Geändert Annexin V / Propidiumiodid Apoptose Assay für eine genaue Beurteilung des Zelltods

Das übergeordnete Ziel des Experiments ist es, aktuelle Probleme mit herkömmlichen Annexin-Fünf- und Propidiumiodid-Färbetechniken zur Beurteilung des Zelltods durch Apoptose und/oder Nekrose zu überwinden. Wir haben festgestellt, dass konventionelle Färbeansätze für ein breites Spektrum von Zelllinien und Primärzellen zu bis zu 40% falsch positiven Ereignissen führen. Diese falsch positiven Ereignisse sind auf die Färbung der zytoplasmatischen RNA zurückzuführen.

Umgekehrt reduziert unser Protokoll die Anzahl falsch positiver Inzidenzen drastisch, indem es Fixierungs- und RNA-Abbauschritte in bestimmten Stadien einführt. Beim Färbeverfahren werden die ersten Zellen mit einem X in fünf und Peridiumiodid gefärbt, um den Zelltod wie bei herkömmlichen Verfahren zu erkennen. Als nächstes werden die Zellen mit 1% Formaldehyd fixiert, was die Durchlässigkeit der Plasmamembran erhöht. Schließlich werden die fixierten Zellen mit RNAs A behandelt, um zytoplasmatische RNA abzubauen, wodurch falsch positive Propidiumiodid-Färbungen eliminiert werden.

Wie viele Zellbiologen haben wir konventionelle Methoden der Nexin-Fünf- und Propidiumiodid-Durchflusszytometrie zum Nachweis des apoptotischen und nekrotischen Zelltods verwendet. Leider haben wir kürzlich festgestellt, dass diese Methode in einer Reihe von Zelllinien und Primärzellen zu einer signifikanten Anzahl von falsch positiven Ereignissen von bis zu 40 % führt. Diese aktualisierte Methode überwindet diese Vorbehalte.

Unser Ansatz nutzt die Zellfixierung und den RNA-Verdau in bestimmten Schritten während des gesamten Verfahrens, um Cyop-Plasma-RNA selektiv zu entfernen, eine Färbung, die direkt zu diesen falsch positiven Ereignissen führt, und die Zellen zu ernten, die für das Experiment analysiert werden sollen. In diesem Video verwenden wir rohe Makrophagen. Zentrifugieren Sie beispielsweise die Proben bei 335 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, dekantieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in zwei Millilitern eines XPBS.

Waschen Sie die Zellen dann erneut unter den gleichen Bedingungen. Diesmal wird die Suspension der Zellen in einem Milliliter eines X NX und fünf Bindungspuffern durchgeführt. Nach dem Zentrifugieren der Proben und dem erneuten Dekantieren des Überstands werden die Zellen in einem Endvolumen von 100 Mikrolitern des einen X NX Xin fünf Bindungspuffers resuspendiert.

Fügen Sie jeder Zellprobe gemäß den Empfehlungen des Herstellers eine Xin fünf hinzu. In diesem Video werden beispielsweise 2,5 Mikroliter eines Xin fünf zi zu jedem Polystyrol-Rundbodenrohr hinzugefügt. Inkubieren Sie die Röhrchen 15 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur.

Geben Sie dann 100 Mikroliter eines X NX in fünf Bindungspuffern in jedes Reaktionsröhrchen. In jedem Röhrchen sollten sich nun etwa 200 Mikroliter Lösung befinden. Als nächstes bereiten Sie eine Verdünnung von Propidium, Jodid oder PI von eins bis 10 in einem X- NX.In Fünf-Bindungspuffer vor, fügen Sie vier Mikroliter des verdünnten PI zu jedem Röhrchen hinzu, was eine Endkonzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter Pi in jeder Probe ergibt.

Inkubieren Sie die Röhrchen erneut im Dunkeln für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dieser Inkubationszeit waschen Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern eines x und x und fünf Bindungspuffers und zentrifugieren Sie die Proben bei 335 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und dekantieren Sie den Snat. Die Zellen werden in weiteren 500 Mikrolitern eines X NX und fünf Bindungspuffern mit 500 Mikrolitern 2%igem Formaldehyd resuspendiert.

Um eine 1%ige Formaldehydlösung herzustellen, mischen Sie die Röhrchen durch leichtes Schnippen. Fixieren Sie die Proben nach dem Fixieren 10 Minuten lang auf Eis. Geben Sie einen Milliliter eines XPBS zu jeder Probe und mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Zellen während des Waschvorgangs acht Minuten lang bei 425 g bei vier Grad Celsius zentrifugieren.

Bereiten Sie eine Verdünnung von RNA A A in einem XPBS von eins bis 100 vor, resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie die Röhrchen schnippen, und fügen Sie 16 Mikroliter der verdünnten RNAs, A-Lösung, hinzu, um eine Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten. Anschließend werden die Proben 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Waschen Sie dann die Zellen in einem Milliliter eines XPBS und mischen Sie vorsichtig durch Schnippen, dann zentrifugieren Sie die Röhrchen acht Minuten lang bei 425 GS bei vier Grad Celsius.

Die Proben sind nun bereit für die Analyse. Alternativ können die Proben für nachfolgende Färbeschritte verwendet werden, wenn die N-X-M-P-I-Färbung parallel zu anderen Verfahren durchgeführt wird. Repräsentative Bilder des Durchflusszytometers zeigen das Ausmaß falsch positiver Färbungen in drei einzigartigen Zellpopulationen.

Eine häufig verwendete Zelllinie besteht aus rohen Makrophagen und zwei primären Zelllinien, die Knochenmarkmakrophagen und Goldfische widerspiegeln, primäre Nierenmakrophagen. Die Verwendung von primären Goldfisch-Makrophagen unterstreicht die Anwendbarkeit dieser Technik auf einer Vielzahl von zellulären Plattformen. Richtig positive Ereignisse zeigen die erwartete Kolokalisation innerhalb des nuklearen Kompartiments zwischen PI und drac.

Fünf, ein hochgradig membrandurchlässiger Farbstoff, der das Kernkompartiment lebender und toter Zellen genau färbt, wie die gelbe Färbung beweist. Hier wurde die Genauigkeit der PI-Kernfärbung auf der Grundlage ihres Ähnlichkeitsgrades mit D dr five BRDU seven A.A D DPI bewertet, und DRAC fünf zeigte eine Ähnlichkeit von mehr als 99 % in ihrer Fähigkeit, den Zellkern in der rohen 2 64 0,7 Makrophagen-Zelllinie genau zu färben. Im Gegensatz dazu führte die zytoplasmatische PI-Färbung, die bei der Verwendung konventioneller Protokolle auftritt, zu einer deutlichen Abnahme der prozentualen Ähnlichkeit der Kernfärbung im Vergleich zu d dr fünf.

In dieser Abbildung ist zu sehen, dass der Einbau von 50 Mikrogramm pro Milliliter RNA A die nicht-nukleäre PI-Färbung entfernt und den Grad der Ähnlichkeit im Vergleich zur d dr fünf-Färbung in murn-, Knochenmarkmakrophagen- und Goldfisch-primären Nierenmakrophagenzellen signifikant erhöht. Repräsentative Bilder von primären Nierenmakrophagen in dieser Abbildung zeigen den Verlust der RNA-Färbung im zytoplasmatischen Kompartiment durch die Behandlung mit RN a. Diese Streudiagramme von primären Goldfisch-Nierenmakrophagen zeigen eine signifikante Reduktion falscher apoptotischer nekrotischer Ereignisse in Zellen, die mit dem modifizierten Nexin-PI-Protokoll präpariert wurden.

Das neue Protokoll zeigt, dass 84,9 % der Zellen lebensfähig sind. Die Gates wurden auf der Grundlage von parallelen Bildstromproben gezeichnet, die fluoreszierende und morphologische Merkmale bewerten. In einem Beispiel wurden frühe Vorläuferzellen-Monozyten und reife Makrophagen mit dem modifizierten NX in fünf PI-Protokollen gefärbt, das in diesem Video beschrieben wird, oder mit der konventionellen Methode für diese Figur, die durch das modifizierte Protokoll gefärbt wurden, zeigten eine visuelle Verringerung der Anzahl positiver PI-Ereignisse aufgrund der Entfernung falsch positiver Ereignisse durch die RNA-Behandlung.

Darüber hinaus war dieser Effekt in großen reifen Makrophagenzellen ausgeprägter als in kleineren, frühen Vorläuferzellen. Schlussfolgerungen, die auf herkömmlichen Protokollen basieren, hätten fälschlicherweise eine positive Korrelation beim Zelltod für die reiferen Makrophagen-Untergruppen nahegelegt. Nach diesem Färbeverfahren können weitere Schritte wie intrazelluläre oder Oberflächenfärbung durchgeführt werden, um spezifische Fragen zu den Subpopulationen innerhalb Ihres Zellisolats zu beantworten. Die Relevanz dieser Technik geht über immunitätsbasierte Fragen hinaus, z. B. ist sie auch relevant für experimentelle Systeme, die Zellen verwenden, die genotoxischen Stresszellen ausgesetzt sind, die mit Zellzyklusarrest behandelt wurden, Medikamente wie Thymidin oder Hydroxyharnstoff und Studien an embryonalen Zellen, bei denen der Entwicklungsfortschritt durch diskrete Veränderungen in der zellulären RNA-Synthese gekennzeichnet ist.