Name: Präparation einer Maus Eye für einen ganzen Berg von retinalen Pigmentepithel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 47 s
Description: Lernen Sie die Präparation eines Mausauges für ein Whole Mount des retinalen Pigmentepithels. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der Netzhautentwicklung und retinaler Erkrankungen.

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Diese Arbeit wurde vom National Institute of Environmental Health Sciences unterstützt [K22ES012264 zu AJRB] und einem American Cancer Society InstitutionalResearch Grant [ACS-IRG-00-173 bis 04] Pilot projectaward [zum AJRB]. Wir danken auch Mitglieder der Bishop-Labor für die kritische Durchsicht des Manuskripts und Kommentare auf der Video-und Adam Brown insbesondere für das Beispiel von dem, was nicht zu tun. Wir danken Dr. Donald McEwen von Greehey Kinder-Krebs-Forschung für die Erlaubnis der Verwendung seiner Binokular / Video-Kamera Set-up für die Dreharbeiten der Dissektion Video. Wir bedanken uns bei Daron Brown in Corte Instruments zum Schärfen und Reparatur unserer Mikrodissektion Werkzeuge.

1. Entfernen Fremdwasser Gewebe von der Außenseite des Auges <ol><li> Gießen 1X PBS in den Deckel eines 35-mm-Schale. Das Niveau sollte knapp unterhalb der Lippe des Deckels werden. </li><li> Mit geraden Zangen, Transfer Auge (n) aus der Lagerung Rohr auf die 35mm Gericht. 1: Die Augen sind in PBS aus zwei Gründen unter Wasser. Der fremde Gewebe wird "float" vom Auge weg, so dass Sie sehen können, und entfernen Sie sie einfach, und 2. Während Dissektion, wird das Auge natürlich pflegen ihre Kugelform, während in der Schwebe, so dass Sie mit dieser Form eher als Arbeit gegen sie. </li><li> Mit beiden Paare von abgewinkelten Pinzette (45 ° und 15 °), sanft wie viel Muskel-und Bindegewebe wie möglich zu entfernen, ziehen das Gewebe gegen den Strich (also in Richtung der Hornhaut). Einige Bindegewebe bleibt. Dabei sollte nach den Augapfel so wenig wie möglich unter Druck zu setzen. </li><li> Handeln Sie Ihre 15 ° Zange für das Frühjahr Schere. Halten Sie das Auge ständig mit 45 ° Zange, mit der Feder Schere wegschneiden verbleibenden Muskel-und Bindegewebe sowie den Sehnerv. * Tipp: Verwenden Sie den äußeren Rand der Schere, um das Gewebe gegen den Strich schieben (in Richtung der Hornhaut-Sklera-teilen) und dann zu trimmen. Fort, bis alle fremden Gewebe aus dem Auge entfernt worden. </li></ol> 2. Entfernen Sie die Hornhaut und Linse <ol><li> Mit der Hornhaut nach oben, die 45 ° Zange kneifen eine kleine Falte in der Mitte der Hornhaut. </li><li> Mit dem Frühling Schere, einen kleinen Schnitt an der Basis der Klappe. Lassen Sie die Klappe. </li><li> Halten Sie die Augen noch mit einer Pinzette, legen Sie die untere Scherenblatt in und senkrecht zur Schnitt-und einen Schnitt in Richtung der Corneo-Sklera teilen. Versuchen Sie, Ihre Untermesser unter der Iris zu halten, damit sowohl die Hornhaut und Iris geschnitten werden. Schneiden Sie nicht den ganzen Weg auf die Hornhaut-Sklera-teilen. Halten einer Schere in das Auge eingesetzt. </li><li> Mit Ihren 45 ° Pinzette vorsichtig drehen das Auge, so dass die Schere parallel zur Hornhaut-Sklera trennen sind und machen einen kleinen Schnitt. Drehen Sie langsam den Blick um 360 °, so dass kleine Schnitte rundum. Auch hier versuchen, die untere Klinge Ihrer Feder Schere unter der Iris zu halten, damit sowohl die Iris und Hornhaut geschnitten werden. Heben Sie die Iris und Hornhaut weg vom Rest des Auges und werfen Sie sie weg. </li><li> Kippen Sie das Auge auf die Seite und drücken Sie sanft auf der hinteren Hälfte des Auges, wodurch der Linse aus. Entsorgen Sie das Objektiv. Das Innere des verbleibenden Augenmuschel ist durch das neuronale Netzhaut, die glatt und undurchsichtig sollten ausgekleidet. </li></ol> 3. Quarter die daraus resultierenden Augenmuschel, was zu einem 4 - "petaled" Blume-ähnliche Struktur <ol><li> Das Auge soll so positioniert, dass die Öffnung der Augenmuschel senkrecht auf den Körper sein. Verwenden Sie Ihre 45 ° Zange zu stabilisieren und die Position der Augenmuschel. </li><li> Halten Sie Ihre Feder Schere vor Ihnen, so dass sie senkrecht stehen, um Ihren Körper, legen Sie die untere Klinge Ihrer Feder Schere in die obere Kante der offenen Augenmuschel. Mit Ihren 45 ° Zange, richten Sie die Augenmuschel, so dass einem einzigen geraden Schnitt aus der Corneo-Sklera-Kluft in Richtung des Sehnervenkopfes gemacht werden kann. Alle Schnitte sollten senkrecht zur Hornhaut-Sklera-teilen und sofern nicht anders angegeben, gehen sollte möglichst nahe an den Sehnervenkopf wie möglich, ohne Schneiden hinein. </li><li> Drehen Sie die Augenmuschel 180 ° unter Beibehaltung der Rechtwinkligkeit mit Ihrem Körper. Verwenden Technik in Schritt 3.2 eine zweite senkrecht Schnitt zu machen. </li><li> Drehen Sie das Okular und wiederholen Sie die Technik in 3.2 beschrieben, zwei weitere Schnitte zu machen. Alle vier Schnitte sollten möglichst nahe an 90 ° auseinander wie möglich. Beachten Sie, dass das Auge nicht perfekt sphärische so gibt es eine gewisse Variabilität werden. </li></ol> 4. Cut jede der vier "Laschen" in zwei Hälften, die sich in einem Acht-Blütenblatt Blüte-Struktur <ol><li> Übertragen Sie die geviertelt Augenmuschel aus dem 35-mm-Schale auf einen sauberen Objektträger. Mit der Augenmuschel nach oben, darunter Kugel mit dem 45 ° Zange. Heben Sie ihn aus der Flüssigkeit und legen Sie es auf einen sauberen Objektträger. </li><li> Mit beiden Paare von abgewinkelten Pinzette vorsichtig öffnen sich die Augen, mit der neuronalen Netzhaut nach oben zeigt. AUF KEINEN FALL DIE neuralen Retina-es hilft dem Auge zu halten einige seiner Kugelform, so dass Sie nicht berufstätig sind dagegen. Es schützt auch die RPE entfernt, versehentlich in den folgenden Verfahren beschädigt. </li><li> Drehen Sie das Bild, bis eines der Blütenblätter steht senkrecht auf den Körper. </li><li> Verwenden Sie Ihre 15 ° Pinzette vorsichtig greifen die Ecke des Blütenblatt. Die Ecke des Blütenblatt sollte Hornhaut, nicht neuronalen Netzhaut oder RPE. Heben Sie die Ecke vorsichtig, so dass sie ihre Krümmung zu behalten. </li><li> Setzen Sie den unteren Klinge Ihrer Feder Schere zwischen dem Blütenblatt und der Folie. Richten Sie Ihr Schere, so dass eine einzelne, gerade, rechtwinklig geschnitten aus der Hornhaut-Sklera-Kluft in Richtung des Sehnervenkopfes gemacht werden kann. Cut möglichst nahe an den Sehnervenkopf wie möglich without Schneiden hinein. Lassen Sie das Blütenblatt, so dass sie auf der Folie liegen. </li><li> Drehen Sie die Folie 90 °, so dass die nächste Blütenblatt senkrecht auf Ihren Körper. Wiederholen Sie Schritt 4.5. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.5 und 4.6 noch zweimal. Die resultierende Struktur sollte wie ein Acht-Blütenblatt Blüte aussehen. </li></ol> 5. Entfernen Sie die neuralen Netzhaut <ol><li> Pipette 100-200 ul 1X PBS auf die Probe. Dies wird die neuronale Netzhaut klebt, wie Sie diese abziehen des RPE zu verhindern. </li><li> Typischerweise werden die neuronalen Netzhaut ist lose mit dem RPE befestigt. Allerdings dauert es, Übung und Geschick, um nur die neuralen Netzhaut und nicht der RPE zu entfernen. Fassen Sie ein Blütenblatt der neuronalen Netzhaut mit einem Paar abgewinkelte Pinzette und stabilisiert (gedrückt halten) den Rest des Auges mit dem anderen Paar abgewinkelte Pinzette. Ziehen Sie die neuralen Netzhaut weg vom Rest des Auges. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das gesamte neuronale Netzhaut entfernt worden ist. * Tipp: Kleben Sie die Spitze des 15 ° Zange in den Sehnervenkopf für das Auge zu verankern. Dann nutzen Sie die 45 ° Pinzette aufkehren unter der neuronalen Netzhaut und heben Sie sie ab und weg. Es ist normalerweise am besten, die neuronalen Netzhaut von der Sehnerv Kopf in Richtung der Corneo-Sklera-teilen zu heben. Achten Sie darauf, wegzuziehen alle losen Reste der Iris. Die Iris ist ganz klebrig und kann ansonsten auf die RPE stecken. </li><li> Spülen Sie die Probe mit 1X PBS. Pipette 100-200 ul 1X PBS in die Probe und saugen ihn wieder aufzubauen. Entsorgen Sie die PBS. Bei Bedarf wiederholen, um Staub und Schmutz zu entfernen. </li></ol> 6. Montieren Sie Probe (n) auf einer Folie <ol><li> Pipette 80-90 ul von 90% Glycerin auf eine neue Folie in eine rechteckige Form. Verwenden Sie die Seite der Pipettenspitze, um eine gleichmäßige, rechteckige Abstrich von Glycerin zu machen. (Dies ist das Verfahren für die Montage von zwei RPE auf einer Folie.) </li><li> Setzen Sie den unteren Arm von 15 ° Zange unter der Probe. Heben Sie die Probe aus dem Sezieren gleiten. </li><li> Langsam senken die Probe in das Glycerin. Sanft wiggle der Zange, wie Sie sie herausziehen unter der Probe. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 6,1-6,3 für die anderen Proben. </li><li> Drehen Sie die Folie, so dass die lange Seite senkrecht auf Ihren Körper. Halten Sie Ihr Deckglas in einem 45 ° Winkel auf die Folie, so dass es zu berühren ist die Folie. Move it auf die Glycerin-Abstrich, bis sie sich berühren. Aufrechterhaltung des Kontakts zwischen dem Deckglas und Objektträger, langsam das Deckglas entfernt von der Abstrich, auf den Rand der Folie. Line up den langen Seiten des Schlittens und das Deckglas, so dass sie parallel sind. Halten Sie die Ecken des Deckglases zwischen Daumen und Zeigefinger. </li><li> Nehmen Sie den 15 ° Zange in der anderen Hand. Cradle der oberen (kostenlos) Rand des Deckglases in die Armbeuge. Sehr langsam, senken Sie die Abdeckung aus Glas. Wenn der Kontakt zwischen dem Deckglas und Glycerin gemacht wird, zu stoppen und warten auf die Glycerin zu migrieren. Wiederholen Sie diesen Senken und warten, bis die RPE ganzen mounts vollständig abgedeckt werden. Dies ist die hochviskose Glycerin aus der Aufnahme von Luftblasen zu verhindern. NICHT drücken Sie auf dem Deckglas - das Glycerin wird Squeeze-out unter ihm, was Haftung sehr schlecht. </li><li> Mit klaren Nagellack, Farbe rund um den Perimeter, wo das Deckglas und Objektträger zu erfüllen. </li><li> Legen Sie die Folie auf der Oberseite eines leeren Rack, um zu trocknen. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Das Ergebnis dieser Prozedur sollte eine Struktur, die wie eine Blume aussieht und sollte recht symmetrisch sein. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Whole mount RPE von einem Wildtyp C67Bl/6J Maus. RPE aus schwarzem oder agouti Tiere sollten von dunkelbrauner Farbe und sollte eine glatte Oberfläche haben. Es ist normal, Wellen in der Topographie der Blütenblätter kündigen. Die Pigmentierung auf jedem geben Proben können etwas variable, durch variable Dichte der Pigmentierung sowohl der RPE und der darunter liegenden Aderhaut. Weiße Pfeile zeigen auf hypopigmentierte "Kanäle" - das ist normal und ist aufgrund der zugrunde liegenden Gefäßsystem des Auges. Blauer Pfeil zeigt auf physische Schäden am RPE und der zugrunde liegenden Aderhaut. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Whole mount RPE aus einer verdünnten Maus. Proben aus verdünnter Tieren geerntet werden in der Farbe von fast transparent zu Café au lait und in jeder ein Exemplar ist wie die Variabilität in sich haben, angegeben in schwarzen Kreisen hier. Im Allgemeinen sind RPE von jüngeren Tieren geerntet leichter und die von älteren Tieren geerntet werden dunkler. Schwarze Pfeile zeigen einige der zugrunde liegenden Blutgefäßen, die hypopigmentierte erscheint. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Phalloidin-Färbung kann verwendet werden, um körperliche Schäden an der RPE erkannt werden. Phalloidin-Färbung deutlich die Zellmembranen, zeigt die sechseckige Form des Epithels. (A) Beispiel aus einem schwarzen Maus. (B) Beispiel aus einer verdünnten Maus. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Ein schlecht präpariert RPE aus einer verdünnten Maus. (A) Werte in Klammern zeigen die Margen der Hornhaut, die zu breit sind, die dazu führen Knicken und / oder Falten können. Innerhalb der schwarzen Kreis sieht man große Mengen von Fremdstoffen Gewebe, das nicht aus dem hinteren Teil des Auges entfernt worden sind. Sie sind besonders offensichtlich, da die Probe aus einer verdünnten Tier. Das Blütenblatt in der linken unteren teilweise umgeschlagen. (B) Das ganze Berg sieht aus wie ein Windrad. Schwarze Pfeile zeigen einige der Einschnitte, die gemacht wurden. Viele der Kürzungen aus der Hornhaut-Sklera-Kluft in Richtung des Sehnervs sind nicht im Einklang mit dem Durchmesser. (C) Schwarze Pfeile zeigen an, wie die Kürzungen hätte erfolgen müssen, in Einklang mit dem Durchmesser und senkrecht zur Tangente.

<ol><li>Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzo%28a%29pyrene+andX-rays+induce+reversions+of+the+pink-eyed+unstable+mutation+in+the+retinal+pigmentepithelium+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.%22%5BJournal%5D)">Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice.</a> Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).</li>
<li>Reliene, R. H. lavacove, Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diesel+exhaust+particles+cause+increased+levels+of+DNA+deletions+after+transplacental+exposure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice.</a> Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).</li>
<li>Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atm+deficiency+causes+increased+frequency+of+intrachromosomal+homologous+recombination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice.</a> Cancer Res. 60, 395-399 (2000).</li>
<li>Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+WRN+helicase+domain+is+not+required+for+spontaneous+homologous+recombination-mediated+DNA+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion.</a> J. Nucleic Acids. , (2010).</li>
<li>Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1+suppresses+homologous+recombination+events+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53-%2C+and+Gadd45a-deficient+mice+show+an+increased+frequency+ofhomologous+recombination+at+different+stages+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development.</a> Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).</li>
<li>Bodenstein, L., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+development+of+the+mouse+retinalpigment+epithelium.+Part+I.+Cell+and+tissue+morphometrics+and+topography+of+mitoticactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity.</a> Dev Biol. 121, 192-204 (1987).</li>
<li>Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+phenotype+and+the+RPE%3A+is+the+answer+blowing+in+the+Wnt%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt?</a> Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).</li>
</ol>

Das RPE ist die Website des p un-Assay, einem In-vivo-Assay von Homologie-directed reparieren. Die p un-Assay wurde verwendet, um die Auswirkungen der verschiedenen DNA-Schäden 1,2 und DNA-Schäden Signal-und Reparatur-Gene 3,4,5 über die Häufigkeit von Homologie-directed Reparatur zu studieren. Dieser Test ist sehr empfindlich, Aufdeckung Single-Cell-Veranstaltungen auf der RPE 1. Es kann auch erkennen, Unterschiede im Timing der Homologie...

<table><tbody><tr><td>gerade Pinzette</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-4903</td><td>Spitze: .08 x .04 mm Material: INOX</td></tr><tr><td>45&amp;#x00B0;-Pinzette</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5005</td><td>Spitze: .05 x .01 mm Material: INOX</td></tr><tr><td>15&amp;#x00B0;-&quot;up&quot;-Pinzette</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5045A</td><td>Spitze: .1 x .06 mm Material: INOX</td></tr><tr><td>Federschere</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5604</td><td>kombinierte Spitzenbreite 0,3 mm, Schneidkantenlänge 3 mm, Material: Edelstahl</td></tr><tr><td>binokulares Stereomikroskop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Discovery V.8</td><td>reflektierte Lichtquelle verwenden</td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22283</td><td>Alexa Fluor 546</td></tr></tbody></table>

präparation einer maus eye für einen ganzen berg von retinalen pigmentepithel

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Das retinale Pigmentepithel (RPE) liegt an der Rückseite des Säugetier-Auge, gerade unter der neuralen Netzhaut, die Photorezeptoren (Stäbchen und Zapfen) enthält. Das RPE ist eine Monoschicht von pigmentierten kubischen Zellen und Mitarbeiter eng mit der neuronalen Retina knapp darüber. Dieser Verein macht die RPE von großem Interesse für Forscher untersuchen Netzhauterkrankungen. Das RPE ist auch der Ort einer in vivo-Assay von Homologie-directed DNA-Reparatur, die p un-Assay. Die Maus Auge ist besonders schwer zu sezieren aufgrund seiner geringen Größe (ca. 3,5 mm im Durchmesser) und seine Kugelform. Dieser Artikel zeigt im Detail ein Verfahren für die Präparation des Auges führt einen ganzen Berg der RPE. In diesem Verfahren zeigen wir, wie man mit und nicht gegen die kugelförmige Struktur des Auges zu arbeiten. Kurz gesagt, sind das Bindegewebe, Muskeln und Sehnerv aus dem hinteren Teil des Auges entfernt. Dann werden die Hornhaut und die Linse entfernt. Als nächstes sind strategische Schnitte, die zu erheblichen Abflachung der übrigen Gewebe. Schließlich ist der neuronalen Retina vorsichtig abgehoben, enthüllt eine intakte RPE, die noch auf die zugrunde liegende Ader-und Lederhaut befestigt wird. Das ganze Berg kann die p un-Assay oder für die Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz Beurteilung des RPE Gewebe durchzuführen.

Eine formale Demonstration der Zerlegung einer Maus Auge, was zu einem ganzen Berg der retinalen Pigmentepithels.

Präparation einer Maus Eye für einen ganzen Berg von retinalen Pigmentepithel

Das retinale Pigmentepithel (RPE) befindet sich im hinteren Teil des Auges von Säugetieren, direkt unter der neuralen Retina, welche die Photorezeptoren (Stäbchen und ...

Mein Name ist Allison Clavon. Ich bin wissenschaftliche Mitarbeiterin von Dr. Alex Bishop am Gree Children's Cancer Research Institute des UT Health Science Center in San Antonio, Texas. Heute werde ich Ihnen zeigen, wie man ein Nagetierauge präpariert, um die gesamte retinale Pigmentepithelzellschicht zu gewinnen.Dieses Gewebe ist von Interesse für die Untersuchung der Netzhautentwicklung und von Erkrankungen und stellt zudem den Ort eines In-vivo-Assays zur homologieabhängigen DNA-Reparatur dar. Beginnen wir also. Hier ist ein Auge, das zur Dissektion bereit ist.Zunächst betrachten wir die anatomischen Strukturen, die Sie während des gesamten Verfahrens als Orientierungspunkte verwenden werden. Dies sind die Augen eines verdünnten Tieres. Hier befindet sich der Sehnerv an der Rückseite des Auges gegenüber.Das ist die Hornhaut. Die Iris ist durch die Hornhaut sichtbar. Der weißliche Bereich auf der Rückseite des Auges ist die Sklera.Daher wird dieser Bereich als Grenze zwischen Hornhaut und Lederhaut bezeichnet. Der erste Schritt der Dissektion besteht darin, überflüssige Gewebe wie Muskelbindegewebe und den Sehnerv zu entfernen. Anschließend muss die Hornhaut entfernt werden, wobei ein kreisförmiger Schnitt angelegt wird.An diesem Punkt kann die Linse herausgedrückt werden, wodurch eine hohle Augenschale entsteht. Danach werden vier Schnitte vom korneoskleralen Übergang in Richtung des Sehnervenkopfes ausgeführt. Die resultierende Struktur ähnelt einer vierblättrigen Blüte.Jedes dieser vier Blütenblätter wird dann in der Mitte durchgeschnitten, sodass eine Struktur entsteht, die einer achtblättrigen Blume ähnelt. In diesem Stadium kann das I aufgrund seiner sphärischen Form an einigen Stellen wellig werden. Um dies zu verhindern und eine flachere Lochhalterung zu erreichen, können acht kürzere Schnitte direkt an der Wölbung vorbei angebracht werden.Sie benötigen mehrere Materialien an Ihrem Arbeitsplatz, darunter eine 100- oder 200-µL-Pipette mit entsprechenden Spitzen, eine X-P-B-S-A-35-Millimeter-Scheibenplattenslide mit Deckglas, 90 % Glycerin und klaren Nagellack zur Präparatvorbereitung, ein Gestell zum Trocknen der Objektträger sowie eine Box mit Kim-Tüchern und einen Abfallbehälter für die Entsorgung. Zusätzlich zu diesen üblichen Materialien benötigen Sie auch einen Satz spezialisierter Mikrodissektionswerkzeuge, darunter gerade Pinzetten sowie 45-Grad-angewinkelte Pinzetten, die zum Halten, Drehen und allgemeinen Manipulieren des Auges während der Dissektion verwendet werden. Diese 15-Grad-Pinzetten weisen einen nach oben gerichteten Winkel auf und werden ebenfalls zum Handhaben und Manipulieren des Auges eingesetzt.Schließlich benötigen Sie ein Paar Feder-Scheren. Es ist sehr wichtig, dass Sie Feder-Scheren und nicht herkömmliche Scheren verwenden. Stellen Sie vor Beginn dieser Dissektion sicher, dass die Sitzhöhe Ihres Stuhls so eingestellt ist, dass Ihre Augen auf gleicher Höhe mit den Okularen sind, wenn Sie aufrecht sitzen.Das gebeugte Sitzen am Mikroskop verursacht Schulter- und Rückenschmerzen und beeinträchtigt die Qualität Ihrer Präparationen. Gießen Sie zunächst ein XPBS in den Deckel der 35-Millimeter-Schale. Überführen Sie dann die Augen, die Sie präparieren möchten, in die Schale.Das ist ein Auge einer Wildtyp C57 Black Maus. Sie können es als sehr klein erkennen, etwa dreieinhalb Millimeter im Durchmesser. Die Trübung der Sklera verleiht ihm einen bläulichen Farbton.Der erste Schritt bei der Dissektion besteht darin, alle überflüssigen Gewebe um das Auge herum zu entfernen, wie Muskelbindegewebe und den Sehnerv. Hier halte ich die 45-Grad-Pinzette in der linken Hand und die 15-Grad-Pinzette in der rechten Hand. Sie können ein Paar Pinzetten verwenden, um das Auge zu stabilisieren, während Sie mit der anderen das Gewebe wegziehen.Wenn ein großes Gewebestück frei wird, wischen Sie die Pinzette vorsichtig an einem Kim-Tuch ab. Achten Sie darauf, das Auge nicht zu zerquetschen oder zu durchstechen. Einer der Vorteile dieser Dissektion in Suspension besteht darin, dass man das Bindegewebe leicht vom Auge wegschwimmen sehen kann.Schließlich erreichen Sie einen Punkt, an dem Sie mit der Pinzette kein weiteres Gewebe mehr entfernen können. Ersetzen Sie Ihre 15-Grad-Pinzette durch die Feder-Schere. Benutzen Sie die Feder-Schere, um den Sehnerv abzuschneiden.Verwenden Sie die Außenkante der Klinge, um das Gewebe in Richtung der Sklera-Kornea-Grenze voranzuschieben. Schneiden Sie dann nach und wischen Sie die Schere vorsichtig auf einem Kim-Tuch ab. Sehen wir uns das noch einmal an.Schieben Sie das Gewebe mit der Außenseite der Schere nach vorne in Richtung der Grenze zwischen Hornhaut und Sklera, wenn das Gewebe nach oben abstehend ist. Schneiden Sie es zurecht, schieben Sie weiterhin Gewebeteile mit der stumpfen Kante der Schere nach vorne und schneiden Sie sie ab, bis das gesamte überflüssige Gewebe entfernt ist. Normalerweise befinden sich zwei Bänder aus straffem Gewebe am Auge.Der erste sitzt am Übergang zwischen Hornhaut und Lederhaut an, der zweite wird gerade beschnitten. Hier befindet man sich etwa auf halbem Weg zwischen dem Übergang von Hornhaut und Lederhaut und dem Sehnervenkopf. Der nächste Schritt bei der Dissektion besteht darin, die Hornhaut und die Linse zu entfernen.Verwenden Sie Ihre 45-Grad-Zange, um eine Klappe etwa in der Mitte der Hornhaut hochzuziehen. Benutzen Sie dann Ihre Feder-Schere, um einen kleinen Schnitt an der Basis der Klappe anzulegen. Führen Sie die untere Scherenklinge in den Schnitt unterhalb der Iris ein.Führen Sie einen Schnitt in Richtung der Hornhaut-Lederhaut-Grenze durch, ohne diese jedoch zu verletzen. Drehen Sie langsam das Auge um 360 Grad und setzen Sie dabei kleine Schnitte entlang des gesamten Umfangs. Achten Sie darauf, die Schere unterhalb der Iris zu halten und gleichzeitig sowohl die Hornhaut als auch die Iris zu durchtrennen.Es bedarf viel Übung, um dies so mühelos zu tun, wie ich es hier zeige. Sobald die Hornhaut entfernt ist, drehen Sie das Auge auf die Seite und drücken Sie vorsichtig von außen auf das Auge, um die Linse herauszudrücken. Die verbleibende Struktur wird anschließend cupförmig sein.Das Auge muss viertelt werden. Dazu wird das Auge auf die Seite gedreht und die untere Klinge der Feder-Schere eingeführt. Ein Längsschnitt wird in Richtung, aber nicht bis zum Sehnervenkopf, angelegt.Halten Sie dazu Ihre Arme an der Seite und die Schere etwa senkrecht zu Ihrem Körper und zum Augenschnitt vor sich. Führen Sie Ihren zweiten Schnitt direkt gegenüber dem ersten Schnitt aus. Nehmen Sie sich Zeit zum Ausrichten, damit Sie einen gleichmäßigen Schnitt ausführen können.Mehrere Schnitte können zu Unebenheiten führen, sind jedoch, wenn sorgfältig ausgerichtet, nicht auffällig. Achten Sie darauf, wie ich mit dieser kugelförmigen Gestalt des Auges arbeite, anstatt dagegen, da das Auge seine normale Form beibehält. Wenn es in PBS suspendiert ist, erfolgt der Rest der Präparation auf einem Objektträger. Stützen Sie das Auge mit Ihrer um 45 Grad abgewinkelten Pinzette und heben Sie es aus dem PBS heraus.Legen Sie das Auge auf eine frische Objektträgerplatte. Entfalten Sie das Auge vorsichtig mithilfe beider Paare schräger Pinzetten. Beachten Sie, dass ein schmaler Rand aus Kornea und Iris am Umfang des Auges vorhanden ist, der sich zum Handhaben eignet.Danach müssen Sie jeden der vier Lappen in zwei Hälften schneiden. Drehen Sie das Auge so, dass sich einer der Lappen senkrecht zu Ihrem Körper befindet. Greifen Sie mit der 15-Grad-gekröpften Pinzette in die Ecke des Lappens.Leicht anheben und dann einen Schnitt von der Grenze zwischen Hornhaut und Sklera in Richtung des Sehnervenkopfes führen. Diese Schnitte sollten senkrecht zu einer Tangente verlaufen. Eine Tangente ist eine Linie, die senkrecht zum Durchmesser steht.Daher sollten Ihre Schnitte mit dem Durchmesser des Auges übereinstimmen. Drehen Sie nun das Präparat, sodass das nächste Blütenblatt senkrecht zu Ihrem Körper steht, und wiederholen Sie den Vorgang. Greifen Sie die Ecke des Blütenblatts.Lösen Sie leicht an und schneiden Sie. Wiederholen Sie dies, bis jeder der vier großen Lappen halbiert ist. Die weißliche Substanz ist die Nervenretina, die direkt über dem retinalen Pigmentepithel (RPE) liegt.Die Netzhaut kann das retinale Pigmentepithel schützen, daher belassen Sie sie unversehrt, bis alle Ihre Schnitte durchgeführt wurden. Achten Sie darauf, wie die „Pedale“ leicht gekrümmt sind. Arbeiten Sie nicht gegen diese Krümmung an.Nehmen Sie sich Zeit zum Ausrichten, damit Sie einen sauberen einzelnen Schnitt durchführen können. Da das Auge rund ist, neigt es dazu, sich zu verformen; um dieser Verformung entgegenzuwirken, können Sie acht kurze Schnitte anbringen.Einer an jedem Blütenblatt. Wenden Sie die gleiche grundsätzliche Strategie wie in der vorherigen Runde mit vier Schnitten an. Heben Sie die Ecke des Blütenblatts an und schneiden Sie, aber in diesem Fall nur etwa bis zur halben Länge des Blütenblatts.Nachdem Sie alle Schnitte ausgeführt haben, können Sie die Nervenretina entfernen. Hier füge ich einige Tropfen 1× PBS zur Probe hinzu. Sie sollten vermeiden, dass Ihr RPE austrocknet.Die Netzhaut sollte nur locker mit dem darunterliegenden Pigmentepithel verbunden sein. Man sieht, dass sie sich leicht abl&ouml;st. Allerdings bleibt sie gew&ouml;hnlich an der korneoskleralen Grenze haften, die auf der Innenseite des Auges eine warzige Erhebung darstellt, die als Ziliark&ouml;rper bezeichnet wird.Sie können die Spitze Ihrer 15-Grad-Zange in den Sehnervenkopf einführen, um die Probe zu verankern, während Sie die Netzhaut ablösen. Der Ziliarkörper markiert den Rand des Pigmentepithels (RPE), dem dunkel pigmentierten Gewebe, das abgelöst wurde. Hier befindet sich die Regenbogenhaut, nicht das RPE.Ich empfehle, so viel wie möglich von der Iris zu entfernen, da sie sehr klebrig ist und sich zusammenfalten und an der Pigmentepithelschicht (RPE) festsetzen kann, wenn die Netzhaut brüchig ist oder Reste an der RPE haften bleiben. Wahrscheinlich ist eines von zwei Dingen schiefgelaufen: Entweder die Augen wurden nicht korrekt fixiert, beispielsweise zu lange oder zu kurz, oder sie wurden vor der Dissektion zu lange gelagert.Das Pedal, das ich hier frelege, verfügt noch nicht über eine Tastenkombination. Sie können sehen, wie das Pedal etwa ein Drittel des Weges vom Rand der RPE entfernt liegt. Aus diesem Grund werden die acht Tastenkombinationen empfohlen.Nachdem das gesamte neurale Netzhautgewebe verworfen wurde, spülen Sie das retinale Pigmentepithel mehrmals mit 100 bis 200 Mikrolitern PBS unter Verwendung einer Pipette, bis sämtlicher Staub und sämtliche Ablagerungen entfernt sind. Geben Sie 80 bis 90 Mikroliter 90 % Glycerin mittels Pipette auf einen frischen Objektträger in rechteckiger Form auf. Beachten Sie, dass dies das optimale Volumen an Glycerin für ein Deckglas mit den Maßen 22 mal 50 Millimeter ist und entsprechend angepasst werden sollte.Bei anderen Größen von Deckgläsern verwenden Sie die Pipettenspitze, um das Glycerin zu verteilen. Achten Sie darauf, keine Luftblasen in das Glycerin einzubringen. Sollte sich dennoch eine Blase bilden, führen Sie sie an den Rand, wo sie platzen wird.Schieben Sie den unteren Arm Ihrer 15-Grad-Pinzette unter das RPE und heben Sie es vorsichtig an. Senken Sie das RPE langsam in das Glycerin ab. Das RPE schwimmt auf der Glycerinoberfläche und kann sich etwas wellen oder verdrehen. Richten Sie das RPE mit der Pinzette gerade und ziehen Sie das Glycerin über die Oberfläche des RPE.Wenn sich Luftblasen bilden, schieben Sie diese beim Vorgang an den Rand, wo sie platzen, indem Sie das Deckglas in einem Winkel von etwa 45 Grad halten. Berühren Sie damit die Kante des Glycerins.Bewegen Sie sie dann zur Kante der Objektträgerplatte. Halten Sie die Unterseite des Deckglases mit Daumen und Zeigefinger fest und stützen Sie die gegenüberliegende Kante mit Ihren 15-Grad-Pinzetten. Senken Sie das Deckglas sehr langsam auf den Objektträger ab, sobald der Kontakt hergestellt ist.Beim RPE das Absenken stoppen und zulassen, dass das Glycerin weiterwandert, während Sie Ihre Deckglas langsam absenken. Wenn Sie das Deckglas zu schnell absenken, bilden sich hier Luftblasen in Ihrem Präparat. Ich werde das Deckglas langsam absenken, sobald es das RPE berührt, und das Wandern des Glycerins zulassen.Sie können sehen, wenn ich das Deckglas schnell loslasse, werden Luftblasen eingeschlossen. Verwenden Sie eine reichliche Menge klaren Nagellack, um den Rand des Deckglases am Objektträger entlang des gesamten Umfangs anzubringen.Dies ist ein typisches RPE von einer C57 black Maus. Es ist normal, die darunterliegende Gefäßstruktur zu sehen, wie hier dargestellt. Es ist ebenfalls normal, gewisse Variationen in der Pigmentierung zu beobachten, beispielsweise Flecken, die weniger pigmentiert erscheinen.Jedoch sind klare Stellen wie diese wahrscheinlich auf eine physische Schädigung des retinalen Pigmentepithels (RPE) und der darunterliegenden Aderhaut zurückzuführen. Da auch die Aderhaut des Auges pigmentiert ist, kann eine Schädigung eines schwarzen RPE unauffällig bleiben, wenn die Aderhaut intakt bleibt.Dies ist ein typisches RPE von einer verdünnten Maus. Wie angegeben, können Sie die Gefäße sehen, und es wird einige Variationen in der Pigmentierung geben, wie dunklere und hellere Flecken. Es ist jedoch nahezu unmöglich, Schäden an einem verdünnten RPE zu erkennen.Sind diese kleinen Flecken Schäden oder eine normale Variation der Pigmentierung? Ich schlage Foid und Färbung vor, um diese Frage zu klären. Dies gibt Ihnen einen Hinweis darauf, ob Sie die I zwei zu grob behandeln.Die Färbung hebt die Zellmembranen deutlich hervor, wodurch Schadstellen offensichtlich werden. Tatsächlich ist das retinale Pigmentepithel (RPE) jedoch ziemlich widerstandsfähig, und wenn Sie das Auge am Kornea-Gewebe anfassen, ist es unwahrscheinlich, dass Sie Schäden verursachen. Hier sehen Sie eine Ganzpräparation mit zahlreichen Problemen, wobei das geringste Problem hier ein zu breiter Kornea-Rand ist, der zu Verwerfungen und Faltenbildung des gewundenen Materials führen kann. Sie können hier ein massives überflüssiges Gewebe erkennen, das auf der Rückseite des Auges verblieben ist.Dieses Pedal ist teilweise umgefaltet, und hier sehen Sie, dass das retinale Pigmentepithel (RPE) teilweise gerissen wurde. Ein weiteres Problem ist, dass dieses Auge das Aussehen eines Windrads aufweist. Hier habe ich die Winkel der Schnitte eingezeichnet.Doch so hätten sie aussehen sollen. Denken Sie daran, dass Ihre Schnitte senkrecht zur Tangente und entlang des Durchmessers verlaufen sollten. Ich habe soeben demonstriert, wie man ein Mausauge für eine Ganzpräparat-Präparation des retinalen Pigments präpariert.Epithel, das Wichtigste ist, eine gute Haltung beizubehalten, aber versuchen Sie, entspannt zu bleiben. Ich hoffe, dieses Video war für Sie hilfreich und wünsche Ihnen alles Gute für Ihre zukünftigen Experimente.

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Forschung

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