Name: Geändert Annexin V / Propidiumiodid Apoptose Assay für eine genaue Beurteilung des Zelltods (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Lernen Sie ein optimiertes Annexin V/PI-Protokoll zur präzisen Zelltodanalyse durch Fixierung und RNA-Abbau. Diese Methode reduziert falsch-positive Ergebnisse erheblich und verbessert die Zuverlässigkeit in der Zellbiologie-Forschung.

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Diese Studie wurde von einem Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC) Forschungsstipendium und Alberta Agriculture Funding Consortium gewähren DRB unterstützt. AMR ist durch ein NSERC Vanier kanadischen Graduate Scholarship, der University of Alberta Lehre Assistenzzeit und Queen Elizabeth II Graduiertenstipendium unterstützt.

Dieser Vorgang kann in 500 ul silikonisierten Röhrchen oder 6 ml Polystyrol Rundboden-FACS-Röhrchen durchgeführt werden. Letzteres ist normalerweise verwendet, wenn die Durchführung Lebensfähigkeit Analyse in Verbindung mit anderen Verfahren. Alle Bände beziehen sich auf 6 ml Polystyrol Rundboden-FACS-Röhrchen. Für 500 ul silikonisierten Röhrchen, reduzieren alle Bände von 1 / 5. Die optimale Konzentration für die Durchflusszytometrie-Analyse beträgt 2-4 x 10 6 Zellen pro 200 ul Volumen. Zellverlust kann durch dieses Verfahren entstehen und somit empfehlen wir, dass jede Probe von 4 x 10 6 Zellen bestehen zu Beginn des Verfahrens. 1. Cell Preparation <ol><li> Ernten Sie die Zellen - beziehen sich auf spezifische Verfahren für die entsprechenden Zelllinien oder primären Zellen Isolierungen. </li><li> Centrifuge Proben bei 335 x g für 10 Minuten und Dekantieren des Überstandes. </li><li> Die Zellen in 2 mL 1 x Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) - / - (kein Kalzium, kein Magnesium). </li><li> Centrifuge Proben bei 335 x g für 10 Minuten und Dekantieren des Überstandes. </li><li> Die Zellen in 1 ml 1 x Annexin V-Bindungspuffer. </li><li> Centrifuge Proben bei 335 x g für 10 Minuten und Dekantieren des Überstandes. </li><li> Die Zellen in 100 ul 1 x Annexin V-Bindungspuffer. </li></ol> 2. Die Anwendung des Annexin V / PI Stain <ol><li> Add Annexin V nach den Empfehlungen des Herstellers [zB 5 ul Annexin V Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A13201)]. </li><li> Die Röhrchen im Dunkeln für 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Geben Sie 100 ul 1 x Annexin V-Bindungspuffer zu jedem Reaktionsgefäß. Es sollte etwa 200 ul in jedes Röhrchen werden. </li><li> Add 4 ul PI (Sigma, Kat. Nr. P-4864-10ml), dass die verdünnt wurden in 1 x Annexin V-Bindungspuffer (dh 1 ul PI mit 9 ul 1 x Annexin V-Bindungspuffer) 1:10. Man erhält einen endgültigen PI-Konzentration von 2 pg / mL in jeder Probe. </li><li> Die Röhrchen im Dunkeln für 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Add 500 ul 1 x Annexin V-Bindungspuffer, um die Zellen zu waschen. </li><li> Centrifuge Proben bei 335 x g für 10 Minuten und Dekantieren des Überstandes. </li><li> Die Zellen in 500 ul 1 x Annexin V-Bindungspuffer und 500 ul 2% Formaldehyd zu einer 1% Formaldehyd (Fixativ)-Lösung zu schaffen. Mix Rohre durch vorsichtiges Schnippen. </li><li> Fix Proben auf Eis für 10 Minuten. Alternativ können die Proben über Nacht bei 4 ° C gelagert werden in der Dunkelheit. Wenn die letztere Methode gewählt wird, stellen Sie sicher zu sein über alle Rohre mit Annexin V / PI (einschließlich des Ersatzes Kontrollen) bezeichnet konsistent. </li><li> 1 ml 1 x PBS - / - zu jeder Probe und mischen Sie vorsichtig durch flicking. </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 425 x g für 8 Minuten und Dekantieren des Überstandes. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,10 und 2,11. </li><li> Pellet Dazu den Schlauch. </li><li> Add 16 ul von 1:100 verdünnt RNase A (Sigma, R4642) zu einer Endkonzentration von 50 ug / mL zu geben. Inkubieren für 15 min bei 37 ° C. </li><li> 1 ml 1 x PBS - / - und vorsichtig mischen durch flicking. </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 425 x g für 8 Minuten. </li><li> Die Proben werden nun analysiert werden. Alternativ können die Proben für die anschließende Färbung Schritte verwendet werden, wenn Annexin / PI-Färbung ist in parallel mit anderen Verfahren durchgeführt werden. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: Beispiele von Zelltypen und Zelllinien, die in unterschiedlichem Maße von falsch-positiven PI-Färbung haben, sind in Abbildung 1 dargestellt. Um der falsch-positiven Ereignisse wurden die Zellen fixiert und anschließend mit RNase A behandelt Daraus ergibt sich eine signifikante Abnahme in der Zahl der falsch-positiven Ereignisse im Vergleich zu Zellen, die nicht unterzogen wurden RNase-Behandlung (Abbildung 2B). Abbildung 2C zeigt repräsentative Bilder von Zellen, die RNase-Behandlung unterzogen, im Vergleich zu Zellen, die keine RNase-Behandlung hatte. Abbildung 3 zeigt, wie die modifizierte Annexin V / PI-Protokoll, mit Fixierung und RNase Behandlungsschritte, auf herkömmliche Protokolle verbessert, indem die Anzahl der falsch-positiven Färbung Veranstaltungen. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Konventionelle Propidiumiodidfärbung Protokolle eine signifikante Anzahl von falsch positiven Ereignissen führen. Wir haben früher Ausmaß der falsch-positiven Färbung in primären Zellen in einem breiten Spektrum von Tiermodellen sowie in einer Vielzahl von Zell-Linien 10 ausgewertet. Repräsentative Bilder zeigen Ausmaß der falsch-positiven Färbung in drei einzigartigen Zellpopulationen (eine häufig verwendete Zelllinie - RAW Makrophagen und zwei primäre Zellen - Knochenmark der Maus Makrophagen (BMM) und Goldfische primären Nieren-Makrophagen (PKM)). Wahre positive Ereignisse die erwarteten Co-Lokalisation zwischen PI und DRAQ5 innerhalb der nuklearen Fach (gelbe Flächen zeigen Kolokalisation zwischen PI und DRAQ5). DRAQ5 ist sehr membrane durchlässiger Farbstoff, der genau Flecken nuklearen Fach sowohl in lebenden und toten Zellen 10,11,12. Zur leichteren visuellen Bestimmung der Kolokalisation DRAQ5 Fleck war eine grüne pseudocolour gegeben. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Verbesserung der Genauigkeit der PI Kernfärbung. (A) Wir untersuchten die Genauigkeit der PI Kernfärbung auf Grad der Ähnlichkeit einer Reihe von gut charakterisierten Kernfärbemittel (BrdU, 7-AAD und DAPI) zu DRAQ5 basiert. BrdU ist ein synthetisches Nukleosid, die in die DNA proliferierender Zellen eingebaut wird, und als solche wird nur innerhalb der nuklearen Fach Fleck. 7-AAD hat eine hohe Affinität für DNA und, ähnlich wie bei PI, sie können nicht über eine intakte Plasmamembran. DAPI hat auch eine starke Affinität zu DNA und ist die am häufigsten verwendeten nuklearen in Fluoreszenzmikroskopie Fleck. Der Grad der Ähnlichkeit war&gt; 99% zwischen BrdU, 7-AAD, DAPI und DRAQ5, Hervorhebung ihrer Fähigkeit, genau zu färben den Zellkern in RAW 264.7 Makrophagen. Im Gegensatz dazu führt zytoplasmatische PI-Färbung auf herkömmlichen Protokollen zu einer deutlichen Abnahme in Prozent Ähnlichkeit der Färbung gegenüber DRAQ5. Knochenmark der Maus Makrophagen (BMM) und Goldfische primären Nieren-Makrophagen (PKM): (B) Ähnliche Ergebnisse werden in zwei primäre Zellen getestet beobachtet. Der Einbau von 50 ug / mL RNase A bei bestimmten Stufe innerhalb der Färbung entfernt nicht-nuklearen PI-Färbung und erhöht Grad der Ähnlichkeit in Bezug auf DRAQ5 Färbung. (C) Repräsentative Bilder von primären Nieren-Makrophagen zeigen den Grad der Ähnlichkeit für Zellen mit und ohne RNase-Behandlung. Zur leichteren visuellen Bestimmung der Unterschiede zwischen den Behandlungen war DRAQ5 einen grünen gegeben. Yellow Bereichen zeigen Kolokalisation zwischen BrdU und DRAQ5 und PI und DRAQ5. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Geändert Annexin V / PI reduziert falsche Apoptose / Nekrose Veranstaltungen. Primäre Goldfisch Nieren Makrophagen (PKM) wurden mit herkömmlichen und modifizierten Annexin V / PI-Protokolle gefärbt. Streudiagramme zeigen die Annexin V / PI in Goldfische PKM Fleck. Das Streudiagramm auf der linken Seite zeigt konventionellen Annexin V / PI-Färbung (keine RNase) von PKM-Zellen. Das Streudiagramm auf der rechten Seite zeigt PKM-Zellen mit dem modifizierten Annexin V / PI-Protokoll (mit RNase) gefärbt. Die Zugabe von RNase führt zu einer deutlichen Reduzierung der PI-Färbung durch das Entfernen von falsch-positiven Flecken. PKM Zellen wurden dann auf unterschiedliche Populationen innerhalb der Kulturen und frühen Vorläuferzellen (EP), Monozyten (Mono) und reifen Makrophagen (Mat mac) analysiert wurden. Der Rückgang in der Anzahl der positiven PI Ereignisse, aufgrund der Entfernung von falsch-positiven Ereignisse ist ausgeprägter in großen reifen Makrophagen als in kleineren frühen Vorläuferzellen. Schlussfolgerungen zu herkömmlichen Protokollen basieren würden fälschlicherweise vorgeschlagen haben eine positive Korrelation in zellulären Tod für die reifere Makrophagen Teilmengen.

<ol><li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J Immunol Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
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<li>Fried, J., Perez, A. G., Clarkson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytofluorometric+analysis+of+cell+cycle+distributions+using+propidium+iodide.+Properties+of+the+method+and+mathematical+analysis+of+the+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytofluorometric analysis of cell cycle distributions using propidium iodide. Properties of the method and mathematical analysis of the data.</a> J Cell Biol. 71, 172-181 (1976).</li>
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<li>Kroemer, G., Dallaporta, B., Resche-Rigon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+death%2Flife+regulator+in+apoptosis+and+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis.</a> Annu. Rev. Physiol. 60, 619-642 (1998).</li>
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<li>Njoh, K. L., Patterson, L. H., Zloh, M., Wiltshire, M., Fisher, J., Chappell, S., Ameer-Beg, S., Bai, Y., Matthews, D., Errington, R. J., Smith, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+analysis+of+the+DNA+targeting+bisalkylaminoanthraquinone+DRAQ5+in+intact+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Spectral analysis of the DNA targeting bisalkylaminoanthraquinone DRAQ5 in intact living cells.</a> Cytometry Part A. 69, 805-814 (2006).</li>
</ol>

Die Annexin V / PI-Protokoll hier vorgestellte ist eine modifizierte Version der herkömmlichen Protokollen und berücksichtigt das Vorhandensein von RNA in das Zytoplasma, die auch eine hohe Affinität für PI. Einführung von RNase A (50 pg / mL) bei einer 1% Formaldehyd Fixierung Schritt spät in der Färbung deutlich verbessert die Genauigkeit der nuklearen PI-Färbung. Keine negativen Auswirkungen sind in der nuklearen PI-Färbung oder Plasmamembran Annexin V-Färbung beobachtet. Ohne RNase A-Behandlung können bis zu 40% der PI-Färbung Ergebnisse zu falsch positiven Ereignisse, die zu einer potenziell signifikante und negative Auswirkungen auf die nachgelagerten Schlussfolgerungen 10 führt zu führen. Unsere modifizierte Annexin V / PI-Färbung Protokoll ist einfach und wurde effektiv in einem breiten Spektrum von Zelltypen (primäre Zellen verwendet: Knochenmark der Maus Makrophagen und Splenozyten; Schweinegrippe Lunge residenten Zellen, Lunge Alveolarmakrophagen, Mesenteriallymphknoten Isolate, Leukozyten des peripheren Blutes , Splenozyten; Huhn Blastoderm Zellen; Goldfische primären Nieren-Makrophagen; Karpfen Leukozyten des peripheren Blutes; Zelllinien: RAW 264.7 Makrophagen, Jurkat T-Zellen, Schweine 3D4/31 Makrophagen, CCL-71 Goldfischen fin Fibroblasten, 3B11 Wels B-Zellen 10). Es ist wichtig zu beachten, dass die Zellen differentiell durch falsche positive PI-Färbung, mit primären Zellen in der Regel mit einer größeren Anzahl von falsch positiven Ereignissen 10 betroffen. Die Unterschiede falsch positiven PI-Färbung bei diesen Zellpopulationen können teilweise auf Unterschiede in der Zellgröße zugeschrieben werden, kann aber auch aus Unterschieden in RNA-Gehalt führen. Als solche Einbindung dieses Verfahrens ist besonders relevant für die experimentelle Systeme, die zu nutzen, unter anderem, Zellen, die eine genotoxischen Stress, Zellen mit Zellzyklusarrest Drogen wie Thymidin oder Hydroxyurea, viral infizierte Zellen, und Studien an embryonalen Zellen, in denen Entwicklungsfortschritt behandelt wird durch diskrete Veränderungen in der zellulären RNA-Synthese aus.

<table><tbody><tr><td>1 x PBS-/-</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 x Annexin V-Bindungspuffer</td><td>BD Biosciences</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>A13201</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td>1 mg/mL in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>2% Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1268</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A aus Rinderpankreas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus</td><td>DR50050</td><td>Mit 1 x PBS-/- 1:60 verdünnen</td></tr></tbody></table>

geändert annexin v / propidiumiodid apoptose assay für eine genaue beurteilung des zelltods

Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death

Studium der Apoptose haben sich seit der Einführung der Durchflusszytometrie-basierte Methoden beeinflusst. Propidiumiodid (PI) ist weit verbreitet in Verbindung mit Annexin V verwendet werden, um festzustellen, ob Zellen lebensfähig, apoptotischen oder nekrotischen werden durch Unterschiede in der Plasmamembran Integrität und Permeabilität 1,2. Die Annexin V / PI-Protokoll ist ein häufig verwendeter Ansatz zur Untersuchung von apoptotischen Zellen 3. PI ist häufiger als andere Kernfärbemittel, weil es wirtschaftlich, stabil und ein guter Indikator für die Lebensfähigkeit der Zellen ist, basierend auf ihrer Fähigkeit, Farbstoff in lebenden Zellen 4,5 ausgeschlossen werden. Die Fähigkeit von PI in eine Zelle ist abhängig von der Durchlässigkeit der Membran; PI keine Flecken zu leben oder frühen apoptotischen Zellen durch das Vorhandensein einer intakten Plasmamembran 1,2,6. In späten apoptotischen und nekrotischen Zellen, verringert sich die Integrität der Plasma-und Kernmembran 7,8, so dass PI durch die Membranen passieren, interkalieren in Nukleinsäuren und zeigen rote Fluoreszenz 1,2,9. Leider finden wir, dass herkömmliche Annexin V / PI-Protokolle führen zu einer erheblichen Zahl von falsch positiven Ereignissen (bis zu 40%), die mit PI-Färbung von RNA im Zytoplasma Fach 10 verbunden sind. Primärzellen und Zelllinien in einer breiten Palette von Tiermodellen betroffen sind, mit großen Zellen (nuclear: zytoplasmatische Verhältnisse &lt;0,5) mit dem höchsten Vorkommen 10. Wir zeigen hier, eine modifizierte Annexin V / PI-Methode, die eine deutliche Verbesserung für die Beurteilung des Zelltods im Vergleich zu herkömmlichen Methoden bietet. Dieses Protokoll nutzt Veränderungen in zellulären Permeabilität während Zellfixierung um das Eindringen von RNase A in Zellen nach Färbung zu fördern. Sowohl das Timing und die Konzentration von RNase A wurden zum Entfernen von cytoplasmatischen RNA optimiert. Das Ergebnis ist eine deutliche Verbesserung gegenüber herkömmlichen Annexin V / PI-Protokolle (&lt;5% events mit zytoplasmatischen PI-Färbung).

Eine genaue Methode für die Beurteilung der Zelltod beschrieben. Das Protokoll verbessert die auf konventionellen Annexin V / Propidiumiodid (PI)-Protokolle, die up-Display zu 40% falsch-positive Ereignisse in Zelllinien und Primärzellen aus einer breiten Palette von Tiermodellen.

Geändert Annexin V / Propidiumiodid Apoptose Assay für eine genaue Beurteilung des Zelltods

Studien zur zellulären Apoptose wurden seit der Einführung von Methoden auf Basis der Durchflusszytometrie maßgeblich beeinflusst. Propidiumiodid (PI) wird weithin ...

Das übergeordnete Ziel des Experiments besteht darin, bestehende Probleme mit herkömmlichen Färbetechniken mit Annexin V und Propidiumiodid zur Beurteilung des Zelltods durch Apoptose und/oder Nekrose zu überwinden. Wir haben festgestellt, dass herkömmliche Färbemethoden bei einer breiten Palette von Zelllinien und primären Zellen bis zu 40 % falsch-positive Ereignisse ergeben. Diese falsch-positiven Ereignisse resultieren aus der Färbung zytoplasmatischer RNA.Umgekehrt reduziert unser Protokoll die Anzahl falsch positiver Ergebnisse drastisch, indem Fixierungs- und RNA-Abbau-Schritte in bestimmten Phasen des Färbeprozesses eingeführt werden. Zunächst werden die Zellen mit X in five und Propidiumjodid gemäß herkömmlicher Verfahren gefärbt, um Zelltod nachzuweisen. Anschließend werden die Zellen mit 1 % Formaldehyd fixiert, wodurch die Permeabilität der Plasmamembran erhöht wird. Schließlich werden die fixierten Zellen mit RNase A behandelt, um zytoplasmatische RNA abzubauen und so Propidiumjodid-Färbungen zu eliminieren, die zu falsch positiven Ergebnissen führen.Wie viele Zellbiologen haben wir herkömmliche Methoden der Nexin-Fünf- und Propidiumiodid-Durchflusszytometrie zur Detektion apoptotischen und nekrotischen Zelltods verwendet. Kürzlich haben wir jedoch festgestellt, dass diese Methode bei einer Reihe von Zelllinien und primären Zellen zu einer erheblichen Anzahl falsch-positiver Ereignisse führt, die bis zu 40 % betragen kann. Diese überarbeitete Methode behebt diese Probleme.Unsere Methode nutzt die Zellfixierung und RNA-Digestion in spezifischen Schritten während des gesamten Verfahrens, um zytoplasmatische RNA geziilt zu entfernen, deren Anfärbung direkt zu diesen falsch-positiven Ereignissen führt. Gewinnen Sie die für das Experiment zu analysierenden Zellen. In diesem Video verwenden wir rohe Makrophagen. Zentrifugieren Sie die Proben beispielsweise 10 Minuten lang bei 335 × g und vier Grad Celsius, dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in zwei Milliliter 1× PBS.Waschen Sie die Zellen anschließend erneut unter denselben Bedingungen. Dieses Mal resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter eines 1× NX und fünf Bindungspuffers. Nach der Zentrifugation der Proben und erneutem Abgießen des Überstandes resuspendieren Sie die Zellen in einem Endvolumen von 100 Mikrolitern des 1× NX Xin fünf Bindungspuffers.Fügen Sie jeder Zellprobe gemäß den Empfehlungen des Herstellers Xin five hinzu. In diesem Video werden beispielsweise 2,5 µL von Xin five zi zu jedem Rundbodentestgefäß aus Polystyrol hinzugefügt. Inkubieren Sie die Gefäße 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.Fügen Sie dann 100 Mikroliter eines 1× NX in fünf Bindungspuffer zu jedem Reaktionsröhrchen hinzu. In jedem Röhrchen sollten sich nun etwa 200 Mikroliter Lösung befinden. Bereiten Sie anschließend eine 1:10-Verdünnung von Propidiumiodid oder PI in 1× NX in fünf Bindungspuffer vor, und geben Sie 4 Mikroliter des verdünnten PI zu jedem Röhrchen hinzu, sodass eine Endkonzentration von 2 Mikrogramm pro Milliliter PI in jeder Probe erreicht wird.Inkubieren Sie die Röhrchen erneut 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Nach dieser Inkubationszeit waschen Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern eines x- und x- und fünfmaligen Bindungspuffers und zentrifugieren die Proben bei 335 ×g 10 Minuten bei vier Grad Celsius; danach entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in weiteren 500 Mikrolitern eines X-NX- und fünfmaligen Bindungspuffers zusammen mit 500 Mikrolitern 2%iger Formaldehydlösung.Um eine 1 %ige Formaldehydlösung herzustellen, mischen Sie die Röhrchen durch vorsichtiges Schwenken. Fixieren Sie die Proben nach der Fixierung zehn Minuten lang auf Eis. Geben Sie je ein Milliliter 1× PBS zu jeder Probe hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Schwenken; zentrifugieren Sie die Zellen dreimal während der Waschung bei 425 × g für acht Minuten bei vier Grad Celsius.Stellen Sie eine Verdünnung von RNA A im Verhältnis 1:100 in 1× PBS her, resuspendieren Sie das Pellet durch vorsichtiges Schwenken der Röhrchen und geben Sie 16 Mikroliter der verdünnten RNA-A-Lösung hinzu, um eine Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen. Inkubieren Sie anschließend die Proben 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie danach die Zellen mit einem Milliliter 1× PBS, mischen Sie vorsichtig durch Schwenken und zentrifugieren Sie die Röhrchen acht Minuten bei 425 × g und vier Grad Celsius.Die Proben sind nun bereit zur Analyse. Alternativ können die Proben für nachfolgende Färbungsschritte verwendet werden, falls die N-X-M-P-I-Färbung parallel zu anderen Verfahren durchgeführt wird. Repräsentative Bilder aus dem Bildstrom-Durchflusszytometer zeigen das Ausmaß der falsch-positiven Färbung in drei unterschiedlichen Zellpopulationen.Eine häufig verwendete Zelllinie umfasst rohe Makrophagen sowie zwei primäre Zelllinien, die Makrophagen aus Knochenmark und primäre Nierenmakrophagen von Goldfischen widerspiegeln. Die Verwendung primärer Makrophagen von Goldfischen unterstreicht die Anwendbarkeit dieser Technik über eine Vielzahl zellulärer Systeme hinweg. Wahre positive Ereignisse zeigen die erwartete Kolokalisation im nukleären Kompartiment zwischen PI und drac.Fünf, ein hochmembranpermeables Farbstoff, der den nukleären Kompartiment lebender und toter Zellen genau anfärbt, wie die gelbe Färbung zeigt. Hier wurde die Genauigkeit der PI-Nukleusfärbung anhand ihres Ähnlichkeitsgrades zu D dr fünf BRDU sieben A.A D DPI bewertet, und DRAC fünf wies eine Ähnlichkeit von mehr als 99 % in ihrer Fähigkeit auf, den Zellkern in der RAW 264.7-Makrophagenzelllinie genau anzufärben. Im Gegensatz dazu führte die zytoplasmatische PI-Färbung, die bei Verwendung herkömmlicher Protokolle auftritt, zu einer deutlichen Abnahme des prozentualen Ähnlichkeitsgrades der Kernfärbung im Vergleich zu d dr fünf.In dieser Abbildung ist zu erkennen, dass die Zugabe von 50 Mikrogramm pro Milliliter RNase A die nicht-nukleäre PI-Färbung entfernt und den Grad der Ähnlichkeit im Vergleich zur d dr fünf-Färbung in murn, Knochenmarkmakrophagen und primären Makrophagen der Goldfischnieren deutlich erhöht. Repräsentative Bilder primärer Nierenmakrophagen in dieser Abbildung zeigen den Verlust der RNA-Färbung im zytoplasmatischen Kompartiment nach Behandlung mit RNase A. Diese Streudiagramme primärer Makrophagen der Goldfischnieren zeigen eine signifikante Verringerung falsch positiver apoptotischer und nekrotischer Ereignisse in Zellen, die mit dem modifizierten Nexin-PI-Protokoll vorbereitet wurden.Das neue Protokoll zeigt, dass 84,9 % der Zellen lebensfähig sind. Die Gates wurden basierend auf parallelen Bildstrom-Proben gezogen, die fluoreszierende und morphologische Merkmale bewerten. In einem Beispiel wurden frühe Vorläufermonocyten und reife Makrophagen entweder mit dem modifizierten NX in fünf PI-Protokoll, das in diesem Video beschrieben wird, oder mit der konventionellen Methode gefärbt. Für diese Abbildung zeigte die mit dem modifizierten Protokoll gefärbte Zelle eine sichtbare Verringerung der Anzahl positiver PI-Ereignisse, bedingt durch die Eliminierung von falsch-positiven Ereignissen durch die RNA-Behandlung.Außerdem war dieser Effekt in großen, ausgereiften Makrophagenzellen stärker ausgeprägt als in kleineren, frühen Vorläuferzellen. Schlussfolgerungen, die auf herkömmlichen Protokollen basieren, hätten irrtümlich eine positive Korrelation beim Zelltod für die reiferen Makrophagensubgruppen nahegelegt. Nach diesem Färbeprotokoll können weitere Schritte wie intrazelluläre oder Oberflächenfärbungen durchgeführt werden, um spezifische Fragen bezüglich der Subpopulationen innerhalb Ihres Zellisolats zu beantworten. Die Relevanz dieser Technik erstreckt sich über immunologische Fragestellungen hinaus; sie ist beispielsweise auch relevant für experimentelle Systeme, die Zellen nutzen, die genotoxischem Stress ausgesetzt sind, Zellen, die mit Zellzyklusarrest behandelt wurden, Wirkstoffe wie Thymidin oder Hydroxyharnstoff, sowie Studien an embryonalen Zellen, bei denen die Entwicklung durch diskrete Veränderungen der zellulären RNA-Synthese gekennzeichnet ist.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Wirkungen der Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) Isozyme auf die mitochondriale Atmung und Funktionen mit oxidativen Phosphorylierung und auf Lebensfähigkeit der Zellen assoziiert werden beschrieben. Der Ansatz paßt adenoviralen Technik, um selektiv überexprimieren PKC-Isozyme in primären Zellkultur und einer Vielzahl von Assays, um mitochondriale Funktionen und Energiezustand der Zelle zu bestimmen.

Beurteilung der mitochondrialen Funktionen und Zellviabilität in Renal Überexpression Protein Kinase C-Isoenzyme

In diesem Video demonstrieren wir den Annexin V Bindungsassay zur Messung des Grades der Eryptosis, des Erythrozyten-programmierten Zelltods, mittels fluoreszierender Annexin V Färbung. Apoptotische Erythrozyten zeigen eine Phosphatidylserin-Translokation vom inneren zum äußeren Segel der Zellmembran, wodurch das Fluorophor-markierte Annexin V an das translozierte Phosphatidylserin bindet und dadurch ein Fluoreszenzsignal aussendet.

Annexin-V-Bindungsassay: Eine fluoreszenzbasierte Technik zur Identifizierung apoptotischer Erythrozyten durch Phosphatidylserin-Markierung

Therapeutische Verbindungen werden oft zunächst in vitro-Lebensfähigkeitstests untersucht. Blindzellzählungen durch einen menschlichen Betrachter sehr empfindlich auf kleine Änderungen in der Zellzahl, aber nicht beurteilen Funktion. Computergestützte Lebensfähigkeitstests, wie hier beschrieben, kann sowohl die Struktur und Funktion in einer objektiven Weise zu beurteilen.

Die Lebensfähigkeit Assays für Zellen in Kultur

Multiplex-Assays können nützliche Informationen für grundlegende zelluläre Mechanismen und beseitigen Abfälle von Reagenzien und unnötig wiederholende Experimenten. Wir beschreiben hier ein Multiplex-Caspase-3/7 Aktivitätstest unter Verwendung von fluoreszierenden und lumineszier-basierte Verfahren, um die Lebensfähigkeit der Zellen in einem in vitro Modell Hypothalamus folgenden oxidativen Herausforderung mit Palmitinsäure bestimmen.

Verwendung eines Caspase Multiplexing-Test zur Apoptose in einer Zelle Hypothalamus Modell ermitteln

Der Begriff Anastase bezieht sich auf das Phänomen, bei dem sterbende Zellen einen Zellselbstmordprozess in einem späten Stadium rückgängig machen, sich selbst reparieren und schließlich überleben. Hier demonstrieren wir Protokolle zum Nachweis und zur Verfolgung von Zellen, die einer Anastasierung unterzogen werden.

Strategien für die Spurhaltung Anastasis, einer Zelle Überleben Phänomen, das Apoptose Kehrt

Ein Workflow mit Flow Cytometry oder Differential Zentrifugation wurde entwickelt, um erkennen, zu quantifizieren und isolieren Apoptotic Körper aus einem Apoptotic Probe zu hoher Reinheit.

Nachweis und Isolierung von apoptotischen stellen hohe Reinheit

Das Protokoll beschreibt einen schnellen, hohen Durchsatz, zuverlässigen, kostengünstigen und unvoreingenommenen Test zur effizienten Bestimmung der Zelllebensfähigkeit. Dieser Test ist besonders nützlich, wenn die Mitochondrien der Zellen geschädigt wurden, was andere Assays stört. Der Test verwendet die automatisierte Zählung von Zellen, die mit zwei Kernfarbstoffen – Hoechst 33342 und Propidiumiodid – befleckt sind.

Ein automatisierter Differential-Nuklearfärbungstest zur genauen Bestimmung der Mitocan-Zytotoxizität

Die Apoptose kann durch die durchflusszytometrische Analyse früher und später apoptotischer Biomarker charakterisiert werden. Die Zelllinie des Gebärmutterhalskrebses, SiHa, wurde nach Behandlung mit Actinomycin D mit einem Benchtop-Durchflusszytometer auf Apoptose-Biomarker untersucht.

Durchflusszytometrische Analyse von apoptotischen Biomarkern in Actinomycin-D-behandelten SiHa-Gebärmutterhalskrebszellen

Dieses Protokoll basiert auf LPS und ATP-induziertem Tod von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen. Wir verwenden die Durchflusszytometrie zur Analyse von Annexin V und 7-AAD-Doppelfärbung, um den Zelltod zu erkennen, wobei wir die gesamte Zelle verwenden und Rasterelektronenmikroskopie einsetzen, um die Zellmembranmorphologie zu beobachten.

LPS und ATP-induzierter Tod von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen und deren Validierung

Pyrosequencing (R) ist eine der am gründlichsten dennoch einfache Methoden, um Datum verwendet werden, um Polymorphismen zu analysieren. Diese Methode hat eine schnelle und effiziente Single-Nukleotid-Polymorphismus Auswertung darunter viele klinisch relevante Polymorphismen geführt. Die Technik und Methodik der Pyrosequencing erklärt.

Pyrosequencing: Eine einfache Methode für genaue Genotypisierung

Lernen Sie ein optimiertes Annexin V/PI-Protokoll zur präzisen Zelltodanalyse durch Fixierung und RNA-Abbau. Diese Methode reduziert falsch-positive Ergebnisse erheblich und verbessert die Zuverlässigkeit in der Zellbiologie-Forschung.

Geändert Annexin V / Propidiumiodid Apoptose Assay für eine genaue Beurteilung des Zelltods

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