Isolierung und Kultivierung von Zellen aus dem Nephrogene Zone der embryonalen Maus Niere

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Primärkultur von Zellen der nephrogenen Zone aus dem sich entwickelnden Nierengewebe zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst Nieren von 17,5-tägigen Embryonen isoliert werden. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, die Nierenkapseln zu entfernen.

Anschließend wird eine begrenzte enzymatische Verdauung der Organe durchgeführt, um Kap-Mesenchym- und kortikale Stromazellen aus der nephrogenen Zone zu lösen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen auf Fibronectin zu plattieren und in einem serumfreien Medium zu kultivieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine gereinigte Zellpopulation der nephrogenen Zone durch Immunfärbung spezifischer Marker nachweisen.

Obwohl diese Methode zur Untersuchung der Zellsignalübertragung verwendet werden kann, eignet sie sich auch zum Verständnis der Substratbedingungen für die zelluläre Expansion. Zum Beispiel wird bei Einpflanzungstechniken der Ablauf von Derek Adams, einem Techniker in meinem Labor, und Aaron Brown, einem Postdoktoranden in meinem Labor, demonstriert. Nachdem die notwendigen Lösungen vorbereitet und die Zellkulturschalen gemäß dem schriftlichen Protokoll behandelt wurden, beginnen Sie die Dissektion der embryonalen Mausniere, indem Sie das Muttertier am Tag E 17,5 opfern.

Entfernen Sie gemäß den Richtlinien Ihrer Institution die Gebärmutter und geben Sie sie in eine Petrischale, die mehrere Milliliter Docos-Säure, gepufferte Salzlösung oder DPVS mit Calcium und Magnesium enthält. Entfernen Sie unter dem Stereomikroskop mit einer Pinzette jedes Embryo und enthaupten Sie es mit einem weiteren Paar Pinzetten. Sobald der gesamte Wurf aus der Gebärmutter entfernt und enthauptet wurde, überführen Sie die Embryonen in eine saubere Petrischale, die so viel DPBS mit Calcium und Magnesium enthält, dass die Embryonen bedeckt sind.

Lassen Sie so viel Blut und Gewebetrümmer wie möglich bei jedem Embryo zurück, und führen Sie mit einer Pinzette einen kreisförmigen Schnitt in der Bauchwand auf Höhe der Nabelgefäße durch. Danach legen Sie den Embryo auf den Rücken und fixieren die Schultern mit einem Satz Pinzetten. Mit einem zweiten Satz Pinzetten entfernen Sie die inneren Organe vom Lungengewebe bis zur Harnblase.

Die Nieren befinden sich am Rücken der inneren Organe angesetzt. Trennen Sie anschließend vorsichtig die Nieren vom übrigen Organgefüge, wobei darauf zu achten ist, dass die Nieren miteinander verbunden bleiben.

Halten Sie das Gewebe zwischen den Nieren mit einer Pinzette fest und greifen Sie mit der anderen Pinzette die an der Kapsel einer der Nieren befestigte Nebenniere. Lösen Sie vorsichtig die Kapsel von der Niere. Achten Sie darauf, die Niere nicht zu beschädigen.

Entfernen Sie sorgfältig jegliche verbleibende Kapsel aus der Niere sowie den Uterus, falls dieser noch angeheftet ist. Wiederholen Sie den Vorgang mit der verbleibenden Niere. Schneiden Sie abschließend eine Transferpipette auf einen geeigneten Durchmesser zu und überführen Sie die Nieren vorsichtig in ein fünf Milliliter fassendes Polystyrolröhrchen mit HBSS.

Wiederholen Sie die Nierenisolierung für jeden Embryo und sammeln Sie die Nieren im Reagenzglas, bis zu acht Nieren pro Gefäß, unter sterilen Bedingungen. Beginnen Sie den enzymatischen Verdauungsprozess, indem Sie zunächst die HBSS-Lösung aus dem 5-Milliliter-Reagenzglas mit den Nieren mit einer Pipette entfernen. Achten Sie darauf, die Nieren nicht zu berühren, und geben Sie sofort 1,5 Milliliter Kollagenase, eine Pankreatin-Verdauungslösung, hinzu.

Wiederholen Sie dies für jedes Röhrchen mit Nieren und verschließen Sie die Röhrchen. Anschließend im Mutaschüttler bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten inkubieren. Kurz vor Ende der Inkubation drei Mikroliter einer Einheit pro Mikroliter DNA in ein frisches Polystyrolröhrchen mit einem Volumen von fünf Milliliter für jeden durchzuführenden Verdau geben.

Nach der Inkubation das Verdauungsgemisch schnell aus dem Inkubator nehmen und 75 Mikroliter FBS hinzufügen, dreimal umstülpen, um es zu mischen. Anschließend zwei Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Danach 1,4 Milliliter der Zellsuspension in ein fünf Milliliter fassendes Polystyrolröhrchen überführen, das das DNA-Gemisch enthält, und auf einen Mutator in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator für 10 Minuten stellen.

Nach der Inkubation jede Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Einwegröhrchen überführen und bei 325 × g für fünf Minuten zentrifugieren. Anschließend den Überstand entfernen, die Röhrchen erneut bei 325 × g für fünf Minuten zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Pellet durch fünf- bis sechsmaliges Auf- und Abpipettieren in einem Milliliter 5 % FBS in HBSS.

Decken Sie jedes Röhrchen ab, bevor Sie mit der nächsten Probe fortfahren. Nach der Zentrifugation entfernen Sie das SNAT und geben 500 µL KSFM mit Zusätzen zu jedem Röhrchen hinzu, nachdem Medium zu allen Röhrchen hinzugefügt wurde. Lösen Sie jedes Zellpellet vorsichtig auf, indem Sie es fünf- bis sechsmal mit einer 1-mL-Mikropipette auf- und abpipettieren. Vereinigen Sie alle Zellsuspensionen in einem frischen 5-mL-Polystyrolröhrchen.

Filtern Sie die Zellsuspension nun durch eine vorbenetzte 40-Mikron-Zellsiebkappe und sammeln Sie das Durchflussvolumen in einem neuen Polystyrolröhrchen. Berühren Sie den Sieber nicht mit der Pipettenspitze, sobald das gesamte Durchflussvolumen gesammelt wurde. Filtern Sie das Durchflussvolumen ein zweites Mal durch einen neuen, vorbenetzten Zellsieb.

Entfernen Sie das Sieb und verschließen Sie das Röhrchen mit einem frischen sterilen Verschluss von einem neuen Röhrchen. Zählen Sie die Zellen und säen Sie sie mit einer Dichte von 100.000 bis 200.000 Zellen pro Quadratzentimeter in KSM mit Zusätzen in eine faserkodierte Kulturplatte aus. Lassen Sie die nephrogene Zonen-Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid zwei bis vier Stunden lang regenerieren und anheften, bevor eine Stimulation für Experimente erfolgt.

Hier ist ein Phasenkontrastbild zu sehen: eine 20×-Aufnahme von Nephrogenen-Zonen-Zellen, die mit 200.000 Zellen pro Quadratzentimeter ausgesät und 24 Stunden lang kultiviert wurden. In diesem Bild wurden die Zellen der nephrogenen Zone mit einem Anti-PAX2-Antikörper gefärbt, der spezifisch für Nephron-Progenitorzellen ist und rot dargestellt wird, während die Kerne blau mit DAPI kontragefärbt wurden.

Eine Phasenkontrastaufnahme eines Clusters von Nephron-Progenitoren ist bei 40-facher Vergrößerung dargestellt. Zur weiteren Demonstration der Spezifität wurden nephrogene Zonen-Zellen aus Embryonen isoliert, die laxy unter Kontrolle des Fox-D1-Promotors tragen, der in der stromalen Zellpopulation exprimiert wird. Innerhalb der nephrogenen Zone der sich entwickelnden Niere wurden die Zellen anschließend mit DAPI Titan fi für Kerne in Blau, F-Aktin in Grün und Anti-Beta-Galaktosidase in Rot gefärbt.

Wenn einmal beherrscht, kann eine Monoschicht-Primärkultur von Zellen der nephrogenen Zone in etwa zwei Stunden erzeugt werden. Diese Kulturen ermöglichen schnelle und hochdurchsatzfähige Untersuchungen von Zellsignalwegen in der Entwicklung von Nephron-Progenitoren und eignen sich hervorragend für die Virus-Transduktion sowie die Behandlung mit rekombinanten Proteinen und kleinen Molekülen. Weitere Zellsortierverfahren können ebenfalls verwendet werden, um spezifische Zelltypen aus diesen Kulturen zu isolieren.