Name: Geändert ES / OP9 Co-Kultur-Protokoll bietet eine verbesserte Charakterisierung von hämatopoetischen Progeny (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Lernen Sie die Differenzierung muriner embryonaler Stammzellen in hämatopoetische Linien mittels mStrawberry OP9-Stromazellen. Diese Methode ermöglicht die vollständige Charakterisierung aller ES-abgeleiteten Nachkommen zur Untersuchung hämatopoetischer Defekte.

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Wir bedanken uns bei U. Ganapati für die Errichtung und Prüfung der mStrawberry OP9 Zelllinie. Darüber hinaus danken wir H. Shafifor ihre Unterstützung bei der Co-Kultur. HP wird durch ein Stipendium des National Heart, Lung, and Blood Institute (F31HL087714) (HP) unterstützt. Der Inhalt dieser Arbeit ist ausschließlich in der Verantwortung des Autors und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des National Heart, Lung, and Blood Institute oder die National Institutes of Health (NIH). Die UCLA Durchflusszytometrie Core Facility wird durch die NIH (CA-16042 und AI-28697), der Jonsson Cancer Center der UCLA AIDS-Institut und der UCLA School of Medicine unterstützt.

1. Vorbereitung der ES-Zellen <ol><li> Kultur ES-Zellen nach Standardprotokoll für Ihre speziellen Zell-Linie. Achten Sie darauf, genug ES-Zellen auf den Teller vorzubereiten auf der mStrawberry OP9 Zellen für Tag 0 (ES-Zellen werden auf 1x10 ^ 3 Zellen pro cm 2 am Tag 0 beschichtet werden) </li></ol> 2. Vorbereitung der OP9 Zellen <ol><li> Bevor wachsenden mStrawberry OP9 Zellen, bereiten die OP9 Nährmedien OP-9 Zellkulturmedium <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Lager </td><td> Endkonzentration. </td><td> Volumen (ml) </td></tr><tr><td> aMEM </td><td></td><td></td><td> 39,5 </td></tr><tr><td> FBS (OP-9 getestet) </td><td> 100% </td><td> 20% </td><td> 10 </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> 100X (200mm) </td><td> 2mM </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 50 mL </td></tr></tbody></table> Lagerung bei 4 ° C lagern und innerhalb von einer Woche Vorbereitung </li><li> Um mStrawberry OP9 Zellen zu erhalten, müssen Medien alle 2 Tage und Zellen sollten vor der Zellen zu erreichen Konfluenz (Subkultur bei 70-90% Konfluenz) subkultiviert werden. mStrawberry OP9 Zellkulturen sind nie über 90% Konfluenz gezüchtet, wie diese in ihrer Differenzierung in Adipozyten führt. Siehe Abbildung 3. <ol class="lalpha"><li> Subculture Zellen durch Waschen der Zellen 2X mit PBS (oder 1x mit PBS + 1x 0,1% mit Trypsin-EDTA) </li><li> Add vorgewärmten 0,1% Trypsin-EDTA bei 37 ° C für 5 Minuten (oder bis die Zellen zu lösen) </li><li> Wenn die Zellen abgelöst haben, fügen OP-9 Wachstumsmedium. Transfer-Zellen auf eine 50 ml konischen Rohr. </li><li> Pellet-Zellen bei 300 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Überstand. </li><li> Die Zellen in frischem mStrawberry OP9 Nährmedien </li><li> Platte Zellen bei einer Dichte von 10 4 Zellen / cm 2 </li><li> Wachsen mStrawberry OP9 Zellen bis zur Konfluenz ab 3 Tage vor Tag für Co-Kultivierung ES-Zellen (Tag 0, Tag 5 oder Tag8 / 9 des Experiments) benötigt </li></ol></li></ol> 3. ES / mStrawberry OP9 Co-Kultur <ol><li> Bereiten Sie Co-Kultur Differenzierung Medien <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Lager </td><td> Finale </td><td> Volumen (ml) </td></tr><tr><td> aMEM </td><td></td><td></td><td> 39,5 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 100% </td><td> 20% </td><td> 10 </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> 200 mM </td><td> 2mM </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 50 mL </td></tr></tbody></table></li><li> mStrawberry OP9 Zellen (Tag -3) <ol class="lalpha"><li> IMMER Subculture OP9 Zellen am Tag -3, so dass Sie konfluenten Schichten mStrawberry OP9 Zellen für Tag 0 der Co-Kultur haben. Siehe Abbildung 4b. Platte mStrawberry OP9 Zellen bei 1x10 4 / cm 2 auf Konfluenz am Tag 0. Achten Sie darauf, Subkultur zusätzliche Zellen für Tag 5 und Tag 8 / 9 für die Fortsetzung der Co-Kultur. </li></ol></li><li class="jove_content"> ES / mStrawberry OP9 Co-Kultur Set-Up (Tag 0) <ol class="lalpha"><li class="jove_content"> Wash ES-Zellen 2x mit PBS </li><li> Trypsinize ES-Zellen mit vorgewärmten 0,25% Trypsin-EDTA, Inkubation 5min bei 37 ° C </li><li> Add Co-Kultur Differenzierung Medien Zellen </li><li> Pellet ES-Zellen bei 400xg, 5-7min, RT. Überstand </li><li> Die Zellen in Co-Kultur Differenzierung Medien </li><li> Entfernen Sie das Medium aus mStrawberry OP9 Zellen </li><li> Add Co-Kultur Differenzierung Medien mStrawberry OP9 Flaschen </li><li> Platte 1x10 3 ES-Zellen / cm 2 bis Flasche mStrawberry OP9 Zellen. Inkubieren Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 mit Feuchtigkeit. </li></ol></li><li> mStrawberry OP9 Zellen (Tag 2) <ol class="lalpha"><li> Subculture mStrawberry OP9 so dass Sie konfluenten Schichten mStrawberry OP9 Zellen für Tag 5 der Co-Kultur. Platte mStrawberry OP9 Zellen bei 1x10 4 / cm 2 auf Konfluenz am Tag 5 (wie in Schritt 3,2). Achten Sie darauf, Subkultur zusätzliche Zellen für Day 8 / 9, falls erforderlich (wie in Schritt 2,2). </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9 Co-Kultur (Tag 3) <ol class="lalpha"><li> Entfernen Sie vorsichtig Medium von Co-Kultur und ersetzen mit frischen Co-Kultur Differenzierungsmedium </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9 Co-Kultur (Tag 5) <ol class="lalpha"><li> Sorgfältig waschen Co-Kulturen 2x mit PBS </li><li> Trypsinize Zellen mit vorgewärmten 0,25% Trypsin-EDTA </li><li> Wash-Zellen aus Kolben mit Co-Kultur Differenzierung Medien </li><li> Pellet-Zellen bei 400xg, Discard 7min, RT. Überstand </li><li>Add Co-Kultur Differenzierung Medien Zellen. Verwenden Sie eine 21-Gauge bluntended Nadel Zellen resuspendieren und für einzelne Zellsuspension gewährleisten </li><li> Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Sollte 100-150 fachen Anstieg der ES-Zell-Zahl von Tag 0 zu haben. </li><li> Re-Seed 6.48x10 4 / cm 2 - 7.76x10 4 / cm 2 Co-Kultur-Zellen auf eine neue Ebene der konfluent, mStrawberry OP9 Zellen </li><li> Tag 5 ASSAYS-Remaining Co-Kultur-Zellen können für die Durchflusszytometrie-Analyse, cytopreps (30K-Zellen), Chip-Assays, etc. verwendet werden </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9 Co-Kultur (Tag 8 / 9 und Tag 12) <ol class="lalpha"><li> Entfernen Differenzierung Medien von Kolben und speichern. Wash Monoschicht 1x mit PBS, um hämatopoetische Zellen in Suspension zu entfernen. Nicht wegwerfen hämatopoetischen Zellen. </li><li> Trypsinize adhärente Zellen mit vorgewärmten 0,25% Trypsin-EDTA </li><li> Wash-Zellen aus Kolben mit ES Differenzierung Medien und in den blutbildenden Zellen in Suspension = gefunden </li><li> Pellet-Zellen bei 400xg, Discard 7min, RT. Überstand </li><li> Add Co-Kultur Differenzierung Medien oder PBS zu den Zellen. Verwenden Sie eine 21-Gauge bluntended Nadel Zellen resuspendieren und für einzelne Zellsuspension Zählen von Zellen mit einer Zählkammer zu gewährleisten. </li><li> Co-Kultur kann für 14 Tage fortgesetzt werden, um reifer hämatopoetischer Vorläuferzellen durch erneutes Seeding Co-Kultur-Zellen zu bewerten auf einer neuen Ebene der konfluent, mStrawberry OP9 Zellen an Tag 8 oder 9 und dann wieder am 12. Tag. Re-Seed optimierte Zellzahl auf gewünschte Zelle Erholung für den Tag des Tests basiert. </li></ol></li><li> Evaluation von ES-derived Nachkommen (Tag 1-14). ES-derived Nachkommen können an jedem Tag der Co-Kultur von flow Aussortieren mStrawberry negativen Zellen (ES-derived Nachkommen) ausgewertet werden. <ol class="lalpha"><li> Entfernen Differenzierung Medien von Kolben und speichern. Wash Monoschicht 1x mit PBS, um hämatopoetische Zellen in Suspension zu entfernen. Nicht wegwerfen hämatopoetischen Zellen. </li><li> Trypsinize adhärente Zellen mit vorgewärmten 0,25% Trypsin-EDTA </li><li> Wash-Zellen aus Kolben mit Co-Kultur Differenzierung Medien und in den blutbildenden Zellen in Suspension gefunden </li><li> Pellet-Zellen bei 400xg, 7min, RT. Überstand </li><li> Die Zellen mit 21-Gauge bluntended Nadel und zählen </li><li> ES-derived Nachkommen (mStrawberry negativen Zellen) kann Flow aus mStrawberry positive OP9 Zellen sortiert werden. ES-derived Nachkommen können dann mittels Durchflusszytometrie-Analyse, cytopreps, ChIP-Assays, etc. charakterisiert werden </li></ol></li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. ES / mStrawberry OP9 Co-Kultur-System. Unser Labor verwendet eine in vitro ES-Zell-Co-Kultur Systems zu modellieren hämatopoetischen Entwicklung. In dieser Co-Kultur-System, zu differenzieren ES-Zellen in hemangioblasts am Tag 5, wenn sie auf eine konfluente Schicht von mStrawberry OP9 Zellen gelegt. Als Co-Kultur geht, sind hämatopoetischen Vorläufer an Tag 8 vorhanden, während terminal differenzierten hämatopoetischen Linien von Tag 14 erscheinen. Die Pfeile zeigen die Tage der Differenzierung bei Passagieren der ES-derived Nachkommen auf neue konfluenten Schichten mStrawberry OP9 Zellen in notwendig. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Proper ES-Zell-Differenzierung. ES-Zellen werden auf eine konfluente Schicht von mStrawberry OP9 am Tag 0 ausgesät. ES-derived Nachkommen beginnen sichtbar zu werden an Tag 3 der Differenzierung, der mit ES-derived Nachkommen aussehen wie eine Ansammlung von Zellen mit einer definierten Grenze oder Anfang an einen Quirl Muster zu bilden. Hemangioblasts, die das gemeinsame mesodermalen Vorläufer für die Endothel-und hämatopoetischen Linien sind, sollte wie bis Quirle von Zellen an Tag 5 angehäuft. Für Co-Kultur Zeiträume von mehr als 5 Tage sollte ES-derived Nachkommen als Cluster von hämatopoetischen Zellen erscheinen. Zwei bis vier celled Cluster, an Tag 6 / 7, erscheinen soll und wachsen in größeren Zellverbänden von Tag 8 / 9 der Co-Kultur. Andere ES abgeleitet Nachkommen finden sich auch fest an die Anhänger Stromazellen Schicht gebunden. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Erfolglose ES-Zell-Differenzierung. Die Ergebnisse dieser Co-Kultur widerspiegeln unsachgemäße ES-Zell-Differenzierung. Beachten Sie, wie die ES-derived Nachkommen nicht in einem Quirl Muster am Tag 5 erscheinen. Das Fehlen von Zellen in einem Quirl Muster weist auf unsachgemäße hemangioblast Bildung. Wenn hemangioblast nicht richtig entwickeln zu tun, dann weiter Co-Kultur wird in verkümmerten hämatopoetischen Linie Differenzierung führen. Co-Kulturen mit unsachgemäße hemangioblast Bildung muss verworfen werden. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. mStrawberry OP9 Zellkulturen. (A) mStrawberry OP9 Zelle sind subkultiviert70-90% Konfluenz. (B) Für eine korrekte Differenzierung, sind ES-Zellen und ES-derived Nachkommen auf einen übermäßig konfluente Schicht von mStrawberry OP9 Zellen gelegt. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Vertreter ES / mStrawberry OP9 Co-Kultur Strömungsprofil. Alle ES-derived Nachkommen sind mStrawberry negativen Zellen und kann Flow aus der mStrawberry OP9 Zellen sortiert werden. mStrawberry negativen Zelle Tor wurde mit einem traditionellen ES/OP9 Co-Kultur.

<ol><li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origins+of+mammalian+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Embryonic origins of mammalian hematopoiesis.</a> Exp Hematol. 31, 1160-1160 (2003).</li>
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</ol>

Proper Differenzierung von ES-Zellen auf konfluente Schicht von mStrawberry OP9 Zellen führt zur Produktion von Flk1 + hemangioblasts am Tag 5 der Co-Kultur. Hemangioblasts sollte wie bis Quirle von Zellen, wie in Abbildung 1 beobachtet angehäuft. Für den Rest der Co-Kultur sollte sichtbar ES-derived Nachkommen als Cluster von hämatopoetischen Zellen (Abbildung 1) erscheinen. Am Tag 6 / 7 zwei vor vier Zellhaufen erscheinen soll und wachsen in größeren Zellverbänden (beide haftend und in Suspension) von Day 8 / 9 der Co-Kultur. Andere ES abgeleitet Nachkommen finden sich auch nahtlos in die adhärenten Stromazellen Schicht gebunden. Obwohl nicht im Protokoll aufgeführt sind, ist es entscheidend, Pre-Test der FBS in der ES Wachstumsmedium, die mStrawberry OP9 Wachstum Medien und die ES / mStrawberry OP9 Differenzierung Medien eingesetzt. Richtig getestet Serum sollte richtiges Wachstum von mStrawberry OP9 Zellen, sowie, korrekte Differenzierung von ES-Zellen in Co-Kultur bis Tag 5 der Differenzierung zu gewährleisten. Als Alternative oder zusätzlich zu mStrawberry OP9 Zellen können OP9 Zellen bestrahlt, bei 8000 rad sein, vor der Aussaat bei Konfluenz (7.8x10 4 Zellen / cm 2). Die Bestrahlung von Zellen erlaubt OP9 für die Beseitigung der wiederholten Neuplattierungen Schritte, sowie, ermöglicht fast vollständige Beseitigung der alten, verunreinigen OP9 Zellen aus Downstream-Assays. OP9 Zellen wurden entwickelt, um mStrawberry Protein, das durch Transduktion OP9 Zellen mit 3ug/mL eines lentiviralen Vektor, mStrawberry unter der Kontrolle eines CMV-Promotors (pRRLsin-CMV-Vektor, UCLA-Vektor-Kern) zu äußern. Standard ES/OP9 Co-Kultur-Protokolle beinhalten die Vermittlung von ES-Zellen auf eine konfluente Schicht OP9 Zellen, sowie eine Tag 5 Neuplattierungen Schritt zur Reduzierung alt, verunreinigen OP9 Zellen aus Zellpassage. Darüber hinaus sind nur hämatopoetischen Zellen in Suspension gefunden für die Bewertung von ES-derived Nachkommen entfernt. Doch sowohl mit einem Neuplattierungen Schritt und die Ernte von nur Suspensionszellen eine potentiell vermisst eine beträchtliche Anzahl von Entwicklungsländern ES-abgeleitete hämatopoetische Zellen. Dieses Problem wird es wichtig, Adresse wenn man versucht, hämatopoetischen Defekte mit KO-ES-Linien verbunden zu charakterisieren. Um dieses Problem zu umgehen unserem Labor verwendet ein modifiziertes Co-Kultur, durch den Einsatz von mStrawberry-exprimierenden OP9 Zellen. Dadurch ist gewährleistet, dass alle ES Nachkommen der anhaltenden Co-Kultur sind an Tag 5 übertragen, und für die Ernte aller ES-derived Nachkommen für Downstream-Assays. Diese Änderung stellt eine nützliche Tools in der Evaluierung und Charakterisierung von hämatopoetischen Nachkommen von Mensch und Maus-ES-Linien abgeleitet. Das ES-mStrawberry OP9 Co-Kultur-Modell fasst die verschiedenen Stufen primitive und definitive Hämatopoese. Bei der Untersuchung der frühesten Stadien der hämatopoetischen Entwicklung, nutzen viele Menschen die BL-CFC (Blast-wie koloniebildenden Zellen)-Assay, der die Entwicklung der hemangioblast aus der ES-Zellen zu beurteilen. Während die BL-CFC-Assay ist ein nützliches Werkzeug bei der Untersuchung von frühen hämatopoetischen Entwicklung, weist die mStrawberry-ES Co-Kultur-Systeme zu erhöhen Dienstprogramm, wie es für die Beurteilung der hemangioblast sowie mehr erwachsene hämatopoetischen Linien ermöglicht. Frühere Arbeiten mit traditionellen OP9/ES und EB Differenzierung Protokolle hat gezeigt, dass zusätzliche Faktoren vielleicht notwendig, wie die Überexpression von HOXB4, um daraus langfristig repopulating hämatopoetischen Stammzellen in vitro. Zusätzliche Arbeit ist zu prüfen, ob mStrawberry negativ, sortiert ES-derived Bevölkerung wahr hämatopoetischen Stammzellen enthalten.

OP-9 Zellen Wartung Medium Lager-Komponenten <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> aMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Omega Scientific </td><td> FB01 </td><td> Pre-Tested </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> CellGro </td><td> 25 bis 005-CI </td><td> 200 nM </td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 07901 </td><td></td></tr></tbody></table> ES/OP-9 Zelldifferenzierung Medium Lager-Komponenten <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> aMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td> Pre-Tested </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> CellGro </td><td> 25 bis 005-CI </td><td> 200 mM </td></tr><tr><td> PBS (ohne Ca 2 + und Mg 2 +) </td><td> CellGro </td><td> 21 bis 031-CV </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 07901 </td><td></td></tr></tbody></table>

geändert es / op9 co-kultur-protokoll bietet eine verbesserte charakterisierung von hämatopoetischen progeny

Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

Die in vitro Differenzierung von ES-Zellen zu einer hämatopoetischen Zelle Schicksal ist nützlich, wenn das Studium Zellpopulationen, die schwer zu in vivo und zur Charakterisierung der frühesten Gene in Blutbildung beteiligt sind, ohne sich mit embryonalen Letalitäten viel zuzugreifen. Die ES/OP9 Co-Kultur-System wurde ursprünglich entwickelt, um hämatopoetische Nachkommen zu produzieren, ohne über die Produktion von Makrophagen, die OP9 stromalen Zelllinie, die aus der Schädeldecke des Osteopetrose mutierten Mäusen, die funktionelle M-CSF Mangel abgeleitet ist. Die in vitro ES/OP9 Co-Kultur-System kann verwendet werden, um frühzeitig hämatopoetischen Entwicklung rekapitulieren werden. Wenn auf OP9 Stromazellen kultiviert, differenzieren ES-Zellen in Flk-1 + hemangioblasts, hämatopoetischen Vorläuferzellen und schließlich reifen, terminal differenzierten Linien. Die Standard-ES/OP9 Co-Kultur-Protokoll beinhaltet die Vermittlung von ES-Zellen auf eine konfluente Schicht von OP9 Zellen, sowie periodische Neuplattierungen Schritte zur Entfernung alter, verunreinigen OP9 Zellen. Darüber hinaus beinhalten aktuelle Protokolle Auswertung nur die blutbildenden Zellen in Suspension und sind nicht für die Bewertung von ES-derived Nachkommen an jedem Tag der Differenzierung optimiert. Doch mit Neuplattierungen Schritte und die Ernte von nur Suspensionszellen eine potentiell fehlt ein großer Teil der ES-derived Nachkommen und Entwicklung hämatopoetischen Zellen. Dieses Problem wird es wichtig, Adresse wenn man versucht, hämatopoetischen Defekte mit KO-ES-Linien verbunden zu charakterisieren. Hier beschreiben wir eine modifizierte ES / mStrawberry OP9 Co-Kultur, die für die Beseitigung der Verunreinigung OP9 Zellen aus Downstream-Assays ermöglicht. Diese Methode ermöglicht die komplette Auswertung aller ES-derived Nachkommen an allen Tagen der Co-Kultur, was zu einer hämatopoetischen Differenzierung Muster, die mehr entspricht direkt der hämatopoetischen Differenzierung Muster innerhalb der Embryo beobachtet.

mStrawberry OP9 Zellen ermöglichen vollständige Bewertung aller ES-derived Nachkommen von Co-Kultur.

Geändert ES / OP9 Co-Kultur-Protokoll bietet eine verbesserte Charakterisierung von hämatopoetischen Progeny

Die In-vitro-Differenzierung von ES-Zellen in Richtung eines hämatopoetischen Zellschicksals ist nützlich bei der Untersuchung von Zellpopulationen, die in vivo schwer zugänglich sind ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, murine embryonale Stammzellen in verschiedene primitive und definitive hämatopoetische Linien zu differenzieren. Um alle ES-Nachkommen zu charakterisieren, wird die Differenzierung muriner hämatopoetischer Zellen erreicht, indem ES-Zellen auf eine konfluente, fluoreszenzmarkierte M-strawberry-OP9-Stromazellschicht gegeben werden. Jeder Tag der Differenzierung bzw. der Co-Kultur repräsentiert die verschiedenen Stadien der hämatopoetischen Entwicklung zum jeweils geeigneten Zeitpunkt der Ernte.Unterschiedliche ES-Zell-Nachkommen können durch Zellsortierung von der M-Strawberry-OP9-Stromazelllinie getrennt werden. Dieses ES-Differenzierungsprotokoll bildet die primitive und definitive Hämatopoese nach, wie sie in vivo beobachtet wird, und kann verwendet werden, um hämatopoetische Defekte, die mit Knockout-ES-Zelllinien assoziiert sind, zu charakterisieren, ohne Embryonen einzusetzen. Hallo, herzlich willkommen im Labor von Dr. Judith Gassen am Johnson Comprehensive Cancer Center der UCLA.Mein Name ist Alicia Poz. Der Hauptvorteil der Technik, die ich Ihnen heute zeigen werde, gegenüber bestehenden ESO-neun-Kokultivierungsmethoden besteht darin, dass dieses Verfahren die Passage aller Zellen vom Tag fünf und Tag acht sowie die vollständige Trennung aller aus ES-Zellen stammenden Nachkommen ermöglicht. Die OP9-Stromazellen werden in OP9-Zellkulturmedium kultiviert, das alle zwei Tage gewechselt werden muss.Die OP9-Zellen sollten drei Tage vor der erforderlichen Verwendung für die Co-Kultivierung unterkultiviert werden. Es ist wichtig zu beachten, dass die OP9-Zellen während der Pflege niemals bei einer Dichte über 90 % Konfluenz gehalten werden dürfen. Spülen Sie die Zellen zunächst zweimal mit PBS, fügen Sie dann vorgewärmtes 0,1 %iges Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie für fünf Minuten, bis sich die Zellen gelöst haben. Geben Sie OP9-Zellkulturmedium hinzu und überführen Sie die Zellen in ein 50-Milliliter-Konischgefäß.Pelletieren Sie die Zellen in einem Röhrchen durch Zentrifugation bei 300 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur, entfernen Sie das Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in frischem M-Strawberry-OP9-Zellkulturmedium. Säen Sie die Zellen mit einer Mindestdichte von 10⁴ Zellen/cm² aus, am Tag, an dem das Co-Kultur-Experiment beginnt. Die OP9-Zellen, die vor drei Tagen subkultiviert wurden, sollten konfluent sein. Die ES-Zellen sollten gemäß dem Standardprotokoll für Ihre spezifische Zelllinie kultiviert werden.Die ES-Zellen zweimal mit PBS und Trypsin mit 0,25 % Trypsin/EDTA waschen und fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend das Co-Kultur-Differenzierungsmedium zu den ES-Zellen geben und diese in 15-Milliliter-Konischflaschen überführen. Die ES-Zellen fünf bis sieben Minuten bei Raumtemperatur mit 400 × g pelletieren.Nach dem Entfernen des Überstandes resuspendieren Sie die ES-Zellen in Differenzierungsmedium für die Ko-Kultur. Verwenden Sie eine stumpfe Nadel mit 21 Gauge, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Zählen Sie die Zellen mithilfe von Trypanblau und einem Hämozytometer.Holen Sie nun den Kolben mit M-Erdbeere aus dem Inkubator. Entfernen Sie das Medium von den OP9-Zellen und geben Sie Co-Kultur-Differenzierungsmedium in den Kolben bzw. die Platte.Einmal 10 hoch drei ES-Zellen pro Quadratzentimeter auf jedes Gefäß mit M-strawberry-OP9-Zellen geben und die Zellen bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und Luftfeuchtigkeit inkubieren. Dies ist Tag null, und die Kokultur sollte wie folgt aussehen. Drei Tage nach Beginn der ES-M-strawberry-OP9-Kokultur.Überwiegend werden große, flache Zellklumpen aus ES-abgeleiteten Nachkommen mit klar definierten Grenzen beobachtet, und einige Zellwirbel beginnen sich zu bilden. Entfernen Sie vorsichtig das Medium aus der Kokultur und ersetzen Sie es fünf Tage nach Beginn der Kokultur durch frisches Differenzierungsmedium. Eine ordnungsgemäße Differenzierung der ES-Zellen auf einer konfluenten Schicht von M-strawberry-OP9-Zellen sollte zur Bildung von Hämantiblasten führen, die als aufgehäufte Zellwirbel erscheinen.Der kritischste Aspekt dieses Verfahrens ist die Gewährleistung einer ordnungsgemäßen Differenzierung am fünften Tag der Co-Kultur. Zu diesem Zeitpunkt können Sie die Hämangioblast-Kolonien nicht nur mikroskopisch, sondern auch makroskopisch erkennen. Waschen Sie die Co-Kultur vorsichtig zweimal mit PBS und lösen Sie die Zellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA auf Eis. Lösen Sie die Zellen vom Kolben mit ES-Differenzierungsmedium ab und überführen Sie sie in ein Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 ×g für sieben Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation das Überstand entfernen und frisches Medium hinzufügen. Anschließend die Zellen mit einer stumpfen Nadel mit 21 Gauge resuspendieren, um eine Einzelzell-Suspension sicherzustellen, und die Zellen mit einem Hämozytometer zählen; es sollte eine 100- bis 150-fache Zunahme der ES-Zellzahl ab Tag null erfolgen. Rekultivieren Sie die Zellen am Tag acht oder neun und am Tag 12 auf einer neuen Schicht konfluenter M-strawberry-OP9-Zellen. Zählen Sie die Zellen erneut. Entfernen Sie das Medium mit den hämatopoetischen Zellen und heben Sie es auf.Spülen Sie die Monoschicht einmal mit PBS, um die suspendierten hämatopoetischen Zellen zu entfernen. Geben Sie anschließend 0,25 % Trypsin-EDTA in den Kolben, warten Sie, bis die anhaftenden Zellen sich lösen, und waschen Sie die Zellen mit ES-Differenzierungsmedium aus dem Kolben. Fügen Sie diese Zellen den in Suspension befindlichen hämatopoetischen Zellen hinzu und pelletieren Sie die Zellen bei 400 ×g für sieben Minuten bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie die Zellen abschließend mit einer stumpfen 21-Gauge-Nadel und zählen Sie die Zellen. Die Zellen sind nun bereit, erneut ausplattiert zu werden oder in nachgeschalteten Assays verwendet zu werden.Das ES-M-Erdbeer-OP-neun-Kokultursystem kann verwendet werden, um die beschriebene hämatopoetische Entwicklung zu modellieren. Hier ist eine Übersicht über den Zeitverlauf der Kokulturtage, an denen differenzierte ES-Nachkommen auf neue M-Erdbeer-OP-neun-Zellen übertragen werden müssen, angegeben. Eine korrekte Differenzierung der ES-Zellen auf einer konfluenten Schicht von M-Erdbeer-OP-neun-Zellen führt zur Produktion von flick-eins-positiven Zellen.Die Angioblasten am fünften Tag der Co-Kultur. Heman-Osteoblasten sind der gemeinsame mesodermale Vorläufer für die endothelialen und hämatopoetischen Linien und sollten als aufgehäufte Zellhaufen erscheinen, wie in diesem Bild gezeigt. Während die Co-Kultur fortschreitet, sollten sich am sechsten oder siebten Tag Zweier- bis Vierer-Zellverbände bilden und sich zu größeren Zellclustern entwickeln. Bis zum achten oder neunten Tag sind hämatopoetische Vorläuferzellen vorhanden, während terminale differenzierte hämatopoetische Linien am 14. Tag erscheinen.Im Gegensatz dazu führt eine Ko-Kultur mit fehlerhafter ESL-Differenzierung dazu, dass am fünften Tag ES-abgeleitete Nachkommen entstehen, die nicht in einem „world“-Muster erscheinen. Das Fehlen von Zellen in einem „world“-Muster weist auf eine fehlerhafte GIO-Blastenbildung hin. Eine Ko-Kultur mit fehlerhafter Eblastenbildung führt letztendlich zu einer gehemmten hämatopoetischen Differenzierung und sollte gemäß diesem modifizierten ES-OP9-Ko-Kulturprotokoll verworfen werden.ES-derivierte Nachkommen sind m-Strawberry-negativ und können mittels Flusszytometrie von M-Strawberry-positiven Zellen getrennt werden. OP-Neun-Zellen an jedem Tag der Kokultur zur Auswertung. Ergebnisse eines repräsentativen Experiments werden hier gezeigt.Bisher veröffentlichte ES-ZOP-neun-Ko-Kulturprotokolle konzentrierten sich ausschließlich auf das Passagieren und die Auswertung der nicht-anklebenden, schwimmenden Zellen. In diesem modifizierten Protokoll werden alle aus ES-Zellen stammenden Zellen – sowohl die anklebenden als auch die nicht-anklebenden – passiert und können evaluiert werden. Dies führt zu höheren Ausbeuten an hämatopoetischen Zellen, ermöglicht die Identifizierung seltener Zellpopulationen und erlaubt eine vollständige Charakterisierung aller aus ES-Zellen hervorgegangenen Nachkommen, sowohl hämatopoetischer als auch nicht-hämatopoetischer Art.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt die Herleitung der transplantierbaren hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus (ESC) und deren anschließende Injektion in letal bestrahlten Mäusen Empfänger. Kurz gesagt, ESC als Embryoidkörpern, die dann mit retroviralen HOXB4 und co-kultiviert mit OP9 Stromazellen und hämatopoetischen Zytokinen infiziert sind differenziert.

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Dieses Video beschreibt die Technik für die langfristige 2D-Co-Kultur von Leukämiezellen mit Knochenmarkstromazellen, um ihre Interaktion mit der Mikroumgebung des Knochenmarks zu untersuchen. Das 2D-Kokulturmodell nutzt die akuten lymphatischen Leukämiezellen und die Stroma- oder Osteoblasten des Knochenmarks, die den Phänotyp der Tumorzellen beeinflussen. Diese Studie wird die Untersuchung der Mechanismen unterstützen, die dem knochenmarkgestützten Überleben von Leukämiezellen während der...

2D-Co-Kultur von leukämischen Zellen mit BMSCs: Eine Methode zur Gewinnung von Subpopulationen leukämischer Zellen

Embryonale Stammzellen der Maus können in vitro mit dem OP9-DL1 Co-Kultursystem zu T-Zellen differenziert werden. Der Erfolg dieses Verfahrens erfordert eine sorgfältige Beachtung der Reagenzien-/Zellpflege und der wichtigsten technikabhängigen Schritte. Hier diskutieren wir diese kritischen Parameter und stellen ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um die Einführung dieser Technologie zu fördern.

Ableitung von T-Zellen In-vitro- Aus embryonalen Stammzellen der Maus

Die aktuellen Protokolle zur Erhaltung immortalisierter multipotenter otischer Vorläuferzellen (iMOP) und der otischen Differenzierung werden beschrieben.  Kulturbedingungen und molekulare Marker, die auf eine Differenzierung in sensorische Epithelien und Spiralganglienneuronen (SGN) hinweisen, werden hervorgehoben.

Initiieren Differenzierung in Immortalisierte multipotenten Vorläuferzellen Otic

Hier präsentieren wir menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC) Kultur Protokolle verwendet, um hPSCs in CD34 unterscheiden+ hämatopoetischen Vorläuferzellen. Diese Methode nutzt Bühne-spezifische Manipulation von kanonischer WNT signalisieren Zellen ausschließlich entweder die definitive oder primitive hämatopoetischen Programm angeben.

Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

Quantifizierung der Spender gewonnenen Zellen ist erforderlich, um Engraftment nach Stammzelltransplantation bei Patienten mit Hämoglobinopathien überwachen. Eine Kombination von Flow Cytometry-basierte Zellsortierung Kolonie Bildung Assay und anschließende Analyse von kurzen Tandem, die wiederholt verwendet werden, um die Verbreitung zu beurteilen und Differenzierung im Fach erythroiden Vorläuferzellen.

Erkennung von passives Spender erythroiden Vorläuferzellen nach hämatopoetische Stammzell-Transplantation bei Patienten mit Hämoglobinopathien

Dieses Protokoll beschreibt mit kultivierten Aorta-Gonade-Wachstum für Expressionsanalysen, Koloniebildenden Einheiten in die Kultur und die Milz und die langfristige Wiederherstellung um zu bestimmen, die Auswirkungen der regulatorischen Faktoren und Signalwege auf hämatopoetischen Stammzellen Zellentwicklung. Dies wurde als ein wirksames System zur Untersuchung von hämatopoetischen Stammzellen-Biologie und Funktion nachgewiesen.

Anwendung der Aorta-Gonade-Wachstum Explant Kultursystem in Developmental Hämatopoese

Wir zeigen, wie zu identifizieren und zu isolieren 6 Teilmengen der myeloischen Vorläuferzellen aus murinen Knochenmark mit einer Kombination von magnetischen und Fluoreszenz (MACS und FACS) sortieren. Dieses Protokoll kann für in-vitro- Kultur-Assays (Methylcellulose oder Flüssigkeit Kulturen), in Vivo Adoptiv Transfer Experimente und RNS/Protein-Analysen verwendet werden.

Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Einleitung der Differenzierung menschlicher hämatopoietischer Stamm- und Vorläuferzellen, die aus dem Knochenmark und peripheren mononuklearen Blutzellen des Patienten stammen. Der Test verwendet ein halbfestes Kulturmedium, das die Verpflichtung der erythroiden und myeloiden Linie unterstützt und standardisierte Kennzahlen für die reproduzierbare Kolonieklassifikation für die präklinische Wirkstoffcharakterisierung.

Koloniebildender Unit-Assay, angepasst für patientenabgeleitetes Knochenmark und periphere mononukleare Blutzellen

Lernen Sie die Differenzierung muriner embryonaler Stammzellen in hämatopoetische Linien mittels mStrawberry OP9-Stromazellen. Diese Methode ermöglicht die vollständige Charakterisierung aller ES-abgeleiteten Nachkommen zur Untersuchung hämatopoetischer Defekte.

Geändert ES / OP9 Co-Kultur-Protokoll bietet eine verbesserte Charakterisierung von hämatopoetischen Progeny

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