Geändert ES / OP9 Co-Kultur-Protokoll bietet eine verbesserte Charakterisierung von hämatopoetischen Progeny

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, murine embryonale Stammzellen in verschiedene primitive und definitive hämatopoetische Linien zu differenzieren. Um alle ES-Nachkommen zu charakterisieren, wird die Differenzierung muriner hämatopoetischer Zellen erreicht, indem ES-Zellen auf eine konfluente, fluoreszenzmarkierte M-strawberry-OP9-Stromazellschicht gegeben werden. Jeder Tag der Differenzierung bzw. der Co-Kultur repräsentiert die verschiedenen Stadien der hämatopoetischen Entwicklung zum jeweils geeigneten Zeitpunkt der Ernte.

Unterschiedliche ES-Zell-Nachkommen können durch Zellsortierung von der M-Strawberry-OP9-Stromazelllinie getrennt werden. Dieses ES-Differenzierungsprotokoll bildet die primitive und definitive Hämatopoese nach, wie sie in vivo beobachtet wird, und kann verwendet werden, um hämatopoetische Defekte, die mit Knockout-ES-Zelllinien assoziiert sind, zu charakterisieren, ohne Embryonen einzusetzen. Hallo, herzlich willkommen im Labor von Dr. Judith Gassen am Johnson Comprehensive Cancer Center der UCLA.

Mein Name ist Alicia Poz. Der Hauptvorteil der Technik, die ich Ihnen heute zeigen werde, gegenüber bestehenden ESO-neun-Kokultivierungsmethoden besteht darin, dass dieses Verfahren die Passage aller Zellen vom Tag fünf und Tag acht sowie die vollständige Trennung aller aus ES-Zellen stammenden Nachkommen ermöglicht. Die OP9-Stromazellen werden in OP9-Zellkulturmedium kultiviert, das alle zwei Tage gewechselt werden muss.

Die OP9-Zellen sollten drei Tage vor der erforderlichen Verwendung für die Co-Kultivierung unterkultiviert werden. Es ist wichtig zu beachten, dass die OP9-Zellen während der Pflege niemals bei einer Dichte über 90 % Konfluenz gehalten werden dürfen. Spülen Sie die Zellen zunächst zweimal mit PBS, fügen Sie dann vorgewärmtes 0,1 %iges Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie für fünf Minuten, bis sich die Zellen gelöst haben. Geben Sie OP9-Zellkulturmedium hinzu und überführen Sie die Zellen in ein 50-Milliliter-Konischgefäß.

Pelletieren Sie die Zellen in einem Röhrchen durch Zentrifugation bei 300 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur, entfernen Sie das Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in frischem M-Strawberry-OP9-Zellkulturmedium. Säen Sie die Zellen mit einer Mindestdichte von 10⁴ Zellen/cm² aus, am Tag, an dem das Co-Kultur-Experiment beginnt. Die OP9-Zellen, die vor drei Tagen subkultiviert wurden, sollten konfluent sein. Die ES-Zellen sollten gemäß dem Standardprotokoll für Ihre spezifische Zelllinie kultiviert werden.

Die ES-Zellen zweimal mit PBS und Trypsin mit 0,25 % Trypsin/EDTA waschen und fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend das Co-Kultur-Differenzierungsmedium zu den ES-Zellen geben und diese in 15-Milliliter-Konischflaschen überführen. Die ES-Zellen fünf bis sieben Minuten bei Raumtemperatur mit 400 × g pelletieren.

Nach dem Entfernen des Überstandes resuspendieren Sie die ES-Zellen in Differenzierungsmedium für die Ko-Kultur. Verwenden Sie eine stumpfe Nadel mit 21 Gauge, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Zählen Sie die Zellen mithilfe von Trypanblau und einem Hämozytometer.

Holen Sie nun den Kolben mit M-Erdbeere aus dem Inkubator. Entfernen Sie das Medium von den OP9-Zellen und geben Sie Co-Kultur-Differenzierungsmedium in den Kolben bzw. die Platte.

Einmal 10 hoch drei ES-Zellen pro Quadratzentimeter auf jedes Gefäß mit M-strawberry-OP9-Zellen geben und die Zellen bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und Luftfeuchtigkeit inkubieren. Dies ist Tag null, und die Kokultur sollte wie folgt aussehen. Drei Tage nach Beginn der ES-M-strawberry-OP9-Kokultur.

Überwiegend werden große, flache Zellklumpen aus ES-abgeleiteten Nachkommen mit klar definierten Grenzen beobachtet, und einige Zellwirbel beginnen sich zu bilden. Entfernen Sie vorsichtig das Medium aus der Kokultur und ersetzen Sie es fünf Tage nach Beginn der Kokultur durch frisches Differenzierungsmedium. Eine ordnungsgemäße Differenzierung der ES-Zellen auf einer konfluenten Schicht von M-strawberry-OP9-Zellen sollte zur Bildung von Hämantiblasten führen, die als aufgehäufte Zellwirbel erscheinen.

Der kritischste Aspekt dieses Verfahrens ist die Gewährleistung einer ordnungsgemäßen Differenzierung am fünften Tag der Co-Kultur. Zu diesem Zeitpunkt können Sie die Hämangioblast-Kolonien nicht nur mikroskopisch, sondern auch makroskopisch erkennen. Waschen Sie die Co-Kultur vorsichtig zweimal mit PBS und lösen Sie die Zellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA auf Eis. Lösen Sie die Zellen vom Kolben mit ES-Differenzierungsmedium ab und überführen Sie sie in ein Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 ×g für sieben Minuten bei Raumtemperatur.

Nach der Zentrifugation das Überstand entfernen und frisches Medium hinzufügen. Anschließend die Zellen mit einer stumpfen Nadel mit 21 Gauge resuspendieren, um eine Einzelzell-Suspension sicherzustellen, und die Zellen mit einem Hämozytometer zählen; es sollte eine 100- bis 150-fache Zunahme der ES-Zellzahl ab Tag null erfolgen. Rekultivieren Sie die Zellen am Tag acht oder neun und am Tag 12 auf einer neuen Schicht konfluenter M-strawberry-OP9-Zellen. Zählen Sie die Zellen erneut. Entfernen Sie das Medium mit den hämatopoetischen Zellen und heben Sie es auf.

Spülen Sie die Monoschicht einmal mit PBS, um die suspendierten hämatopoetischen Zellen zu entfernen. Geben Sie anschließend 0,25 % Trypsin-EDTA in den Kolben, warten Sie, bis die anhaftenden Zellen sich lösen, und waschen Sie die Zellen mit ES-Differenzierungsmedium aus dem Kolben. Fügen Sie diese Zellen den in Suspension befindlichen hämatopoetischen Zellen hinzu und pelletieren Sie die Zellen bei 400 ×g für sieben Minuten bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie die Zellen abschließend mit einer stumpfen 21-Gauge-Nadel und zählen Sie die Zellen. Die Zellen sind nun bereit, erneut ausplattiert zu werden oder in nachgeschalteten Assays verwendet zu werden.

Das ES-M-Erdbeer-OP-neun-Kokultursystem kann verwendet werden, um die beschriebene hämatopoetische Entwicklung zu modellieren. Hier ist eine Übersicht über den Zeitverlauf der Kokulturtage, an denen differenzierte ES-Nachkommen auf neue M-Erdbeer-OP-neun-Zellen übertragen werden müssen, angegeben. Eine korrekte Differenzierung der ES-Zellen auf einer konfluenten Schicht von M-Erdbeer-OP-neun-Zellen führt zur Produktion von flick-eins-positiven Zellen.

Die Angioblasten am fünften Tag der Co-Kultur. Heman-Osteoblasten sind der gemeinsame mesodermale Vorläufer für die endothelialen und hämatopoetischen Linien und sollten als aufgehäufte Zellhaufen erscheinen, wie in diesem Bild gezeigt. Während die Co-Kultur fortschreitet, sollten sich am sechsten oder siebten Tag Zweier- bis Vierer-Zellverbände bilden und sich zu größeren Zellclustern entwickeln. Bis zum achten oder neunten Tag sind hämatopoetische Vorläuferzellen vorhanden, während terminale differenzierte hämatopoetische Linien am 14. Tag erscheinen.

Im Gegensatz dazu führt eine Ko-Kultur mit fehlerhafter ESL-Differenzierung dazu, dass am fünften Tag ES-abgeleitete Nachkommen entstehen, die nicht in einem „world“-Muster erscheinen. Das Fehlen von Zellen in einem „world“-Muster weist auf eine fehlerhafte GIO-Blastenbildung hin. Eine Ko-Kultur mit fehlerhafter Eblastenbildung führt letztendlich zu einer gehemmten hämatopoetischen Differenzierung und sollte gemäß diesem modifizierten ES-OP9-Ko-Kulturprotokoll verworfen werden.

ES-derivierte Nachkommen sind m-Strawberry-negativ und können mittels Flusszytometrie von M-Strawberry-positiven Zellen getrennt werden. OP-Neun-Zellen an jedem Tag der Kokultur zur Auswertung. Ergebnisse eines repräsentativen Experiments werden hier gezeigt.

Bisher veröffentlichte ES-ZOP-neun-Ko-Kulturprotokolle konzentrierten sich ausschließlich auf das Passagieren und die Auswertung der nicht-anklebenden, schwimmenden Zellen. In diesem modifizierten Protokoll werden alle aus ES-Zellen stammenden Zellen – sowohl die anklebenden als auch die nicht-anklebenden – passiert und können evaluiert werden. Dies führt zu höheren Ausbeuten an hämatopoetischen Zellen, ermöglicht die Identifizierung seltener Zellpopulationen und erlaubt eine vollständige Charakterisierung aller aus ES-Zellen hervorgegangenen Nachkommen, sowohl hämatopoetischer als auch nicht-hämatopoetischer Art.