Präparation einer Maus Eye für einen ganzen Berg von retinalen Pigmentepithel

Mein Name ist Allison Clavon. Ich bin wissenschaftliche Mitarbeiterin von Dr. Alex Bishop am Gree Children's Cancer Research Institute des UT Health Science Center in San Antonio, Texas. Heute werde ich Ihnen zeigen, wie man ein Nagetierauge präpariert, um die gesamte retinale Pigmentepithelzellschicht zu gewinnen.

Dieses Gewebe ist von Interesse für die Untersuchung der Netzhautentwicklung und von Erkrankungen und stellt zudem den Ort eines In-vivo-Assays zur homologieabhängigen DNA-Reparatur dar. Beginnen wir also. Hier ist ein Auge, das zur Dissektion bereit ist.

Zunächst betrachten wir die anatomischen Strukturen, die Sie während des gesamten Verfahrens als Orientierungspunkte verwenden werden. Dies sind die Augen eines verdünnten Tieres. Hier befindet sich der Sehnerv an der Rückseite des Auges gegenüber.

Das ist die Hornhaut. Die Iris ist durch die Hornhaut sichtbar. Der weißliche Bereich auf der Rückseite des Auges ist die Sklera.

Daher wird dieser Bereich als Grenze zwischen Hornhaut und Lederhaut bezeichnet. Der erste Schritt der Dissektion besteht darin, überflüssige Gewebe wie Muskelbindegewebe und den Sehnerv zu entfernen. Anschließend muss die Hornhaut entfernt werden, wobei ein kreisförmiger Schnitt angelegt wird.

An diesem Punkt kann die Linse herausgedrückt werden, wodurch eine hohle Augenschale entsteht. Danach werden vier Schnitte vom korneoskleralen Übergang in Richtung des Sehnervenkopfes ausgeführt. Die resultierende Struktur ähnelt einer vierblättrigen Blüte.

Jedes dieser vier Blütenblätter wird dann in der Mitte durchgeschnitten, sodass eine Struktur entsteht, die einer achtblättrigen Blume ähnelt. In diesem Stadium kann das I aufgrund seiner sphärischen Form an einigen Stellen wellig werden. Um dies zu verhindern und eine flachere Lochhalterung zu erreichen, können acht kürzere Schnitte direkt an der Wölbung vorbei angebracht werden.

Sie benötigen mehrere Materialien an Ihrem Arbeitsplatz, darunter eine 100- oder 200-µL-Pipette mit entsprechenden Spitzen, eine X-P-B-S-A-35-Millimeter-Scheibenplattenslide mit Deckglas, 90 % Glycerin und klaren Nagellack zur Präparatvorbereitung, ein Gestell zum Trocknen der Objektträger sowie eine Box mit Kim-Tüchern und einen Abfallbehälter für die Entsorgung. Zusätzlich zu diesen üblichen Materialien benötigen Sie auch einen Satz spezialisierter Mikrodissektionswerkzeuge, darunter gerade Pinzetten sowie 45-Grad-angewinkelte Pinzetten, die zum Halten, Drehen und allgemeinen Manipulieren des Auges während der Dissektion verwendet werden. Diese 15-Grad-Pinzetten weisen einen nach oben gerichteten Winkel auf und werden ebenfalls zum Handhaben und Manipulieren des Auges eingesetzt.

Schließlich benötigen Sie ein Paar Feder-Scheren. Es ist sehr wichtig, dass Sie Feder-Scheren und nicht herkömmliche Scheren verwenden. Stellen Sie vor Beginn dieser Dissektion sicher, dass die Sitzhöhe Ihres Stuhls so eingestellt ist, dass Ihre Augen auf gleicher Höhe mit den Okularen sind, wenn Sie aufrecht sitzen.

Das gebeugte Sitzen am Mikroskop verursacht Schulter- und Rückenschmerzen und beeinträchtigt die Qualität Ihrer Präparationen. Gießen Sie zunächst ein XPBS in den Deckel der 35-Millimeter-Schale. Überführen Sie dann die Augen, die Sie präparieren möchten, in die Schale.

Das ist ein Auge einer Wildtyp C57 Black Maus. Sie können es als sehr klein erkennen, etwa dreieinhalb Millimeter im Durchmesser. Die Trübung der Sklera verleiht ihm einen bläulichen Farbton.

Der erste Schritt bei der Dissektion besteht darin, alle überflüssigen Gewebe um das Auge herum zu entfernen, wie Muskelbindegewebe und den Sehnerv. Hier halte ich die 45-Grad-Pinzette in der linken Hand und die 15-Grad-Pinzette in der rechten Hand. Sie können ein Paar Pinzetten verwenden, um das Auge zu stabilisieren, während Sie mit der anderen das Gewebe wegziehen.

Wenn ein großes Gewebestück frei wird, wischen Sie die Pinzette vorsichtig an einem Kim-Tuch ab. Achten Sie darauf, das Auge nicht zu zerquetschen oder zu durchstechen. Einer der Vorteile dieser Dissektion in Suspension besteht darin, dass man das Bindegewebe leicht vom Auge wegschwimmen sehen kann.

Schließlich erreichen Sie einen Punkt, an dem Sie mit der Pinzette kein weiteres Gewebe mehr entfernen können. Ersetzen Sie Ihre 15-Grad-Pinzette durch die Feder-Schere. Benutzen Sie die Feder-Schere, um den Sehnerv abzuschneiden.

Verwenden Sie die Außenkante der Klinge, um das Gewebe in Richtung der Sklera-Kornea-Grenze voranzuschieben. Schneiden Sie dann nach und wischen Sie die Schere vorsichtig auf einem Kim-Tuch ab. Sehen wir uns das noch einmal an.

Schieben Sie das Gewebe mit der Außenseite der Schere nach vorne in Richtung der Grenze zwischen Hornhaut und Sklera, wenn das Gewebe nach oben abstehend ist. Schneiden Sie es zurecht, schieben Sie weiterhin Gewebeteile mit der stumpfen Kante der Schere nach vorne und schneiden Sie sie ab, bis das gesamte überflüssige Gewebe entfernt ist. Normalerweise befinden sich zwei Bänder aus straffem Gewebe am Auge.

Der erste sitzt am Übergang zwischen Hornhaut und Lederhaut an, der zweite wird gerade beschnitten. Hier befindet man sich etwa auf halbem Weg zwischen dem Übergang von Hornhaut und Lederhaut und dem Sehnervenkopf. Der nächste Schritt bei der Dissektion besteht darin, die Hornhaut und die Linse zu entfernen.

Verwenden Sie Ihre 45-Grad-Zange, um eine Klappe etwa in der Mitte der Hornhaut hochzuziehen. Benutzen Sie dann Ihre Feder-Schere, um einen kleinen Schnitt an der Basis der Klappe anzulegen. Führen Sie die untere Scherenklinge in den Schnitt unterhalb der Iris ein.

Führen Sie einen Schnitt in Richtung der Hornhaut-Lederhaut-Grenze durch, ohne diese jedoch zu verletzen. Drehen Sie langsam das Auge um 360 Grad und setzen Sie dabei kleine Schnitte entlang des gesamten Umfangs. Achten Sie darauf, die Schere unterhalb der Iris zu halten und gleichzeitig sowohl die Hornhaut als auch die Iris zu durchtrennen.

Es bedarf viel Übung, um dies so mühelos zu tun, wie ich es hier zeige. Sobald die Hornhaut entfernt ist, drehen Sie das Auge auf die Seite und drücken Sie vorsichtig von außen auf das Auge, um die Linse herauszudrücken. Die verbleibende Struktur wird anschließend cupförmig sein.

Das Auge muss viertelt werden. Dazu wird das Auge auf die Seite gedreht und die untere Klinge der Feder-Schere eingeführt. Ein Längsschnitt wird in Richtung, aber nicht bis zum Sehnervenkopf, angelegt.

Halten Sie dazu Ihre Arme an der Seite und die Schere etwa senkrecht zu Ihrem Körper und zum Augenschnitt vor sich. Führen Sie Ihren zweiten Schnitt direkt gegenüber dem ersten Schnitt aus. Nehmen Sie sich Zeit zum Ausrichten, damit Sie einen gleichmäßigen Schnitt ausführen können.

Mehrere Schnitte können zu Unebenheiten führen, sind jedoch, wenn sorgfältig ausgerichtet, nicht auffällig. Achten Sie darauf, wie ich mit dieser kugelförmigen Gestalt des Auges arbeite, anstatt dagegen, da das Auge seine normale Form beibehält. Wenn es in PBS suspendiert ist, erfolgt der Rest der Präparation auf einem Objektträger. Stützen Sie das Auge mit Ihrer um 45 Grad abgewinkelten Pinzette und heben Sie es aus dem PBS heraus.

Legen Sie das Auge auf eine frische Objektträgerplatte. Entfalten Sie das Auge vorsichtig mithilfe beider Paare schräger Pinzetten. Beachten Sie, dass ein schmaler Rand aus Kornea und Iris am Umfang des Auges vorhanden ist, der sich zum Handhaben eignet.

Danach müssen Sie jeden der vier Lappen in zwei Hälften schneiden. Drehen Sie das Auge so, dass sich einer der Lappen senkrecht zu Ihrem Körper befindet. Greifen Sie mit der 15-Grad-gekröpften Pinzette in die Ecke des Lappens.

Leicht anheben und dann einen Schnitt von der Grenze zwischen Hornhaut und Sklera in Richtung des Sehnervenkopfes führen. Diese Schnitte sollten senkrecht zu einer Tangente verlaufen. Eine Tangente ist eine Linie, die senkrecht zum Durchmesser steht.

Daher sollten Ihre Schnitte mit dem Durchmesser des Auges übereinstimmen. Drehen Sie nun das Präparat, sodass das nächste Blütenblatt senkrecht zu Ihrem Körper steht, und wiederholen Sie den Vorgang. Greifen Sie die Ecke des Blütenblatts.

Lösen Sie leicht an und schneiden Sie. Wiederholen Sie dies, bis jeder der vier großen Lappen halbiert ist. Die weißliche Substanz ist die Nervenretina, die direkt über dem retinalen Pigmentepithel (RPE) liegt.

Die Netzhaut kann das retinale Pigmentepithel schützen, daher belassen Sie sie unversehrt, bis alle Ihre Schnitte durchgeführt wurden. Achten Sie darauf, wie die „Pedale“ leicht gekrümmt sind. Arbeiten Sie nicht gegen diese Krümmung an.

Nehmen Sie sich Zeit zum Ausrichten, damit Sie einen sauberen einzelnen Schnitt durchführen können. Da das Auge rund ist, neigt es dazu, sich zu verformen; um dieser Verformung entgegenzuwirken, können Sie acht kurze Schnitte anbringen.

Einer an jedem Blütenblatt. Wenden Sie die gleiche grundsätzliche Strategie wie in der vorherigen Runde mit vier Schnitten an. Heben Sie die Ecke des Blütenblatts an und schneiden Sie, aber in diesem Fall nur etwa bis zur halben Länge des Blütenblatts.

Nachdem Sie alle Schnitte ausgeführt haben, können Sie die Nervenretina entfernen. Hier füge ich einige Tropfen 1× PBS zur Probe hinzu. Sie sollten vermeiden, dass Ihr RPE austrocknet.

Die Netzhaut sollte nur locker mit dem darunterliegenden Pigmentepithel verbunden sein. Man sieht, dass sie sich leicht ablöst. Allerdings bleibt sie gewöhnlich an der korneoskleralen Grenze haften, die auf der Innenseite des Auges eine warzige Erhebung darstellt, die als Ziliarkörper bezeichnet wird.

Sie können die Spitze Ihrer 15-Grad-Zange in den Sehnervenkopf einführen, um die Probe zu verankern, während Sie die Netzhaut ablösen. Der Ziliarkörper markiert den Rand des Pigmentepithels (RPE), dem dunkel pigmentierten Gewebe, das abgelöst wurde. Hier befindet sich die Regenbogenhaut, nicht das RPE.

Ich empfehle, so viel wie möglich von der Iris zu entfernen, da sie sehr klebrig ist und sich zusammenfalten und an der Pigmentepithelschicht (RPE) festsetzen kann, wenn die Netzhaut brüchig ist oder Reste an der RPE haften bleiben. Wahrscheinlich ist eines von zwei Dingen schiefgelaufen: Entweder die Augen wurden nicht korrekt fixiert, beispielsweise zu lange oder zu kurz, oder sie wurden vor der Dissektion zu lange gelagert.

Das Pedal, das ich hier frelege, verfügt noch nicht über eine Tastenkombination. Sie können sehen, wie das Pedal etwa ein Drittel des Weges vom Rand der RPE entfernt liegt. Aus diesem Grund werden die acht Tastenkombinationen empfohlen.

Nachdem das gesamte neurale Netzhautgewebe verworfen wurde, spülen Sie das retinale Pigmentepithel mehrmals mit 100 bis 200 Mikrolitern PBS unter Verwendung einer Pipette, bis sämtlicher Staub und sämtliche Ablagerungen entfernt sind. Geben Sie 80 bis 90 Mikroliter 90 % Glycerin mittels Pipette auf einen frischen Objektträger in rechteckiger Form auf. Beachten Sie, dass dies das optimale Volumen an Glycerin für ein Deckglas mit den Maßen 22 mal 50 Millimeter ist und entsprechend angepasst werden sollte.

Bei anderen Größen von Deckgläsern verwenden Sie die Pipettenspitze, um das Glycerin zu verteilen. Achten Sie darauf, keine Luftblasen in das Glycerin einzubringen. Sollte sich dennoch eine Blase bilden, führen Sie sie an den Rand, wo sie platzen wird.

Schieben Sie den unteren Arm Ihrer 15-Grad-Pinzette unter das RPE und heben Sie es vorsichtig an. Senken Sie das RPE langsam in das Glycerin ab. Das RPE schwimmt auf der Glycerinoberfläche und kann sich etwas wellen oder verdrehen. Richten Sie das RPE mit der Pinzette gerade und ziehen Sie das Glycerin über die Oberfläche des RPE.

Wenn sich Luftblasen bilden, schieben Sie diese beim Vorgang an den Rand, wo sie platzen, indem Sie das Deckglas in einem Winkel von etwa 45 Grad halten. Berühren Sie damit die Kante des Glycerins.

Bewegen Sie sie dann zur Kante der Objektträgerplatte. Halten Sie die Unterseite des Deckglases mit Daumen und Zeigefinger fest und stützen Sie die gegenüberliegende Kante mit Ihren 15-Grad-Pinzetten. Senken Sie das Deckglas sehr langsam auf den Objektträger ab, sobald der Kontakt hergestellt ist.

Beim RPE das Absenken stoppen und zulassen, dass das Glycerin weiterwandert, während Sie Ihre Deckglas langsam absenken. Wenn Sie das Deckglas zu schnell absenken, bilden sich hier Luftblasen in Ihrem Präparat. Ich werde das Deckglas langsam absenken, sobald es das RPE berührt, und das Wandern des Glycerins zulassen.

Sie können sehen, wenn ich das Deckglas schnell loslasse, werden Luftblasen eingeschlossen. Verwenden Sie eine reichliche Menge klaren Nagellack, um den Rand des Deckglases am Objektträger entlang des gesamten Umfangs anzubringen.

Dies ist ein typisches RPE von einer C57 black Maus. Es ist normal, die darunterliegende Gefäßstruktur zu sehen, wie hier dargestellt. Es ist ebenfalls normal, gewisse Variationen in der Pigmentierung zu beobachten, beispielsweise Flecken, die weniger pigmentiert erscheinen.

Jedoch sind klare Stellen wie diese wahrscheinlich auf eine physische Schädigung des retinalen Pigmentepithels (RPE) und der darunterliegenden Aderhaut zurückzuführen. Da auch die Aderhaut des Auges pigmentiert ist, kann eine Schädigung eines schwarzen RPE unauffällig bleiben, wenn die Aderhaut intakt bleibt.

Dies ist ein typisches RPE von einer verdünnten Maus. Wie angegeben, können Sie die Gefäße sehen, und es wird einige Variationen in der Pigmentierung geben, wie dunklere und hellere Flecken. Es ist jedoch nahezu unmöglich, Schäden an einem verdünnten RPE zu erkennen.

Sind diese kleinen Flecken Schäden oder eine normale Variation der Pigmentierung? Ich schlage Foid und Färbung vor, um diese Frage zu klären. Dies gibt Ihnen einen Hinweis darauf, ob Sie die I zwei zu grob behandeln.

Die Färbung hebt die Zellmembranen deutlich hervor, wodurch Schadstellen offensichtlich werden. Tatsächlich ist das retinale Pigmentepithel (RPE) jedoch ziemlich widerstandsfähig, und wenn Sie das Auge am Kornea-Gewebe anfassen, ist es unwahrscheinlich, dass Sie Schäden verursachen. Hier sehen Sie eine Ganzpräparation mit zahlreichen Problemen, wobei das geringste Problem hier ein zu breiter Kornea-Rand ist, der zu Verwerfungen und Faltenbildung des gewundenen Materials führen kann. Sie können hier ein massives überflüssiges Gewebe erkennen, das auf der Rückseite des Auges verblieben ist.

Dieses Pedal ist teilweise umgefaltet, und hier sehen Sie, dass das retinale Pigmentepithel (RPE) teilweise gerissen wurde. Ein weiteres Problem ist, dass dieses Auge das Aussehen eines Windrads aufweist. Hier habe ich die Winkel der Schnitte eingezeichnet.

Doch so hätten sie aussehen sollen. Denken Sie daran, dass Ihre Schnitte senkrecht zur Tangente und entlang des Durchmessers verlaufen sollten. Ich habe soeben demonstriert, wie man ein Mausauge für eine Ganzpräparat-Präparation des retinalen Pigments präpariert.

Epithel, das Wichtigste ist, eine gute Haltung beizubehalten, aber versuchen Sie, entspannt zu bleiben. Ich hoffe, dieses Video war für Sie hilfreich und wünsche Ihnen alles Gute für Ihre zukünftigen Experimente.