Name: Organotypische Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Erfahren Sie, wie man organotypische Kleinhirnkulturen aus Wildtyp- und Knockout-Mäusen erstellt und apoptotische Reize mit Fast Ligand untersucht. Diese Methode ermöglicht detaillierte Analysen zerebellärer Zellpopulationen mittels Immunfluoreszenzfärbung.

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Diese Studie wurde zum Teil durch die IPSEN-Stiftung finanziert. IMV ist ein American Cancer Society Professor für Molekularbiologie, und hält die Irwin und Joan Jacobs Lehrstuhl in Beispielhafte Life Sciences. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus dem NIH, Leducq Foundation, Mériaux Stiftung Ellison Medical Foundation, Ipsen / Biomeasure, Sanofi Aventis, Prostate Cancer Foundation, und die HN und Frances C. Berger Stiftung unterstützt. PAS wird von McKnight Endowment Fund for Neuroscience und dem National Institute on Drug Abuse (R01 DA019022) finanziert. Die Autoren bedanken sich bei Mark Schmitt bedanken. Graphik wurde von Jamie T. Simon entwickelt. Sponsorship wurde freundlicherweise von Invitrogen zur Verfügung gestellt.

1. Organotypische Cerebellar Cultures: <ol><li> Um erfolgreich zu generieren organotypischen Kleinhirn Kulturen verwenden Mäusen zwischen P0-P3 oder P8-P12. Für unser Experiment benutzten wir Mäuse in der P8-P12 Bereich, weil dieser Entwicklungsstufe war besser geeignet für unsere Studie. </li><li> Bereiten Sie die Präparation und das Kulturmedium: <ol><li> Brain-Dissektion und in Scheiben schneiden Zubereitung sind in niedrigen Natriumgehalt Artificial Liquor (ACSF) mit 1 mM Calciumchlorid, 10 mM D-Glucose, 4mm Kaliumchlorid, 5 mM Magnesiumchlorid, 26mm Natriumbicarbonat, 246mm Saccharose und Phenolrot-Lösung (1:1000) durchgeführt , pH 7,3. Zu sterilisieren die Lösung, zu filtern durch eine .22 um Filter und lagern bei 4 ° C. </li><li> Zerebelläre Scheiben sind in 75% Minimum Essential Medium Eagle (MEM), 25% Hitze-inaktiviertem Pferdeserum, 25mm HEPES, 1 mM Glutamin, 5 mg / ml Glucose, Penicillin (100 U / ml) und Streptomycin (100 U / ml) kultiviert. Filter das Medium durch ein 0,22 um-Filter und lagern bei 4 ° C für maximal zwei Wochen. </li></ol></li><li> Dissect Gehirn in eiskaltem ACSF Medium zuvor mit Carbogen (95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid) Hinweis sprudelte, wird diese Sättigung mit Carbogen Änderung des pH-Wertes der Lösung so aus rot bis orange werden sich verschieben. Die Dissektion sollte im Minimum an Zeit möglich darauf achten, daß die Struktur des Gehirns Schäden durchgeführt werden. </li><li> Scheiben des Gehirns in Sagittalschnitten von 400 um mit einer Vibratom. <ol><li> Machen Sie einen sagittalen Schnitt mit einer Rasierklinge in einer Hemisphäre, versuchen, so wenig wie möglich des Kleinhirns geschnitten, das wird eine ebene Fläche zum Schneiden bieten. Der Kortex ist nur zur Unterstützung eingesetzt, um das Schneiden leichter, aber da die Zeit ein wichtiges Thema ist es bequemer, schneiden Sie die rostralen Hälfte des Kortex mit einer Rasierklinge. </li><li> Verwenden Sie Cyanacrylat (Sekundenkleber), um die Position des Gehirns auf das Metall Vibratom befestigen. Es ist wichtig, die Platte auf Eis, bevor Sie den Kleber entspannen und es gut verteilt mit der Spitze des Rohres zu einer dünnen Klebeschicht zu bilden. Wenn es einen Überschuss von Sekundenkleber, wird es von der Platte zu lösen, wenn es in Kontakt mit dem ACSF und die Probe verloren geht. </li><li> Sobald das Gehirn ist es, die Vibratom befestigt, fügen Sie genug ACSF Medien an das Gehirn abdecken und Eis unter der Platte zu halten es kalt. </li><li> Cut 400 um Scheiben schneiden und übertragen Sie sie mit einem Kunststoff-Pasteurpipette (Schnitt die Spitze, um es zu erweitern und Vermeidung von Schäden an den Scheiben) zu einer 6-well Zellkulturplatte mit ACSF auf Eis. </li><li> Separate das Kleinhirn aus dem Rest des Gehirns mit Hilfe von zwei Insulinspritzen (Spritzen mit kleinem Durchmesser 28-Gauge-Nadeln) unter dem Binokular. Einige Scheiben haben Sekundenkleber an den Rändern befestigt: Das ist der Moment, um zu versuchen, es zu entfernen, da sie die Lebensfähigkeit der Scheibe auswirken kann. Es ist wichtig, um es vorsichtig tun, ohne die Struktur des Kleinhirns. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die zerebelläre Scheiben auf 6-well-Platten mit 30mm Zellkulturplatten-Einsätze mit 0,4 pm Poren. 1 ml der Kultur Medien pro Vertiefung, die durch Inkubation für mindestens 2 Stunden vorkonditioniert bei 37 ° C und 5% CO 2 (in der Zellkultur-Inkubator). Legen Sie die Einsätze auf der Oberseite der Medien machen, dass es keine Luftblasen unter und dann die zerebelläre Scheiben (1-3 pro Einsatz) auf der Oberseite der Einsätze machen, dass sie voll ausgefahren sind und dass keine Flüssigkeit zu überdecken. Saugen Sie über Medien, falls erforderlich. Bei 37 ° C und 5% CO 2 Änderung der Kulturmedien alle 2 oder 3 Tage. Am besten ist es nur ein Teil des Mediums (zB ½ Volumen) auf einmal zu ersetzen, da verwendete Medium enthält slice-derived trophischen Faktoren, die wichtig für das Überleben der Zelle. </li></ol> 2. Fas Behandlung und Färbung von zerebelläre Scheiben: <ol><li> Für die apoptotischen Herausforderung Experiment haben wir zunächst Kultur die Scheiben für 5 Tage verändernden Medienlandschaft am Tag in vitro 3 (DIV3). Auf DIV5 Kulturen werden mit 0,5 g / mL der Fas-Agonisten-Antikörper Jo2, indem Sie es direkt an die Medien, um einen sauberen Hintergrund des Zelltods, da die Veränderungen der Medien behandelt induzieren können einige Sterblichkeit in den Kulturen. Die Hälfte der Brunnen sind unbehandelt als Kontrolle. </li><li> Nach 24 Stunden entfernen Sie die Medien unter der Einsätze durch Absaugen. Zur Fixierung der Scheiben, 1 mL eiskaltem 4% PFA unter und 1 mL oberhalb des Einsatzes. Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Nach 10 Minuten entfernen Sie die PFA und waschen kurz mit kaltem PBS. </li><li> Nächstes entfernen Sie die PBS und 1 ml unter und 1 mL oberhalb des Einsatzes von 20% eiskaltem Methanol in PBS und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Dann wird noch einmal mit PBS und 1 ml unter und 1 mL oberhalb des Einsatzes von 0,5% Triton-X-100 in PBS zur Permeabilisierung. Inkubieren für ein Minimum von 12 Stunden bei 4 ° C. </li><li> Nach Permeabilisierung mit 20% BSA in PBS-Block für ein Minimum von4 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. In diesem Stadium der Scheiben können in Blocking-Lösung für mindestens 3 Tage bei 4 ° C aufbewahrt werden </li><li> Um Flecken auf den Scheiben schneiden Sie vorsichtig das Stück der Membran auf die Kleinhirn-Scheibe befestigt einfügen und sie auf 24-Well-Platten mit PBS. </li><li> Die Immunfärbung erfolgt sequentiell, getan zuerst mit TUNEL-Reagenz für 1 Stunde und dann mit Calbidin Antikörper über Nacht. <ol><li> Saugen Sie das PBS und fügen 250 ul off TUNEL-Reagenz in jedes Well sicherstellen, dass es auf der gesamten Oberfläche der Scheibe. Bei 37 ° C für eine Stunde im Dunkeln. </li><li> Nach einer Stunde entfernen Sie die TUNEL-Mix und waschen mit PBS dreimal für 10 Minuten. </li><li> Nach der letzten Waschung, entfernen Sie die PBS und fügen 250 ul einer 1 / 1000 Verdünnung des Calbindin Antikörper in PBS und Inkubation über Nacht bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Entfernen Sie den primären Antikörper-Lösung und Waschen mit PBS dreimal für 10 Minuten. </li><li> Add 250 ul des sekundären Antikörper verdünnt 1 / 500 in PBS und Inkubation für mindestens drei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln. Die TUNEL-Kit verwendeten wir mit TMR rot markiert, damit unsere sekundären Antikörper für Calbindin konjugiert ist Alexa-488. </li><li> Dreimal 10 Minuten lang mit PBS und montieren Sie die Scheiben auf einem Glasobjektträger mit einem Eindeckmittel dass DAPI enthält. </li><li> Bild die Scheiben mit einem konfokalen Mikroskop mit der 488 nm und 561 nm Wellenlänge Anregung für Calbindin und TUNEL jeweils. </li></ol></li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: Die größte Herausforderung dieses Protokolls ist in der Lage sein, gesunde Kleinhirn Scheibe Kulturen zu generieren, zumal unsere letzte Anzeige wird Zelltod werden. Eine gesunde Kultur erscheint als eine, wo die Zellkörper Schicht ist transparent und erlaubt Ihnen, die blättrige Struktur des Kleinhirns unter dem Mikroskop (Abbildung 1) zu sehen. Nach wenigen Tagen in Kultur die Scheiben beginnen zu dünn und nicht-neuronalen Zellen zu beobachten Migration weg von den Rändern der Scheibe sein. Die dunkle runde Zellen (wahrscheinlich Makrophagen), dass die Scheiben bedecken nach wenigen Tagen in Kultur, wird schließlich an Zahl abnehmen nach 10-14 Tagen in vitro (Abbildung 2) 5. Der ultimative Beweis für die Lebensfähigkeit der Scheiben ist für unterschiedliche zelluläre Marker, wie Calbindin für die Purkinjezellen Fleck. Abbildung 3 zeigt eine repräsentative konfokalen Mikroskop Bild der Purkinje-Zellschicht mit mehreren TUNEL positive Kerne. Es ist wichtig zu bedenken, dass, selbst wenn einige Scheiben erhielt einen apoptotischen Stimulus, sie seien nur für 24 Stunden ausgesetzt. Dies ermöglichte es genügend Zeit, um DNA-Fragmentierung in den sterbenden Zellen mit der TUNEL-Färbung zu beobachten, sondern eine definierte Purkinje-Zellschicht noch vorhanden war. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Gesunde Kleinhirn Scheibe bei DIV2. Dieses Bild zeigt die transluzente Zellkörper Schicht und die blättrige Struktur des Kleinhirns in einem gesunden Stück. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Gesunde Kleinhirn Scheibe an DIV 7. In diesem Bild können wir immer noch beobachten, die blättrige Struktur des Kleinhirns und das Auftreten von dunklen Zellkörper. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Repräsentatives Bild der Fas-behandelten Kleinhirn in Scheiben schneiden. Das konfokale Abbildung zeigt die Purkinje-Zellen mit Calbindin (grün) und die apoptotischen Zellen positiv für TUNEL-Färbung (rot) gefärbt. Purkinje-Zellen nicht in einer einzigen Zeile erscheinen, sind aber geclusterten Bildung einer folium-ähnliche Struktur.

<ol><li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+ependymal+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Human fetal ependymal cells in tissue cultures.</a> Anat Rec. 99, 523-529 (1947).</li>
<li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+studies+of+human+fetal+brain+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Etudes+Neonatales%22%5BJournal%5D)">Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures.</a> Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).</li>
<li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+protocol+for+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeat%2C+H+%22Organotypic+Slice+Cultures+of+Neural+Tissue+in+Culturing+Nerve+Cells%22">Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).</li>
</ol>

Alle tierischen Arbeit durchgeführt wurde in Übereinstimmung mit den Sicherheitsrichtlinien des IACUC gegründet getan. Die Salk-Institut ist eine AAALAC akkreditierten Labor.

Diese Methode beschreibt eine der vielen möglichen Anwendungen von neuronalen organotypischen Kulturen und es hat uns erlaubt, die Wirkung von apoptotischen Stimuli in Wildtyp und Mutante zerebelläre Scheiben zu studieren. Der wichtigste Teil dieses Experiments ist in der Lage sein, konsequent zu erzeugen gesunde Kleinhirn Scheibe Kulturen. Die wichtigsten Faktoren sind Dissektion und Schneiden-Technik und die Fähigkeit, das Protokoll in der kürzesten Zeit möglich durchzuführen, aber gleichzeitig darauf achten, daß die Scheiben beschädigt. Ein weiterer entscheidender Faktor ist die Herstellung und Zusammensetzung der Nährmedien, werden diese Kulturen sehr empfindlich, so mussten wir einige Rezepte und Marken der Medien zu testen. Selbst unterschiedliche Chargen von Serum oder andere Komponenten der Medien konnte die Lebensfähigkeit der Scheiben. Wir haben die besten Ergebnisse mit dem Pferd Serum von Invitrogen Lot # 480116. Sobald die zerebelläre Scheiben erzeugt werden kann Studie des Kleinhirns Entwicklung, Elektrophysiologie, das Überleben der Zelle allein oder in Reaktion auf apoptotische Stimuli, Exzitotoxizität oder Sauerstoffmangel. Vergleichende Studien mit Wildtyp und Mutante zerebelläre Scheiben sind sehr aufschlussreich in vielen Aspekten des Kleinhirns Funktion und Entwicklung.

<table><tbody><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Krazy Glue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturplatten mit 6 bzw. 24 Vertiefungen</td><td>Corning</td><td>3506/3527</td><td></td></tr><tr><td>Kulturplatten-Einlegeböden mit 30 mm Durchmesser (0,4-&amp;mu;m-Poren)</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Reinanti-NA/LE-Hamster-anti-maus-CD95 (Jo2)</td><td>BD Biosciences</td><td>554254</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;In-situ&lt;/em&gt;-Kit zur Detektion von Zelltod, TMR rot</td><td>Roche Group</td><td>12 156 792 910</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen-Anti-Calbindin-D-28k-Antikörper</td><td>Swant</td><td>CB-38a</td><td></td></tr><tr><td>Sekundärantikörper: Alexa 488-markiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield-Montagemedium mit DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Präparationsmikroskop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

organotypische cerebellar cultures: apoptotic challenges and detection

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypischen Kulturen von neuronalen Gewebe wurden zuerst von Hogue 1947 1,2 eingeführt und war ein wichtiger Durchbruch auf dem Gebiet der Neurowissenschaften. Seitdem wurde die Technik weiter entwickelt und derzeit gibt es viele verschiedene Möglichkeiten, um organotypischen Kulturen vorzubereiten. Die hier vorgestellte Methode wurde von der von Stoppini et al angepasst. Für die Vorbereitung der Scheiben und von Gogolla et al. Für die Färbung 3,4. Ein einzigartiges Merkmal dieser Technik ist, dass man auf verschiedene Teile des Gehirns wie Hippocampus oder Kleinhirn in ihrer ursprünglichen Struktur Studium ermöglicht und bietet einen großen Vorteil gegenüber dissoziierten Kulturen, in denen alle zellulären Organisation und neuronale Netzwerke gestört werden. Im Falle des Kleinhirns ist es noch vorteilhaft, weil sie das Studium der Purkinje-Zellen, äußerst schwierig, wie distanziert primären Kultur erhalten können. Diese Methode kann verwendet werden, um bestimmte Entwicklungsstörungen Funktionen des Kleinhirns in-vitro-Studie, sowie für die elektrophysiologischen und pharmakologischen Experimente sowohl in Wildtyp-und mutierten Mäusen werden. Die hier beschriebene Methode wurde entwickelt, um die Wirkung von apoptotischen Stimuli wie Fas-Ligand in den Entwicklungsländern Kleinhirn Studie mit TUNEL-Färbung zur Apoptose zu messen. Wenn TUNEL Färbung mit Zelltyp spezifische Marker, wie Calbindin für Purkinjezellen kombiniert wird, ist es möglich, den Zelltod in einer Zellpopulation gezielt auszuwerten. Die Calbindin Färbung dient auch dem Zweck der Beurteilung der Qualität des Kleinhirns Kulturen.

Diese Methode beschreibt die Erzeugung von organotypischen Kleinhirn Kulturen und die Wirkung bestimmter apoptotischen Stimuli auf die Lebensfähigkeit der verschiedenen Zelltypen des Kleinhirns.

Organotypische Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypische Kulturen von neuronalem Gewebe wurden erstmals 1947 von Hogue eingeführt 1,2 und stellten einen bedeutenden Durchbruch auf dem Gebiet der Neurowissenschaften dar. ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Wirkung des apoptotischen Stimulus Fast-Ligand im sich entwickelnden Kleinhirn von Wildtyp- und Mutantenmäusen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gehirn von Wildtyp- und Knockout-Mäusen zwischen den postnatalen Tagen acht und zwölf präpariert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Gehirne in 400 µm dicke Schnitte zu zerteilen und das Kleinhirn aus jedem Schnitt zu isolieren.Der dritte Schritt besteht darin, die zerebellären Schnitte fünf Tage lang zu kultivieren, um sicherzustellen, dass sie gesund sind, bevor die Zelltodinduktion mit Fast-Ligand erfolgt. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Analyse der Wirkung des Fast-Liganden in den verschiedenen zerebellären Zellpopulationen von Wildtyp- und Knockout-Mäusen basierend auf immunfluoreszenzbasierter Färbung für den apoptotischen Marker TUNEL in Kombination mit zellspezifischen Markern wie Calbindin für Bikini-Zellen. Der Hauptvorteil von zerebellären Lebenskulturen liegt darin, dass sie die Erhaltung der zerebellären regionalen Struktur ermöglichen, im Gegensatz zu primären dissoziierten Kulturen, bei denen neuronale Netzwerke und die zelluläre Organisation unterbrochen werden.Daher ermöglicht diese Methode, einige zentrale Fragen der Neurowissenschaften zu beantworten, insbesondere weil man über die Wildtyp- und die Mutantenmaus verfügt. So kann man die vergleichende Entwicklung untersuchen, ebenso wie die Physiologie sowie die Elektrophysiologie und Pharmakologie. Obwohl diese Methode Einblicke in die Funktion von Fast-Ligand bei der zerebellären Zellüberlebensfähigkeit ermöglichen kann, lässt sie sich auch zur Untersuchung der Effekte von Fast-Ligand im Cortex und Hippocampus verwenden.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da es entscheidend ist, die Zerebellargewebestücke so schnell wie möglich in Kultur zu überführen, ohne ihre Integrität zu beeinträchtigen, um eine gesunde zerebelläre Lyse zu erhalten. Daher ist es wichtig, über gute Fähigkeiten in der Dissektion und im Schneiden von Schnitten zu verfügen, bevor der gesamte Prozess durchgeführt wird. Wo immer möglich.Die Schritte des folgenden Verfahrens sollten vor der Dissektion in einer Zellkulturhaube durchgeführt werden. Bereiten Sie ein CSF-Medium für die Gehirndissektion und die Schnittpräparation sowie ein Schnittkulturmedium gemäß dem schriftlichen Protokoll vor und lagern Sie diese am Tag der Dissektion bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie Zellkulturplatten zur Kultivierung der zerebellären Schnitte vor.Geben Sie ein Milliliter Schnittkulturmedium in jede Vertiefung einer 6-Loch-Platte. Verwenden Sie dann sterile Pinzette, um die Kulturplatten-Einlagen in jede Vertiefung zu legen. Achten Sie darauf, dass sich keine Luftblasen unter der Einlage befinden.Stellen Sie die Kulturplatte in einen Gewebekultur-Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid eingestellt ist, und präkonditionieren Sie das Medium mindestens zwei Stunden lang. Danach sprudeln Sie das eiskalte ACSF-Medium mit Carbogen-Gas durch. Die Sättigung des Mediums mit Carbogen verändert den pH-Wert der Lösung und führt zu einer Farbänderung von rot nach orange.Geben Sie etwas eiskaltes, mit Gas durchperlte A-CSF-Medium in eine sterile Petrischale und eine 6-Loch-Platte. Stellen Sie diese zusammen mit der Platte des Vibroschneidegeräts, die zum Schneiden des Gehirns verwendet wird, auf Eis. Die Petrischale mit dem eiskalten, mit Gas durchperlten A-CSF-Medium dient zum Dissektieren des Gehirns eines P8 bis P12-Mäusewelpen nach der Sektion.Verwenden Sie eine Rasierklinge, um eine sagittale Schnittfläche in einer Hemisphäre zu erzeugen, um eine ebene Fläche für die Befestigung auf der Vibram-Platte zu erhalten. Der rostrale Teil der Großhirnrinde kann ebenfalls abgeschnitten werden. Trocknen Sie die gekühlte Vibram-Platte mit einem Papiertuch ab.Tragen Sie dann etwas Sekundenkleber auf die Plattform auf und verteilen Sie ihn zickzackförmig mit der Spitze der Sekundenkleberflasche. Um eine dünne Klebeschicht zu bilden, übertragen Sie das Gehirn mit einem Spatel auf die Vibratomplatte, wobei die abgeflachte Seite mit dem Sekundenkleber in Kontakt steht. Sobald das Gehirn an der Vibratomplatte befestigt ist, geben Sie so viel ACSF-Medium hinzu, dass das Gehirn bedeckt ist, und legen Sie Eis unter die Platte, um es kühl zu halten.Schneiden Sie das Gehirn in 400 Mikrometer dicke Schnitte. Verwenden Sie dann eine Plastik-Pasta-Pipette mit einem aufgeschnittenen, verbreiterten Ende, um die Schnitte unter dem Stereomikroskop in eine 6-Loch-Platte mit A-CSF-Medium auf Eis zu überführen.Verwenden Sie zwei Insulinspritzen mit dünnen Nadeln der Größe 28 Gauge, um das Kleinhirn vom restlichen Gehirn zu trennen. Falls sich an einigen Schnitten Klebstoff am Rand befindet, entfernen Sie diesen mithilfe der beiden Spritzennadeln. Überführen Sie die Schnitte mit einer Plastikspaghettipipette, deren Ende abgeschnitten und verbreitert wurde, auf die Oberseite der Filter.Das Hinzufügen von ein bis drei Schnitten pro Insert stellt sicher, dass die Schnitte vollständig ausgebreitet sind und keine Flüssigkeit sie bedeckt. Gegebenenfalls überschüssiges Medium mit der Pipette abpipettieren, einsetzen, 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 48 Stunden inkubieren. Nach 48 Stunden die Hälfte des Mediumvolumens durch frisches Medium ersetzen, wobei sichergestellt werden muss, dass keine Luftblasen unterhalb des Inserts eingeschlossen sind.Das verbleibende ursprüngliche Medium enthält geschnittene, abgeleitete trophische Faktoren, die für das Zellüberleben wichtig sind. Die apoptotische Belastung wird nach fünf Tagen Kultivierung durchgeführt. Geben Sie den schnellen agonistischen Antikörper JO zwei zu den Zellkulturmedien in den zu behandelnden Vertiefungen hinzu.Lassen Sie die Hälfte der Vertiefungen unbehandelt als Kontrollen. Nach 24 Stunden saugen Sie das Medium unter den Vertiefungen ab. Fixieren Sie dann die Schnitte, indem Sie mit einer Pipette ein Milliliter eiskaltes, 4 % Paraformaldehyd unter den Insert und ein Milliliter PFA auf den Insert geben.Lassen Sie die Schnitte in der PFA fixieren, danach 10 Minuten bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie die PFA und waschen Sie kurz mit zwei Milliliter kalter PBS mittels Pipettierung. Ein Milliliter auf den Insert und ein Milliliter unter den Insert.Als Nächstes das PBS abpipettieren und einen Milliliter 20 % kaltes Methanol in PBS unterhalb des Inserts sowie einen Milliliter oberhalb des Inserts pipettieren. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dann das 20 %ige Methanol aus der Vertiefung abpipettieren und die Schnittstelle sowie die D-Vertiefung mit PBS waschen. Wie zuvor einen Milliliter 0,5 % Triton X-100 in PBS auf das Insert und einen weiteren Milliliter unter das Insert pipettieren.Inkubieren Sie mindestens 12 Stunden bei vier Grad Celsius, um die Schnitte nach der Permeabilisierung zu durchtränken. Aspirieren Sie das 0,5 %ige Triton X-100 in PBS und pipettieren Sie ein Milliliter 20 % BSA in PBS auf den Schnitt und ein Milliliter unter den Schnitt. Blockieren Sie die Schnitte mindestens vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius.Wenn die Blockierung abgeschlossen ist, verwenden Sie saubere Schere, um vorsichtig das Stück Membraninsert, das an der Kleinhirnschnittpräparat befestigt ist, abzuschneiden. Verwenden Sie dann saubere Pinzette, um das Membranstück in eine 24-Loch-Platte mit PBS zu überführen, aspirieren Sie den PBS und geben Sie 250 Mikroliter Tunnel-Reagenz in jedes Loch. Achten Sie darauf, dass das Reagenz die gesamte Oberfläche des Schnittpräparats bedeckt.Inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius im Dunkeln, sobald die Stunde abgelaufen ist. Aspirieren Sie das Tunnel-Reagenz aus den Vertiefungen und ersetzen Sie es durch 500 Mikroliter PBS. Schützen Sie die Platte vor Licht und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur 10 Minuten lang zum Waschen.Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal nach der letzten Waschung. Aspirieren Sie das PBS und geben Sie 250 Mikroliter einer 1:1000-Verdünnung des Calbindin-Antikörpers in PBS hinzu. Inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Am nächsten Tag.Die Primärantikörperlösung abpipettieren und dreimal für jeweils 10 Minuten mit PBS waschen. Anschließend 250 Mikroliter Sekundärantikörper, verdünnt im Verhältnis 1:500 in PBS, hinzufügen. Die Platte mit Aluminiumfolie abdecken, um sie vor Licht zu schützen, und danach mindestens drei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.Waschen Sie die Schnitte dreimal für jeweils 10 Minuten mit PBS und verwenden Sie Eindeckmedien, die Dappy enthalten. Bringen Sie die Schnitte auf einem Glasobjektträger mit Deckglas an. Bilden Sie die Schnitte mit einem konfokalen Mikroskop unter Verwendung der Anregungswellenlängen von 488 Nanometern bzw. 561 Nanometern für Kale, Bendin und Tunnel ab.Dieses Bild zeigt einen gesunden Kleinhirnschnitt. Nach zwei Tagen *in vitro* erscheint die Zellschicht durchscheinend und die gefaltete Struktur des Kleinhirns ist deutlich unter dem Mikroskop zu erkennen. Nach sieben Tagen *in vitro* ist die gefaltete Struktur des gesunden Kleinhirnschnitts weiterhin sichtbar.Außerdem bedecken dunkle Zellkörper, vermutlich Makrophagen, normalerweise das Schnittpräparat. Das hier gezeigte konfokale Bild ist repräsentativ für ein schnell behandeltes zerebelläres Schnittpräparat. Die Bikini-Zellen erscheinen nach Färbung mit einem primären Antikörper, gefolgt von einem mit Alexa 488 konjugierten sekundären Antikörper, grün. Die apoptotischen Zellen, die im TUNEL-Färbetest positiv sind, erscheinen rot, da das verwendete TUNEL-Kit mit TMR markiert ist. Rote Bikini-Zellen erscheinen nicht in einer einzelnen Reihe, sondern in Haufen, die eine strukturähnliche Anordnung bilden, während dieses Verfahren durchgeführt wird. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, nach Möglichkeit stets im Zellkulturhaubenarbeitsplatz zu arbeiten und die Zeit, in der das zerebrale Gewebe möglichen Kontaminanten wie Bakterien oder Pilzen ausgesetzt ist, auf ein Minimum zu beschränken.Mit diesem Verfahren können weitere Methoden auf diese Schnitte angewendet werden, einschließlich biochemischer und elektrophysiologischer Analysen, um zusätzliche Informationen zum Proteingehalt sowie zur neuronale Erregbarkeit zu erhalten. Diese Technik wurde ursprünglich entwickelt, um die Wirkung eines schnell vermittelten Zelltods in Perkin-Zellen zu untersuchen, die Mutationen aufweisen, welche den schnellen Signalweg beeinflussen. Perial-Zellen überleben selten in primärer Kultur.Daher war dieses Verfahren der beste experimentelle Ansatz. Ich hoffe, dass Sie nach dem Anschauen dieses Videos eine gute Vorstellung davon haben, wie man zerebelläre Schnitte herstellt und wie man die Wirkung apathischer Reize auf verschiedene zerebrale Zelltypen untersuchen kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Live-Cell-Imaging von Caspase-3-vermittelte Apoptose in verewigt N19-Oligodendrozyten-Zellkulturen unter Verwendung...

Überwachung Cleaved Caspase-3 Aktivität und Apoptose von Immortalized Oligodendrozyten mit Live-cell Imaging und Cleaveable Fluorogenic-Farbstoff-Substrate Nach Kalium-induzierten Membrandepolarisation

Wir präsentieren ein Protokoll, das zu sehen und zur quantitativen Beurteilung der Morphologie der dendritischen Baumes der einzelnen Purkinje-Zellen im Kleinhirn organotypischen Slice-Kulturen angebaut erlaubt. Dieses Protokoll soll Studien zu den Mechanismen der Purkinje-Zellen dendritische Entwicklung zu fördern.

Die Analyse von Purkinje Zelle Dendritische Morphologie in organotypischen Kulturen

Dieses Video zeigt eine Technik zur Gewinnung von zerebellären organotypischen Schnitten aus dem Gehirn eines Mäusewelpen und zur Kultivierung der Schnitte in Medien, die mit Nährstoffen und Wachstumsfaktoren ergänzt sind, um die Kleinhirnentwicklung in vitro  nachzuahmen.Zusätzlich werden bestimmte Kleinhirnschnitte mit einer Testverbindung behandelt und die neuroprotektive Fähigkeit der Verbindung mit einer Immunfluoreszenz-Färbetechnik analysiert.

Analyse des Überlebens von Purkinje-Zellen in organotypischen Kleinhirnschnittkulturen

Dieses Video zeigt die Methode zur Identifizierung von Neuronen aus einer Mischkultur aus Kleinhirn-Körnerneuronen und Gliazellen unter Verwendung der dualen Färbung mit Fluoresceindiacetat (FDA) und Propidiumiodid (PI), wobei lebende Neuronen grün und tote Neuronen rot erscheinen.

Beurteilung der neuronalen Lebensfähigkeit in einer Kleinhirn-Neuronenkultur mittels Doppelfärbung

Die Kleinhirn externen Körnerschicht ist der Ort der größten Transit Verstärkung im sich entwickelnden Gehirn. Hier stellen wir ein Protokoll zur genetischen Veränderung, die diese Schicht an der Spitze der Proliferation unter Verwendung ex vivo Elektroporation und Kultur zerebelläre Scheiben aus embryonalen Tag 14 Hühnerembryonen zu zielen.

Ex-vivo-Kultur von Chick Kleinhirn-Slices und räumlich gezielte Elektroporation von Körnerzellvorstufen

Dieses Protokoll beschreibt die genaue Messung der neuronalen Lebensfähigkeit mit Fluorescein-Diacetat (FDA) und Propidium-Iodid (PI) Doppelfärbung in kultivierten Zerebellar-Granulat-Neuronen, einer primären neuronalen Kultur, die als in vitro- Modell in der Neurowissenschaften und der Neuropharmakologieforschung verwendet wird.

Beurteilung der neuronalen Lebensfähigkeit unter Verwendung von Fluorescein-Diacetat-Propidium-Iodid-Doppelfärbung in Cerebellar-Granulat-Neuron-Kultur

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Isolierung und Kultivierung primäre Maustaste zerebralen Granulat Neuronen (CGNs) von 6-7 Tage alten Welpen, effizienten Transduktion von CGNs für Verlust und Gewinn von Funktionsstudien, und Modellierung NMDA-induzierten neuronalen Excitotoxizität, niedrig-Kalium-induzierte Zelltod, DNA-Schäden und oxidativen Stress mit der gleichen Kultur-Modell.

Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen

Hier präsentieren wir eine Methode um organotypischen Slice Kulturen aus Maus Kleinhirn und Myelinscheide Färbung von Immunohistochemistry geeignet für die Untersuchung von Mechanismen der Myelinisierung und Remyelinisierung in das zentrale Nervensystem vorzubereiten.

Vorbereitung und Immunostaining Myelinating organotypischen zerebelläre Slice Kulturen

Die Durchführung von In-vitro-Experimenten, um in vivo-Bedingungen so angemessen wie möglich zu reflektieren, ist keine leichte Aufgabe. Die Verwendung von primären Zellkulturen ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis der Zellbiologie in einem ganzen Organismus. Das bereitgestellte Protokoll beschreibt, wie man erfolgreich wachsen und Kultur embryonale Maus Kleinhirn Neuronen.

Primäre Kultur der Neuronen isoliert von Embryonal Mouse Cerebellum

Organotypische Scheibenkulturen sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um neuroentwicklungsfördernde oder degenerative/regenerative Prozesse zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das den neuroentwicklungsbedingten Tod von Purkinje-Zellen in Maus-Kleinhirn-Scheibenkulturen modelliert. Diese Methode kann die Forschung in neuroprotektive Arzneimittel Entdeckung profitieren.

Purkinje Zell Überleben in organotypischen Zerebellar Slice Kulturen

Kleinhirn-Purkinje-Zellen (PCs) reagieren besonders empfindlich auf Defizite in der DNA-Schadensreaktion. Es wird ein Protokoll zur visuellen Bewertung der Dynamik der PC-Reaktion auf DNA-Schäden vorgestellt, das die Färbung proteingebundener Poly(ADP-Ribose)-Ketten in zerebellären organotypischen Kulturen beinhaltet.

Visualisierung der DNA-Schadensantwort in Purkinje-Zellen mit Hilfe von zerebellären organotypischen Kulturen

Erfahren Sie, wie man organotypische Kleinhirnkulturen aus Wildtyp- und Knockout-Mäusen erstellt und apoptotische Reize mit Fast Ligand untersucht. Diese Methode ermöglicht detaillierte Analysen zerebellärer Zellpopulationen mittels Immunfluoreszenzfärbung.

Organotypische Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

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