Dissection und 2-Photonen-Imaging der peripheren Lymphknoten in Mäusen

Hallo, mein Name ist Melanie Matthew. Ich komme aus dem Labor von Micah Helen an der University of California Irvine. Und heute werden wir Lymphknoten aus einer Maus entnehmen, um sie von Insitu zu Photonen abzubilden.

Dabei werden die Leistenlymphknoten, die axillären Lymphknoten und die zervikalen Lymphknoten entfernt. Die sechs peripheren Lymphknoten, die bei einer Maus leicht zugänglich sind, um fluoreszierende Zellen in unsere Mauslymphknoten zu bekommen. Um mit Hilfe der Zwei-Botton-Bildgebung abzubilden, müssen wir zunächst einen adoptiven Transfer von fluoreszenzmarkierten Zellen durchführen.

Für dieses Experiment zeige ich Ihnen also zuerst den adoptiven Transfer. Hier ist also unsere 28-Gauge-Insulinspritze. Ich werde es mit einigen Zellen oder Zellen laden.

Zuerst möchte ich die Spritze lösen, damit sie leicht fliegt. Und ich werde die Zellen sorgfältig laden. Ich werde mein Bestes tun, um die Seiten des Schlauchs nicht mit der Insulinspritze zu berühren, da dies die Spritze abstumpft und die Injektion in die Mausschwanzvene erschwert

Wenn es Luftblasen gibt, musst du sie herausschnippen, sie irgendwie aus dem Weg räumen. Tippen Sie sie hier aus dem Weg. Da sind wir also.

Jetzt sind wir bereit, diese Zellen in die Schwanzvene zu injizieren. Okay, hier ist unsere C 57 black six Maus. Wir werden sie langsam und sanft in den Schwanzveneninjektor zurückführen.

Viele der Mäuse mögen das nicht, aber es hält sie davon ab, zu springen, wenn man die eigentliche Injektion durchführt und sich selbst mehr verletzt oder möglicherweise einen Nadelstich bekommt. Man sichert die Maus also ganz langsam im Inneren. Und jetzt sucht man nach der Schwanzader an den Seiten der Maus, dem Schwanz der Maus.

So verläuft eine große Arterie an der Spitze entlang. Und dann gibt es auf beiden Seiten des Schwanzes der Maus zwei schöne lange Adern. Gehen Sie ganz nach unten bis zur Spitze.

Du nimmst also deine Nadel und fängst tief am Schwanz an und suchst nach einer Vene. Ich kann also genau dort sehen, da ist eine Ader. Ich werde es nur ein wenig mit Ethanol befeuchten, dann kann es ein wenig klarer zu sehen sein.

Okay, jetzt werden wir die Schwanzvene injizieren und es ist wichtig, die abgeschrägte Seite der Nadel nach oben zu halten. Das ist das geöffnete Ende der Nadel nach oben. Und sich fast parallel zum Schwanz zu bewegen.

Sie möchten nicht in einen Winkel gehen, weil die Venen ganz oben liegen. Du willst die Nadel nur ganz langsam in die Schwanzvene gleiten lassen. Und wenn Sie das tun, sollten Sie in der Lage sein, es mit ein wenig mehr Erfahrung zu spüren.

Aber die ersten paar Male willst du die Flüssigkeit drücken und sehen, ob es einen Widerstand gibt. Wenn es keinen Widerstand gibt, befinden Sie sich in der Schwanzvene und können eine schnelle, einfache Injektion durchführen, wie ich es gerade getan habe. Dann kannst du die Nadel langsam herausziehen.

Eine weitere Bestätigung dafür, dass Sie sich in der Vene befinden, ist, dass Sie einen kleinen Blutfleck aus dem Rückfluss haben werden. Wenn also ein schöner Rückfluss von Blut aus Ihrer Injektionsstelle austritt, wird dies bestätigen, dass Sie definitiv in der Schwanzvene waren. Und die Maus sollte bald nach der Injektion aufhören zu bluten.

Okay, hier ist also unsere schwarze Sechsermaus Und wir werden der Maus Lymphknoten von den Leistenflanken entfernen, die hier sind, hier unter der Achselhöhle, wo Sie hier Ihre Achselknoten finden. Und auf der anderen Seite hier. Und dann die oberflächlichen Gebärmutterhalsknoten, die hier oben im Hals sind, dort und dort, einer auf jeder Seite.

Hi.So jetzt sind wir bereit, unsere Maus zu sezieren. Und ich beginne damit, die Maus an das Board hier an das Sezierbrett zu heften. Und machen Sie einfach weiter und heften Sie die Pause an. Ja.

Sie möchten sicherstellen, dass es sich um einen sicheren Anheftauftrag handelt. Dadurch können wir die peripheren Lymphknoten besser freilegen. Also stecke ich normalerweise einfach alle vier Pfoten fest.

Ich mache mir keine Sorgen um den Schwanz. Manche Leute stecken den Schwanz auch gerne fest. Und um zu verhindern, dass Fell in die Region gelangt, in der wir sezieren und unsere Lymphknoten und unsere Instrumente überziehen, besprühen wir die Maus mit 70 % Ethanol.

Und jetzt, da die Maus mit Ethanol bestäubt wird, werde ich einen Schnitt in der Mittellinie machen. Und das tue ich, indem ich das Fell vom Körper wegziehe. Die Haut, die ihr sehen könnt, kann ich hochziehen und ein kleines Zelt bauen.

Und das wird Sie davon abhalten, das Bauchfell zu durchtrennen, was Sie in diesem Fall nicht tun möchten. Okay, ich beginne hier oben mit meinem Schnitt in der Mittellinie. Ich mache einen kleinen Schnitt und achte darauf, dass ich nicht in das Bauchfell gerate.

Sie können sehen, dass sich darunter das Bauchfell befindet. Ich schiebe meine Schere unter den Schnitt und arbeite mich langsam vor, indem ich die Haut vom Bauchfell trenne, wobei ich kleine Schnitte mache, weil wir die zervikalen Lymphknoten nehmen werden. Ich werde sehr vorsichtig und langsam bis zur Kieferpartie der Maus schneiden, um sicherzustellen, dass ich keine großen Blutgefäße treffe.

Und dann, weil wir die Leistenlymphknoten nehmen, die sich im unteren Teil des Hautlappens befinden, werde ich einen Mittellinienschnitt bis etwa zum Schwanz machen, dort bis zur Basis des Schwanzes. Also los geht's. Es gibt einen Mittellinienschnitt für uns, der funktionieren wird.

Jetzt werde ich die Haut vom Bauchfell trennen. Ich werde dies vorsichtig mit einer Zange tun, die die Haut vom Bauchfell wegzieht, während ich gehe. Und ich lege den ersten Lymphknoten frei, den wir sezieren werden.

Das ist der Leistenlymphknoten hier unten im unteren Hautlappen. Nachdem ich nun einen Hautlappen vom Hauptkörper der Maus entfernt habe, werde ich ihn festnageln, um den Leistenlymphknoten freizulegen. Das ist also eine bessere Freilegung des Leistenlymphknotens, der es uns ermöglicht, ihn sauber zu präparieren.

Hier haben wir also den Leistenlymphknoten, der nach dem Pinning freigelegt wurde. Es ist typischerweise im Hautlappen zu finden, hier direkt über dem Bein. Und Sie können es finden, indem Sie sich die Y-förmige Verbindung der Blutgefäße ansehen, die darüber verlaufen.

Und da ist es. Es ist mit ein wenig Fett bedeckt und die Blutgefäße verlaufen darüber. In Ordnung, jetzt werde ich den Leistenlymphknoten entfernen.

Ich entferne meine Pinzette auf beiden Seiten des Lymphknotens, um ihn vom Fett wegzuziehen. Wir wollen kein Fett. Mit unserer Zwei-Photonen-Bildgebung wird die Laserpenetration des Gewebes verschleiert.

Mal sehen. Es ist wichtig, das gesamte Fett für den Lymphknoten abzuleiten und die Rinde des Lymphknotens intakt zu halten. In Ordnung, los geht's.

Hier ist also unser iena-Lymphknoten. Ich werde es in unseren Medien platzieren und der gute Weg, um festzustellen, ob Sie das ganze Fett losgeworden sind, ist, wenn der Lymphknoten sinkt. Sobald Sie es in das Medium legen, sinkt es direkt auf den Boden.

Wenn Fett vorhanden ist, schwimmt es. In Ordnung, jetzt werde ich den Hilfslymphknoten herausnehmen. Es befindet sich in der Achselhöhle der Maus direkt entlang eines großen Blutgefäßes.

Manchmal kann es also schwierig sein, weil Sie viele Blutungen bekommen, die den Knoten verdecken. Aber ich zeige euch, was ich mache und hoffentlich bekommen wir diesmal keine Blutungen. Also löse ich zuerst den Hautlappen, und ich entferne tatsächlich diesen Unterarm neben dem Knoten, den ich nehmen möchte.

Dies ermöglicht es mir, die Haut mit mehr Geschicklichkeit mit meinen Fingern wegzuziehen, aber diesen Muskel zu halten, der über die Achselhöhle verläuft, und dieser sollte mit etwas sanftem Ziehen herausspringen und den Achselknoten herausspringen. Und ich werde jetzt danach suchen. Und da ist es.

Es befindet sich genau dort in der Achselhöhle entlang eines großen Blutgefäßes. Jetzt werde ich den Achselknoten präparieren und Sie können die Haut wieder feststecken oder Sie können sie mit den Fingern festhalten, was auch immer Sie sich wohler fühlen. Aber ich arbeite gerne vorsichtig damit.

Um diesen Lymphknoten herum befindet sich sehr wenig Fett, was ihn für die Bildgebung gut macht, aber er befindet sich neben einem großen Blutgefäß, so dass man sie manchmal verlieren kann, wenn man nicht aufpasst. Für den Achselknoten greife ich also das Bindegewebe um ihn herum und trenne es langsam von den Blutgefäßen. Und okay, und los geht's.

Da ist unser Achselknoten. Es ist also genau da. Es ist ein schöner langer, flacher Lymphknoten.

Und ich greife ein wenig nach dem Bindegewebe, das an der Seite des Knotens übrig geblieben ist, damit wir den eigentlichen Knoten nicht beschädigen. Wir werden ein Bild machen, um die Lymphknoten mit Feuchtigkeit zu versorgen. Bevor wir unsere Institutsbildgebung durchführen, platzieren wir sie in CO2-unabhängigen Medien in einzelnen Kammern, damit wir den Überblick über die Leisten-, Achsel- und zervikalen Lymphknoten behalten können.

Die Art und Weise, wie Sie feststellen können, ob Sie eine gute Lymphknotenvorbereitung durchgeführt haben, besteht darin, dass sie nach dem Präparieren auf den Boden sinken. Das bedeutet, dass sich sehr wenig Fett im Lymphknoten befindet. Okay, jetzt werde ich den zervikalen Lymphknoten entfernen, den oberflächlichen Gebärmutterhals.

Und ich mache das, ich beginne damit, das Halsgewebe ein wenig besser freizulegen, nachdem ich den Achselknoten herausgenommen habe. Und zervikale Lymphknoten befinden sich in der Nähe der Kiefermuskulatur der Maus. Eigentlich an der Seite.

Es sind die gleichen Lymphknoten, die Sie spüren können, wenn Sie krank werden. Sie sind diejenigen, nach denen Ihr Arzt fühlen wird, wenn Sie eine Erkältung haben. Und um dies zu tun, stecke ich normalerweise meinen Finger unter das Taschentuch, um es nach vorne zu ziehen, während ich meine Pinzette an der Seite entlangstreife.

Ich sollte einen Lymphknoten haben, der herausspringt. Oh, da ist es. Es ist da oben im Gewebe.

Da ist es. Es gibt also oberflächliche zervikale Knoten. Du solltest darauf achten, dass du keine Speicheldrüsen nimmst.

Sie werden keine T-Zellen in Ihren Speicheldrüsen finden. Und diese speziellen Lymphknoten haben Zöliakie, vier positive T-Zellen, die mit CFSC markiert sind. Wir zeigen Ihnen also einige In-situ-Videos von diesen Tzellen, die sich im Gewebe bewegen.

Okay, jetzt klebe ich den Lymphknoten auf einen unzerbrechlichen Kunststoff-Deckschirm, damit wir ihn am Boden unserer Insitu-Bildgebungsstufe befestigen können. Auf diese Weise haben wir keine Bewegung des Gewebes oder eine Gewebedrift, während wir die T-Zellen abbilden. So habe ich hier meine unzerbrechlichen Abdeckeinlagen aus Kunststoff.

Das erste, was ich tun werde, ist, einen von ihnen auf die richtige Größe für unseren Lymphknoten zu schneiden. Also nehme ich einfach meine Schere und schneide hier ein kleines Quadrat aus. Okay, jetzt tupfe ich Kleber drauf.

Es ist ein bisschen Kleber. Verteilen Sie es um das Schieberstück, das wir geschnitten haben. Und dann nehme ich ein Kim-Tuch und sauge etwas von dem Kleber ab.

Dies ist Kleber, der den Knoten bedeckt. Wir wollen nur eine sehr dünne Schicht, damit sie die Bildgebung nicht verdeckt. Ich werde dann einen Lymphknoten aus der Lösung nehmen.

Beginnen wir also mit unserem ersten Lymphknoten hier aus den Medien. Du willst sanft damit umgehen. Sie möchten den Kortex des Knotens nicht beschädigen.

Ich greife nur die Ecke davon und klebe sie auf die Rutsche, indem ich die Ecke des Lymphknotens zuerst sanft mit der Rutsche berühre und dann den Lymphknoten über die Rutsche ziehe, um sie an der Rutsche zu befestigen. Also habe ich dieses winzige Stück Fett verwendet, das am Rand des Lymphknotens übrig geblieben ist, um das zu tun. Ich störe also eigentlich nicht den Kortex des Knotens.

Dann nehme ich den Lymphknoten und um den Kleber auszuhärten, tauche ich ihn in die gleiche Vertiefung, aus der ich ihn herausgenommen habe. Drehen Sie es also auf den Kopf und tauchen Sie es vorsichtig in das Medium, das den ganzen Kleber trägt. Entferne ein wenig von dem Exo-Kleber, der damit ausgehärtet wurde.

Na bitte. Jetzt haben wir einen Lymphknoten für die Zwei-Photonen-Bildgebung vorbereitet. So bereiten Sie Lymphknoten für die in situ Zwei-Photonen-Bildgebung vor.

Jetzt bringen wir sie zu unserem Mikroskop, richten es ein und machen einige großartige Bilder von T-Zellen, die wir adoptiv übertragen haben. Hier haben wir also CFSE-markierte T-Zellen, die sich in einem leistenförmigen Lymphknoten bewegen. Dieses Video wird etwa 500 Mal beschleunigt und man kann sehen, dass die Zellen sehr beweglich sind.

Sie werden mit unserem 20-fachen Wassertauchobjektiv um das ca. 20-fache vergrößert. Dies ist nur ein Beispiel für die Bewegung der T-Zellen. Wir haben nichts getan, um die umliegenden Zellen zu färben.

In der Regel können Sie in fortgeschritteneren Zwei-Photo-Experimenten gefärbte dendritische Zellen, gefärbte B-Zellen und T-Zellen haben, die mit gefärbten NK-Zellen interagieren. Sie können fast jeden Zelltyp, den Sie im Lymphknoten erwarten würden, markieren und ihn abbilden. Das war's also für unser Institut Lymphknoten-Bildgebungsprotokoll.