure ersetzt wird. Anschließend geben Sie 20 bis 50 Mikroliter des RF zwei verarmten zellfreien Extrakts zur Pufferlösung mit den Aminosäuren hinzu. Inkubieren Sie das Gemisch fünf Minuten bei Raumtemperatur, um die Aktivierung der Ribosomen zu ermöglichen.Nach der Aktivierung der Ribosomen 10 bis 15 Mikrogramm biotinmarkierter mRNA zur Probe hinzufügen. Die Reaktionsmischung 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.Bereiten Sie derweil drei Milliliter Streptavidin-paramagnetische Kügelchen oder SMB in Puffer C vor. Nach der Inkubation geben Sie die SMP-Suspension zum Übersetzungsreaktionsgemisch hinzu. Inkubieren Sie die neue Suspension 10 Minuten bei Raumtemperatur. Trennen Sie die SMB vom Gemisch ab, indem Sie ein Magnetfeld mithilfe von magnetischen Separationsvorrichtungen anwenden. Resus.Suspendieren Sie das SMB in Puffer C und trennen Sie die Kügelchen erneut mithilfe des Magnethalters. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal, suspendieren Sie die Kügelchen anschließend in 500 Mikrolitern Puffer C. Bewahren Sie die Suspension auf Eis auf und führen Sie das nächste Verfahren unverzüglich durch. Um das Peptid-tRNA sichtbar zu machen, mischen Sie 10 Mikroliter der in Puffer C suspendierten SMB mit 10 Mikrolitern Lade-Puffer und trennen Sie die an die Kügelchen gebundenen Komponenten durch Laufenlassen der Proben in 10 %igen Tris-Tric-Polyacrylamid-Gelen.Trocknen Sie die Gele mithilfe eines Vakuum-Gel-Trockners. Überprüfen Sie anschließend die Integrität und Reinigung der Peptid-tRNA, indem Sie das getrocknete Gel einem Röntgenfilm aussetzen. Zur Analyse der ribosomalen RNA mischen Sie 190 Mikroliter einer zwei Millimolar EDTA-Lösung, hergestellt mit DPCi-behandeltem Wasser, 200 Mikroliter Phenol, das mit Wasser equilibriert wurde, und 10 Mikroliter einer Kügelchensuspension.Versetzen Sie die resultierende Suspension durch kräftiges Wirbelmischen. Trennen Sie die anorganische Phase von der organischen Phase durch Zentrifugation bei 10.000 G für drei Minuten. Sammeln Sie bei Raumtemperatur die obere wässrige Schicht in einem neuen Mikroröhrchen, fällen Sie die RNA aus der wässrigen Schicht durch Zugabe eines Zehntels Volumens von drei molarer Natriumacetat-Lösung (pH 5,21), 1 Mikroliter einer 20 Milligramm pro Milliliter Glykogen-Lösung und zwei Volumina eiskaltem Ethanol. Lösen Sie die präzipitierte RNA in 10 Mikrolitern dpci-behandeltem Wasser wieder auf.Überprüfen Sie die Integrität der ribosomalen RNAs mittels Elektrophorese auf Nitrosegelen. Üblicherweise ergibt eine 50-Mikroliter-Portion der Zellsuspension ein Mikrogramm ribosomaler RNA. Hier werden die Ergebnisse einer Reihe von Analysen zur Beurteilung der Qualität und Funktionalität isolierter, translatierender Ribosomen vorgestellt.Die Beobachtung eines eindeutigen Bands in Polyacrylamidgelen weist auf das Vorhandensein von Polypeptiden hin, die an die biotinmarkierten mRNA-Moleküle gebunden sind, die an das SMB angeheftet sind. Die Reinigung ribosomaler RNAs. Mithilfe dieses Verfahrens lässt sich ebenfalls der Nachweis erbringen, dass Ribosomen an diese biotinmarkierten mRNA-Moleküle gebunden sind.Die Zugabe von Puromycin, einem Antibiotikum, das die Peptidyltransferase-Aktivität des Ribosoms induziert, führt zum Bruch der naszierenden Peptid-tRNAs. Dies zeigt sich als Verschiebung des Migrationsmusters des isolierten Polypeptids in Polyacrylamidgelen. Zusammen weisen diese Daten darauf hin, dass an die SMB gebundene, biotinmarkierte mRNA funktionstüchtige Ribosomen mit Peptid-tRNAs enthält.Die Isolierung von translatierenden Ribosomen, die spezifische Peptid-tRNAs enthalten, ermöglicht die Untersuchung der Wirkung von Peptid-tRNA-Antibiotika und anderen Molekülen auf die Ribosomenfunktion und -struktur. In den hier dargestellten Beispielen hemmen das Antibiotikum S-Parsamycin und die Aminosäure Tryptophan die hydrolytische Spaltung des naszenten TNAC-tRNA-Peptid-tRNA durch RF2 in den isolierten Ribosomen.Die Wechselwirkung von Tryptophan oder Sparsomycin mit dem Ribosom induziert ebenfalls strukturelle Veränderungen in einigen Nukleotiden, die die 23 S-R-R-N-A des translatierenden Ribosoms bilden. Ist die Methode einmal beherrscht, kann der Hauptteil dieser Technik innerhalb von fünf Stunden ordnungsgemäß durchgeführt werden, wenn man diese Vorgehensweise befolgt. Andere Methoden wie die Kryo-EM oder zusätzliche strukturelle Analysen können durchgeführt werden, um weitere Fragen zur Struktur von Ribosomen, die einzigartige Pepin-RNA enthalten, zu beantworten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Extraktion des Übersetzens Ribosomen aus eukaryotischen Zellen. Sobald extrahiert, Ribosomen in monosomes und Polyribosomen durch Saccharose-Gradienten Fraktionierung getrennt, um verschiedene ribosomale Populationen analysiert werden. Als solche ist diese Methode der Goldstandard für die Untersuchung der Regulation der Translation.

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Eine Technik zur translationalen Pause Sites auf mRNA zu identifizieren beschrieben wird. Dieses Verfahren beruht auf der Trennung entstehenden Polypeptide ansammeln auf Ribosomen während der in vitro Translation einer Ziel-mRNA, durch die Größe Analyse der naszierenden Ketten mit Hilfe eines denaturierenden Gelelektrophorese gefolgt basiert.

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

Wir beschreiben hier eine Technik, die inzwischen routinemäßig eingesetzt wird, um stabil gebundene Ribosomen entstehenden Kette Komplexen (RNC) zu isolieren. Diese Technik nutzt die Entdeckung, dass ein 17 Aminosäuren langes SecM "Verhaftung Sequenz" können Translationselongation in einem prokaryotischen aufzuhalten...

Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Dieses Protokoll stellt wesentliche Änderungen Polyribosom Fraktionierung, um die translatome von in vivo ZNS-Proben zu untersuchen. Es ermöglicht umfassende Beurteilung der Übersetzung und der Transkriptionsregulation durch die Isolierung und der Vergleich der Gesamt-RNA gebunden Ribosomen-RNA-Fraktionen.

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Viele mRNAs mitochondriale Proteine ​​kodieren, sind mit der äußeren Mitochondrien-Membran verbunden. Wir beschreiben eine subzellulärer Fraktionierung Verfahren auf Isolierung von Hefe-Mitochondrien mit den zugehörigen mRNAs und Ribosomen ab. Dieses Protokoll kann auf Zellen unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet, um die Mechanismen der mRNA-Lokalisierung und Übersetzung lokalisiert in der Nähe der Mitochondrien zeigen angewendet werden.

Isolierung von mRNAs Verbunden mit Hefe-Mitochondrien Study Mechanismen der lokalisierten Übersetzung

Ribosomen spielen eine zentrale Rolle bei der Proteinsynthese. Polyribosom (Polysomen) Fraktionierung durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation ermöglicht die direkte Bestimmung der Übersetzung Effizienz einzelner mRNAs auf einem genomweiten Maßstab. Darüber hinaus kann dieses Verfahren für die biochemische Analyse von Ribosomen und Polysomen-assoziierten Faktoren wie Chaperone und Signalmolekülen verwendet werden.

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Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) ist in der Lage, die zelltypspezifische Translation von mRNA zu erfassen. Hier berichten wir über das erste TRAP-Protokoll, das sich der Isolierung von mRNA in seltenen Zellpopulationen von Drosophila-Embryonen widmet.

TRAP-rc, Translating Ribosom Affinitätsreinigung von Rare Zellpopulationen<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos

Wir stellen eine Technik zur schnellen Stabilisierung translationaler (Proteinbiosynthese) Komplexe mit Formaldehydvernetzung in lebenden Hefe- und Säugetierzellen vor. Der Ansatz ermöglicht die Sezierung transienter Zwischenprodukte und dynamischer RNA:Protein-Interaktionen. Die vernetzten Komplexe können in mehreren nachgelagerten Anwendungen eingesetzt werden, z. B. in Deep-Sequencing-basierten Profilierungsmethoden, Mikroskopie und Massenspektrometrie.

Schnelle In-vivo-Fixierung und Isolierung translationaler Komplexe aus eukaryotischen Zellen

Dieses Protokoll beschreibt, wie ein Polysomenprofil generiert wird, ohne automatisierte Gradientenerzeuger oder Gradientenfraktionierungssysteme zu verwenden.

Polysomenprofilierung ohne Gradientenerzeuger oder Fraktionierungssysteme

Co-translationale Interaktionen spielen eine entscheidende Rolle bei Modifikationen, Targeting-, Faltungs- und Montagepfaden der entstehenden Kette. Hier beschreiben wir Selective Ribosome Profiling, eine Methode zur in vivo, direkten Analyse dieser Wechselwirkungen im Modell Eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

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Die AviTag-spezifische standortbeschränkte Beleuchtungsverstärkte Biotinylierung (ALIBi) ist eine neuartige optogenetetisch aktivierte Methode, die zur Markierung und Affinitätsreinigung subzellulärer Populationen von Ribosomen für die nachgelagerte Sequenzierung und proteomische Analyse entwickelt wurde.

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Erfahren Sie die Isolierung von Ribosomen mit Peptidyl-tRNAs durch in vitro Translation und magnetische Extraktion. Diese Methode ermöglicht präzise funktionelle und strukturelle Analysen der Translation.

Isolierung von Ribosomen übersetzen enthaltend Peptidyl-tRNAs für funktionelle und strukturelle Analysen

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