Name: Dissection und 2-Photonen-Imaging der peripheren Lymphknoten in Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 48 s
Description: Lernen Sie die Präparation peripherer Lymphknoten und 2-Photonen-Imaging in Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von CD4+ T-Zell-Motilität und liefert Einblicke in Immunantworten.

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Wir wollen Rebecca Paquette für die Unterstützung bei Reagenzzubereitung danken. MPM wird von einem Ruth L. Kirchstein Promotionsstipendium von der National Institutes of Health und der Unterstützung durch Stipendien GM-41514 (MDC), NS-48252 (KGC), GM-48071 (IP) auch von den National Institutes of Health unterstützt.

1. Adoptiven Transfer von Zellen: Schwanzvene oder intraokulare Injektion sowohl geeignete Methoden für die Einführung der Zelle tracker-markierten oder fluoreszierenden Protein-exprimierenden Lymphozyten. In diesem Video. wir zeigen, adoptiven Transfer von Zellen durch Schwanzvene Injektion. a. Materialien CD4 + T-Zellen sind mit 1,4 uM CFSE für 30 Minuten bei 37 º C gekennzeichnet, zweimal gewaschen, und in 100 ul RPMI-1640 resuspendiert. Die Zellen werden in ein steriles 28 Stärke Insulin Spritze zur Injektion geladen. Die Anzahl der Zellen richtet sich nach dem Experiment getan. Typischerweise sind 5 Millionen T-Zellen ausreichend für einfache T-Zell-Visualisierung. Ein Nagetier restrainer für die Maus benötigt wird, um Verletzungen des Tieres und sich selbst zu verhindern. b. Die Sicherung der Tier- Die Maus ist für adoptiven Transfer von langsam Unterstützung des Tieres in das Nagetier restrainer (siehe Video) und das offene Ende der Röhre durch leichtes Herunterdrücken des Kolbens gesichert. Nicht loslassen der Maus Schwanz während dieses Prozesses, da einige kleinere Tiere können umdrehen im restrainer. Diese Methode verhindert, dass das Tier von einer Verletzung selbst und von beweglichen während der Injektion. Beim Einrichten der Nager restrainer, nicht drücken Sie den Kolben in weiteren als notwendig, um das Tier aus Springen nach vorn zu behalten. Auch tun nicht den Kolben gegen das Tier, und nicht aus dem Tier in der restrainer für einen längeren Zeitraum. c. Visualisierung der Schwanzvene Ziehen Sie das Heck zu Ihnen, so dass es leicht ist, über den Zeigefinger gewickelt und hielt gegen die Innenseite des Fingers durch den Daumen. Identifizieren Sie die Schwanzvenen auf beiden Seiten des aufrechten Schwanzes entfernt. Die Visualisierung ist durch die Erwärmung der Schwanz mit warmem Wasser, dann wischte sich mit Ethanol erleichtert. d. Die Injektion von Zellen Wenn die Vene gefunden wurde, legen Sie die Spritze Kegel-Seite nach oben in einem flachen Winkel parallel zur Ader. Einmal in die Vene, sanft drücken Sie den Kolben, und wenn du in die Vene werden sollte keinen Widerstand gegen die Injektion. Wenn es irgendeinen Widerstand, entfernen Sie die Spritze und versuchen Sie es erneut an einem anderen Ort. Wenn Sie in die Vene sind, langsam drücken Sie den Kolben, bis die Injektion abgeschlossen ist. Die Rute sollte nicht während der Injektion aufgetrieben. Wenn ja, würde dies bedeuten, dass die Nadel nicht in die Vene. Es ist möglich, &quot;verlieren&quot; die Vene bei der Injektion. Wenn dies geschieht, entfernen Sie die Nadel und versuchen Sie Ihr Injektion an einer anderen Stelle. Wenn Sie mehr als eine Injektion versuchen müssen, ist es am besten, den Schwanz nach oben in Richtung der Körper der Maus aus der ursprünglichen Einstichstelle. Planen Sie im Voraus für diese Möglichkeit, indem Sie nach distal auf dem Schwanz, um sich selbst Raum für einen weiteren Versuch an die Adoptiveltern übertragen. e. Post-Injektion Überlegungen Nach der Injektion abgeschlossen ist, wird eine kleine Rückfluss des Blutes aus den Venen auftreten. Drücken Sie vorsichtig die Einstichstelle mit einem, bis die Blutung aufhört sauber wischen. Entfernen Sie den Kolben und lassen Sie das Tier nach vorne zu gehen, aus dem restrainer, während sanft Festhalten an der Rute. Immer mit Ihrem Tierpflege Ausschuss und Nutzung von Tieren Protokolle überprüfen, um sicherzustellen, Sie sind im Einklang. Es ist wichtig, die Praxis dieser Technik mehrere Male, bevor Sie versuchen das echte Experiment. 2. Lymph Node Isolation Isolation von Lymphknoten für Zwei-Photonen-Imaging erfordert eine sorgfältige Entfernung der richtige Lymphknoten aus dem umgebenden Gewebe. a. Auswahl und Lage der peripheren Lymphknoten Auswahl der Lymphknoten für die Bildgebung auf den experimentellen Ziele abhängen. Seien Sie sich bewusst von einer lokalen Infektion oder Spritz-Lymphknoten, und wählen Sie den entsprechenden Knoten für die Bildgebung. Der Artikel von Van den Broeck et al., Beschreibt die Lage und Morphologie der murinen Lymphknoten in detail 3. In diesem Video zeigen wir, das Ausschneiden von sechs großen peripheren Lymphknoten, die sich für Zell-Isolierung oder Bildgebung. b. Lymphknoten-Entfernung: Denken Sie daran, die Integrität des Gewebes beim Entfernen Lymphknoten. Achten Sie darauf, nicht zum Bruch der Kapsel oder in irgendeiner Weise Schaden den Lymphknoten Struktur. Der Verlust der Lymphknoten strukturelle Integrität beeinträchtigt die experimentieren. Falls notwendig, entfernen Sie Fett aus den Lymphknoten Oberfläche mit feinen Zerlegung (# 5 Dumont) Pinzette unter einem Binokular. Lymphknoten sollten keine verbleibende Fett auf der Oberfläche des Knotens, da dies Bildgebung durch Streuung des Lichts im Dunkeln. Proper Exzision von Lymphknoten ist auch eine wichtige Technik, um vor dem ersten realen Experiment Praxis. 3. Lymph Node Imaging-Setup und Überlegungen Die Lymphknoten sollte die Bildgebung der Bühne, die in diesem Fall aus einem vertieften Kammer gesichert werden. Erwärmt, Sauerstoff-perfundierten Medien wird in die Kammer von einer Seite mit einer Schlauchpumpe und Durchlauferhitzer gepumpt, und es tritt über eine nach unten abgestufte Kanal in einen Sammelraum mit einer Vakuumröhre zu einer Sammelstelle Kolben. In unserem System ist die Lymphknoten in 37 ° C getaucht Medien und mit medizinischem Carbogen (5% CO 2, 95% O 2) super-perfundiert. Die Temperatur der Perfusion Medien sollten möglichst nahe an den Lymphknoten erfasst werden, wie es möglich ist. Ihr spezielles System kann verlangen, Variationen in den Medien Durchfluss und Bühnenbild an das Mikroskop Bühne und Ziel unterzubringen. a. Lymphknoten Imaging-Setup: Wie in dem Video zu sehen, sichern wir die Lymphknoten, indem Sie zuerst Anbringen es, medulläre-Seite nach unten (auf Bild T-oder B-Zell-Zonen mit einem aufrechten Mikroskop), um eine Kunststoff-Deckglas, zugeschnitten auf die entsprechende Größe. Es ist wichtig, eine ungiftige Gewebekleber (wir verwenden VetBond ™ von 3M Corporation) zu verwenden. Das Deckglas wird in der strömenden Medien, indem Sie einen kleinen Klecks Silikonfett an der Unterseite des Deckglases gesichert, dann haften diese auf das Glas Basis der bildgebenden Kammer. b. 2-Photonen-Imaging-Überlegungen: Mehrere Faktoren können dazu führen Lymphozyten nicht mehr bewegt: Temperatur zu hoch oder zu niedrig ist; mehr Laserleistung, Kompression oder andere Schäden an den Lymphknoten, und der Mangel an Sauerstoff. Schäden durch übermäßige Laserleistung oder Temperaturen&gt; ~ 39 ° C ist irreversibel. Wenn Zellen dim sind, ist es normalerweise besser, den Detektor zu gewinnen oder die Zell-Kennzeichnung Protokoll anstatt mit einem höheren Laserleistung, um Zellen zu visualisieren zu erhöhen. Optimierung der Kennzeichnung oder die Expression von fluoreszierenden Proteinen erforderlich, um die Fluoreszenz über dem Niveau des Hintergrund-Autofluoreszenz zu bringen. Mit angemessenen Gewinn-und Laser-Energie-Einstellungen, etwa zwei-log Verschiebung der Fluoreszenz über dem Ausgangswert (gemessen mittels Durchflusszytometrie) ist sinnvoll für die Zell-Visualisierung. Mit abstimmbaren Zwei-Photonen-Laser, sollte die Wellenlänge für die Anregung verwendet werden etwas weniger als das Doppelte der Single-Photonen-Anregung des Fluorophors wird abgebildet. In Zwei-Photonen-Experimente mit mehr als einem Etikett oder fluoreszierende Protein kann es notwendig sein, zu experimentieren mit der Anregungswellenlänge verwendet werden, um die optimalen Einstellungen für beide Labels zu finden. Zwei-Photonen-Anregung kann auch zu Bild endogene Kollagen-Strukturen unter Ausnutzung der inneren blauen Erzeugung der zweiten Harmonischen verwendet werden. Second Harmonic Generation (SHG) liegt vor, wenn zwei Photonen innerhalb eines Materials kombiniert und emittieren ein einzelnes Photon mit der doppelten Frequenz des ursprünglichen Photonen. Im Gewebe tritt Zwei-Photonen-Anregung, wenn das einfallende Laserlicht senkrecht zu einer hoch geordneten Proteinstruktur wie Kollagen. Praktische Fragen der Zwei-Photonen-Imaging wurden in der Vorschau ansehen 4, 5 diskutiert.

<ol><li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+Cell+Motility+and+Interaction+Dynamics+Imaged+by+Two-Photon+Microscopy+in+Lymphoid+Organs.+Annu+Rev+Immunol%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol.</a> Annu Rev Immunol. , (2008).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes%3A+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB%2FcAnNCrl+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).</li>
<li>Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+tissue+imaging%3A+seeing+the+immune+system+in+a+fresh+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light.</a> Nat Rev Immunol. 2, 872-880 (2002).</li>
<li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+the+immune+system%3A+progress%2C+pitfalls+and+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li>
</ol>

In diesem Video-Protokoll zeigen wir die Verfahren für Adoptiv-Zell-Transfer und Lymphknoten isoliert und die Vorbereitung für bildgebende Lymphozyten Motilität in einem peripheren Lymphknoten erforderlich. Zwei-Photonen-Imaging hat mehrere Vorteile gegenüber konfokale Bildgebung in beiden explantierten Gewebe (hier abgebildet) und in intravital Vorbereitungen. Insbesondere von Infrarot-Anregung verwenden minimiert Streulicht und erlaubt die Abbildung ~ 300 Mikrometer unter der Kapsel des Lymphknotens und tiefer in einigen Geweben 4. Darüber hinaus ist Multi-Photonen-Anregung, um den Brennpunkt des Objektivs begrenzt und minimiert Foto Bleich-und Gewebeschäden aus Seite der Fokalebene. Wie bei jeder neuen Technik ist jedoch, Zwei-Photonen-Imaging kein Allheilmittel und ihre Grenzen und mögliche Fallstricke zu beachten 5 gehalten werden. Unter diesen ist die Forderung, dass - mit Ausnahme intrinsische Signale wie Erzeugung der zweiten Harmonischen von Kollagen-Zellen von Interesse sind fluoreszierend durch extrinsische Sonden oder durch die Expression von fluoreszierenden Proteinen markiert werden. Der Eindruck ist so angelegt, dass diese markierten Zellen werden in einem schwarzen Leere schwimmen, während in Wahrheit sind sie in getaucht, und die Interaktion mit einem komplexen Umfeld von Strukturelementen und unzähligen anderen unbeschrifteten, unsichtbare Zellen. In den sechs Jahren seit Einführung der Zwei-Photonen-Imaging zur Immunologie, hat diese Technik Forschern erlaubt, langjährige Fragen direkt Visualisierung in intakten lebenden Geweben Prozesse einschließlich Zell-Zell-Interaktionen, Zell-Motilität und Lokalisierung, zelluläre Signalwege und zytotoxische Zelladresse Töten Veranstaltungen. Das Feld hat sich schnell über den anfänglichen phänomenologischen Beschreibungen entwickelt und quantitative Analysen zusammen mit Computer-Modellierung und Simulation beginnen jetzt zu spüren, wie die scheinbar chaotische zelluläre Bewegungen und Interaktionen in Lymphknoten führen zu einer effizienten Immunantwort zu machen. Dieser Fortschritt ist umfassend in einer kürzlich erschienenen Publikation 1, der über 100 Papiere beschreiben die Anwendung der Zwei-Photonen-Mikroskopie für immunoimaging Listen überprüft.

dissection und 2-photonen-imaging der peripheren lymphknoten in mäusen

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Zwei-Photonen-Imaging hat eine elegante Choreographie von Motilität und zellulären Interaktionen im Lymphknoten unter basalen Bedingungen und bei der Initiierung einer Immunantwort 1 zeigte. Hier präsentieren wir Methoden zur adoptiven Transfer von markierten T-Zellen, Isolierung von Lymphknoten und Imaging-Motilität der CD4 + T-Zellen in der explantierten Lymphknoten als erste in 2002 2 beschrieben. Zwei-Photonen-Imaging von Immunzellen setzt voraus, dass die Zellen fluoreszierend markiert sind, entweder durch Färbung mit einer Zelle tracker Farbstoff oder die Expression eines fluoreszierenden Proteins. Wir zeigen die adoptiven Transfer Verfahren der Injektion von Zellen vom Spender-Mäusen in die Schwanzvene eines Empfängers Tier, wo sie die Heimat von lymphatischen Organen innerhalb von ca. 15-30 min. Abgeleitete Wir zeigen die Isolierung von einem Lymphknoten und beschreiben Methoden, um die ordnungsgemäße Montage der herausgeschnittenen Lymphknoten zu gewährleisten. Andere Überlegungen wie die korrekte Sauerstoffversorgung des perfundierten Medien, Temperatur und Laserleistung werden diskutiert. Schließlich präsentieren wir 3D-Videobilder von naiven CD4 + T-Zellen präsentiert steady state Motilität bei 37 ° C.

Zwei-Photonen-Imaging hat Lymphozyten Motilität und zellulären Interaktionen im Lymphknoten unter basalen Bedingungen und während einer Immunantwort Antwort 1 aufgedeckt. Hier zeigen wir, adoptiven Transfer von T-Zellen, Isolierung von Lymphknoten und Imaging-Motilität der CD4 + T-Zellen in der explantierten Lymphknoten.

Dissection und 2-Photonen-Imaging der peripheren Lymphknoten in Mäusen

Die Zwei-Photonen-Bildgebung hat eine elegante Choreografie der Motilität und der zellulären Interaktionen innerhalb des Lymphknotens unter Basalbedingungen und bei der ...

Hallo, mein Name ist Melanie Matthew. Ich komme aus dem Labor von Micah Helen an der University of California Irvine. Heute werden wir Lymphknoten aus einer Maus entnehmen, um sie für die In-situ-Photonen-Bildgebung zu verwenden.Dabei werden die inguinalen Lymphknoten, die axillären Lymphknoten und die zervikalen Lymphknoten entfernt. Die sechs peripheren Lymphknoten, die bei einer Maus leicht zugänglich sind, um fluoreszierende Zellen in die Lymphknoten der Maus zu bringen. Um mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie abzubilden, müssen wir zunächst eine adoptive Übertragung fluoreszenzmarkierter Zellen durchführen.Für dieses Experiment werde ich Ihnen zuerst die adoptive Übertragung zeigen. Hier ist unsere Insulinspritze mit 28 Gauge. Ich werde sie mit einigen Zellen beladen.Zuerst möchte ich die Spritze entstopfen, damit sie leicht fließt. Anschließend werde ich vorsichtig die Zellen aufziehen. Dabei werde ich sorgfältig darauf achten, die Wände des Röhrchens mit der Insulinspritze nicht zu berühren, da dies die Spritze abstumpfen und die Injektion in die Schwanzvene der Maus erschweren würde.Wenn Luftblasen vorhanden sind, müssen Sie diese vorsichtig herausschütteln, sie sozusagen aus dem Weg bringen. Schlagen Sie sie hier aus dem Weg. So, jetzt ist alles in Ordnung.Jetzt sind wir bereit, diese Zellen in die Schwanzvene zu injizieren. Gut, hier ist unsere C57BL/6-Maus. Wir werden sie langsam und vorsichtig in den Schwanzvenen-Injektor schieben.Viele Mäuse mögen dies nicht, aber es verhindert, dass sie beim eigentlichen Injektionsvorgang herumspringen und sich selbst verletzen oder dass möglicherweise eine Nadelverletzung beim Anwender auftritt. Daher sichern Sie die Maus langsam und vorsichtig innenliegend. Nun suchen Sie nach der Schwanzvene an den Seiten des Schwanzes der Maus.Entlang der Oberseite verläuft also eine große Arterie. Und auf beiden Seiten des Schwanzes der Maus befinden sich zwei gut sichtbare, lange Venen, die bis zur Spitze reichen.Sie nehmen Ihre Nadel und beginnen am distalen Ende des Schwanzes, um nach einer Vene zu suchen. Ich kann hier genau eine Vene erkennen. Ich werde sie mit etwas Ethanol benetzen, was die Sichtbarkeit etwas verbessern kann.Okay, jetzt injizieren wir in die Schwanzvene, und es ist wichtig, die Kanüle mit der Schräge nach oben zu halten. Das bedeutet, das geöffnete Ende der Kanüle zeigt nach oben. Außerdem sollte die Bewegung nahezu parallel zum Schwanz verlaufen.Sie sollten keinen Winkel einhalten, da die Venen direkt an der Oberfläche liegen. Sie möchten die Nadel sehr langsam in die Schwanzvene gleiten lassen. Währenddessen sollten Sie spüren können, wie sie eindringt, besonders mit etwas mehr Erfahrung.Beim ersten und zweiten Mal möchten Sie jedoch die Flüssigkeit andrücken und prüfen, ob ein Widerstand spürbar ist. Wenn kein Widerstand vorhanden ist, befinden Sie sich in der Schwanzvene, und Sie können eine schnelle, einfache Injektion durchführen, wie ich es gerade getan habe. Danach können Sie die Nadel langsam herausziehen.Eine weitere Bestätigung dafür, dass Sie in der Vene sind, ist das Auftreten eines kleinen Bluttropfens durch den Rückfluss. Ein leichter Blutrückfluss aus der Injektionsstelle bestätigt also, dass Sie sich definitiv in der Schwanzvene befinden. Die Maus sollte kurz nach der Injektion aufhören zu bluten.Okay, hier ist unsere schwarze Sechs-Maus. Wir werden der Maus die Lymphknoten aus den Leistenregionen entnehmen, und zwar hier, sowie hier unter der Achsel, wo sich die axillären Lymphknoten befinden, und auf der anderen Seite hier. Außerdem die oberflächlichen zervikalen Lymphknoten, die sich hier im Halsbereich befinden, jeweils einer auf jeder Seite.Hallo. Jetzt sind wir bereit, unsere Maus zu sezieren. Ich werde damit beginnen, die Maus hier auf der Präparationsplatte festzustecken. Stecken Sie einfach die Pfoten fest. Ja.Sie möchten sicherstellen, dass die Fixierung stabil ist. Dadurch können wir die peripheren Lymphknoten besser freilegen. Daher fixiere ich normalerweise einfach alle vier Pfoten nach unten.Ich mache mir keine Sorgen um den Schwanz. Manche Leute ziehen es vor, auch den Schwanz festzustecken. Um zu verhindern, dass Fell in den Bereich gelangt, in dem wir präparieren, und unsere Lymphknoten sowie unsere Instrumente verunreinigt, besprühen wir die Maus mit 70 % Ethanol.Und nun, da die Maus mit Ethanol betäubt ist, werde ich einen Schnitt entlang der Mittellinie vornehmen. Dazu ziehe ich das Fell vom Körper weg. Die Haut, wie Sie sehen können, kann ich hochziehen und ein kleines Zelt bilden.Das verhindert, dass Sie das Peritoneum verletzen, was in diesem Fall nicht gewünscht ist. Okay, ich beginne hier oben mit meinem medianen Schnitt. Ich führe einen kleinen Schnitt durch und achte darauf, dass ich nicht in das Peritoneum eindringe.Sie können sehen, dass sich darunter das Peritoneum befindet. Ich schiebe die Schere unter den Schnitt und löse langsam die Haut vom Peritoneum ab, wobei ich kleine Schnitte mache, da wir die zervikalen Lymphknoten entnehmen werden. Ich werde sehr vorsichtig und langsam bis zur Kieferlinie der Maus hinaufschneiden, wobei ich darauf achte, keine größeren Blutgefäße zu verletzen.Und dann, da wir die inguinalen Lymphknoten entnehmen, die sich im unteren Bereich des Hautlappens befinden, führe ich einen medianen Schnitt bis etwa zur Schwanzspitze, also zur Basis des Schwanzes, durch. So, jetzt haben wir einen medianen Schnitt, der für unsere Zwecke geeignet ist.Jetzt werde ich die Haut vom Peritoneum trennen. Ich werde dies vorsichtig mit einer Pinzette tun, wobei ich die Haut beim Vorgehen vom Peritoneum wegzuziehen. So exponiere ich den ersten Lymphknoten, den wir dissezieren werden.Dies ist der inguinale Lymphknoten hier in der unteren Hautlappenregion. Nachdem ich nun einen Hautlappen vom Hauptkörper der Maus gelöst habe, werde ich ihn fixieren, um den inguinalen Lymphknoten freizulegen. So ist der inguinale Lymphknoten besser zugänglich, was uns ermöglicht, ihn sauber zu dissezieren.Hier sehen wir den nach dem Fixieren freigelegten Leistenlymphknoten. Er befindet sich typischerweise in der Hautlappenregion direkt oberhalb des Beins. Man kann ihn durch die Y-förmige Verzweigung der darüber verlaufenden Blutgefäße identifizieren.Und hier ist es. Es liegt eingebettet in etwas Fettgewebe, mit Blutgefäßen, die darüber verlaufen. Gut, jetzt werde ich den inguinalen Lymphknoten entfernen.Ich führe meine Pinzette entlang beider Seiten des Lymphknotens, um ihn vom Fettgewebe zu lösen. Wir wollen kein Fett. Bei unserer Zwei-Photonen-Bildgebung würde dies die Laserdurchdringung des Gewebes beeinträchtigen.Mal sehen. Es ist wichtig, das gesamte Fettgewebe vom Lymphknoten abzulösen und gleichzeitig die Rinde des Lymphknotens intakt zu halten. Gut, das ist geschafft.Hier ist unser Iena-Lymphknoten. Ich werde ihn in unser Medium geben, und ein guter Hinweis dafür, ob Sie das gesamte Fett entfernt haben, ist, dass der Lymphknoten absinkt. Sobald Sie ihn ins Medium geben, sinkt er direkt auf den Boden.Wenn sich Fett befindet, wird es schwimmen. Gut, jetzt werde ich den Hilfslymphknoten entfernen. Er liegt in der Achselhöhle der Maus direkt entlang eines großen Blutgefses.Manchmal kann es also schwierig sein, da viel Blutungen auftreten können, die den Knoten verdecken. Ich zeige Ihnen jedoch, was ich tue, und hoffentlich treten diesmal keine Blutungen auf. Zunächst löse ich die Hautlappen und danach tatsächlich den Unterarm neben dem Knoten, den ich entnehmen möchte.Dadurch kann ich die Haut mit größerer Geschicklichkeit mit den Fingern wegziehen, halte jedoch diesen über der Achselhöhle verlaufenden Muskel fest, und durch sanftes Ziehen sollte ein axillärer Lymphknoten hervortreten. Und ich werde ihn jetzt suchen. Da ist er.Es liegt direkt in der Achselhöhle entlang eines großen Blutgefäßes. Nun werde ich den Axillarknoten freilegen, und Sie können die Haut entweder mit Nadeln fixieren oder mit den Fingern halten, je nachdem, was Ihnen lieber ist. Ich bevorzuge jedoch eine sorgfältige Arbeitsweise hierbei.Um diesen Lymphknoten herum befindet sich sehr wenig Fettgewebe, was ihn gut für die Bildgebung geeignet macht, doch da er neben einem größeren Blutgefäß liegt, kann man ihn manchmal verlieren, wenn man nicht vorsichtig ist. Beim axillären Knoten greife ich daher das umgebende Bindegewebe und löse ihn langsam vorsichtig von den Blutgefäßen ab. Und gut, jetzt haben wir ihn.Hier ist unser Achselknoten. Er liegt genau dort. Es ist ein schön langer, flacher Lymphknoten.Und ich halte leicht ein wenig Bindegewebe, das an der Seite des Lymphknotens übrig ist, fest, um den eigentlichen Lymphknoten nicht zu beschädigen. Wir werden die Lymphknoten abbilden, um sie feucht zu halten. Bevor wir mit der Aufnahme beginnen, legen wir sie in individuelle Kammern mit CO2-unabhängigem Medium, sodass wir die inguinalen, axillären und zervikalen Lymphknoten unterscheiden können.Man erkennt eine gute Lymphknotenpräparation daran, dass der Lymphknoten nach der Auspräparation zu Boden sinkt. Das bedeutet, dass sich nur sehr wenig Fett im Lymphknoten befindet. Gut, jetzt werde ich den zervikalen Lymphknoten, den oberflächlichen zervikalen, entfernen.Und das mache ich, indem ich erneut fixiere, ausgehend von der Stelle, an der ich den axillären Lymphknoten entfernt habe, um das zervikale Gewebe etwas besser freizulegen. Die zervikalen Lymphknoten befinden sich in der Nähe der Kaumuskulatur der Maus, tatsächlich entlang der Seite.Es handelt sich um dieselben Lymphknoten, die Sie spüren können, wenn Sie krank sind. Es sind die hier, nach denen Ihr Arzt tastet, wenn Sie eine Erkältung haben. Um dies durchzuführen, stecke ich typischerweise meinen Finger unter das Gewebe, um es leicht nach vorne zu ziehen, während ich mit der Pinzette entlang der Seite gleite.Es sollte ein Lymphknoten vorhanden sein, der hervortritt. Oh, da ist er. Er befindet sich dort im Gewebe.Hier ist es. Hier befindet sich ein oberflächlicher zervikaler Lymphknoten. Achten Sie darauf, dass Sie keine Speicheldrüsen mitentfernen.Sie werden keine T-Zellen in Ihren Speicheldrüsen finden. Und diese bestimmten Lymphknoten enthalten CD4-positive T-Zellen, die mit CFSC markiert sind. Wir zeigen Ihnen daher einige In-situ-Videos dieser T-Zellen, die sich im Gewebe bewegen.Okay, jetzt werde ich den Lymphknoten mit einem unzerbrechlichen Kunststoff-Deckglas verkleben, damit wir ihn am Boden unserer In-situ-Bildgebungsplattform befestigen können. Dadurch vermeiden wir Bewegungen des Gewebes oder Gewebeverschiebungen, während wir die T-Zellen abbilden. Hier habe ich also meine unzerbrechlichen Kunststoff-Deckgläser.Als Erstes werde ich eines davon auf die richtige Größe für unseren Lymphknoten zus schneiden. Ich nehme also meine Schere und schneide hier ein kleines Quadrat ab. Gut, jetzt werde ich Kleber darauf tupfen.Es ist ein kleiner Klebstofftropfen. Verteilen Sie ihn auf dem Objektträgerstück, das wir zugeschnitten haben. Dann nehme ich ein Kim-Tuch und sauge etwas von dem Klebstoff ab.Dies ist ein Klebstoff, der den Knoten bedecken wird. Wir möchten lediglich eine sehr dünne Schicht, damit die Bildgebung nicht beeinträchtigt wird. Anschließend entnehme ich einen Lymphknoten aus der Lösung.Wir beginnen hier mit unserem ersten Lymphknoten aus dem Media. Seien Sie vorsichtig dabei. Sie möchten die Kapsel des Lymphknotens nicht beschädigen.Ich werde nur die Ecke davon greifen und sie auf dem Objektträger befestigen, indem ich die Ecke des Lymphknotens zuerst vorsichtig auf den Objektträger lege und dann den Lymphknoten über den Objektträger ziehe, um ihn dort zu fixieren. Dazu habe ich diesen winzigen Rest Fett verwendet, der am Rand des Lymphknotens verblieben war. Dadurch störe ich tatsächlich nicht die Rinde des Knotens.Danach nehme ich den Lymphknoten und tauche ihn nun zur Aushärtung des Klebers in das gleiche Reservoir, aus dem ich ihn zuvor entnommen habe. Ich drehe ihn also um und tauche ihn vorsichtig in das Medium, wodurch der gesamte Kleber mitgeführt wird. Anschließend entferne ich vorsichtig etwas vom Exo-Kleber, der zusammen mit dem Gewebe ausgehärtet ist.So, jetzt haben wir einen Lymphknoten für die Zwei-Photonen-Bildgebung vorbereitet. So bereiten Sie Lymphknoten für die in-situ-Zwei-Photonen-Bildgebung vor.Jetzt bringen wir sie zu unserem Mikroskop, richten es ein und gewinnen einige hervorragende Aufnahmen der T-Zellen, die wir adoptiv übertragen haben. Hier sehen wir CFSE-markierte T-Zellen, die sich innerhalb eines inguinalen Lymphknotens bewegen. Dieses Video ist etwa 500-fach beschleunigt, und Sie können erkennen, dass die Zellen äußerst beweglich sind.Sie werden mit unserem 20x-Wasser-Immersionsobjektiv um etwa das 20-Fache vergrößert. Dies ist lediglich ein Beispiel für die Bewegung von T-Zellen. Wir haben nichts unternommen, um die umgebenden Zellen anzufärben.Typischerweise können bei fortgeschrittenen Zwei-Photonen-Experimenten gefärbte dendritische Zellen, gefärbte B-Zellen und T-Zellen interagierende, gefärbte NK-Zellen aufweisen. Man kann nahezu jeden Zelltyp, den man im Lymphknoten erwarten würde, markieren und anschließend abbilden. Damit ist das Protokoll zur Lymphknotenbildgebung unseres Instituts abgeschlossen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir präsentieren Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Erzeugung von Chimären Neugeborenen sowie die Präparation und Vorbereitung des Thymus für die Ex-vivo-Bildgebung durch 2-Photonen-Mikroskopie.

In situ Imaging der Maus Thymus mit 2-Photonen-Mikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Bild fluoreszierenden T-Zellen in Lymphknoten Scheiben eingeführt. Die Technik ermöglicht Echtzeit-Analysen der T-Zell-Migration mit traditionellen Weitfeld-Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskopen.

Ex-vivo-Imaging von T-Zellen in Murine Lymph Node Slices mit Weitfeld und konfokale Mikroskope

Wir haben neuartige Labormethoden und Protokolle zur intravitale Bildgebung des Thymus entwickelt. Unsere Technik sollte bei der Identifizierung von „Nischen“ im Thymus helfen, in denen die Entwicklung von T-Zellen stattfindet.

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Jüngste Fortschritte in der 2-Photonen-Mikroskopie sind in Echtzeit...

Bildgebung des dem Maus-Kniekehlen-Lymphknoten

Kürzlich entwickelte Bildgebungsverfahren mittels Nah-Infrarot-Fluoreszenz (NIRF) kann helfen erläutern die Rolle spielt das Lymphsystem in Krebsmetastasen, Immunantwort, Wundheilung und anderen lymphatischen-assoziierten Krankheiten.

Nicht-invasive optische Abbildung des lymphatischen Gefäßsystem eines Maus

Dieses Video zeigt eine Seziertechnik zur Entnahme von kniekehlendrainierenden Lymphknoten aus den Hinterbeinen der Maus. Lymphknoten spielen eine entscheidende Rolle bei der Überbrückung der angeborenen und adaptiven Immunität, und die Entnahme intakter Lymphknoten – mit einer erhaltenen Gewebestruktur und zellulären Lebensfähigkeit – kann helfen, lokale und systemische Immunreaktionen zu untersuchen.

Eine Dissektionsmethode zur Entnahme von murinen Kniekehle-Drainagelymphknoten für die ex vivo-Bildgebung

Hochauflösende intravitalen Bildgebung mit Kontrastverstärkung von bis zu 120 &amp;mgr; m Tiefe in Lymphknoten von erwachsenen Mäusen durch räumliches Modulieren des Erregungsmusters einer multifokalen Zwei-Photonen-Mikroskop erreicht. In 100 um Tiefe gemessen wir Auflösungen von 487 nm (lateral) und 551 nm (axial) und damit umgehen, Streuung und Beugung Grenzen.

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, um verschiedene Zellpopulationen in entwässernden Lymphknoten ohne Veränderungen in der Organstruktur abzubilden.

Visualisierung der Lymphknotenstruktur und Zelllokalisierung mittels Ex-Vivo Konfokalmikroskopie

Ein Protokoll wird vorgestellt, das gewebeclearing mit Derobogenfluoreszenzmikroskopie (LSFM) kombiniert, um dreidimensionale und zelluläre Auflösungsbilder der Lymphgefäße und Lymphknoten (LNs) zu erhalten, die die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) und die spinale Epiduralanflüssigkeit sammeln.

Dreidimensionale Bildgebung der wirbelförmigen lymphatischen Vaskulatur und Drainage mit iDISCO+ und Lichtbogenfluoreszenzmikroskopie

Das Manuskript demonstriert eine innovative Methode zur in-vivo-Untersuchung der Kontraktilität zervikaler lymphatischer Gefäße und des Lymphflusses bei Mäusen zur Untersuchung verschiedener physiologischer Funktionen zervikaler lymphatischer Gefäße (cLVs) sowie der therapeutischen Strategien zur Modulation der lymphatischen Regulationsmechanismen des Hirnabflusses und der Clearance.

Reproduzierbare Einrichtung für die in vivo Zwei-Photonen-Bildgebung der Kontraktilität der zervikalen Lymphgefäße und des Lymphflusses bei Mäusen

Hier wird ein Protokoll zur Bewertung der meningealen lymphatischen Gefäße (MLVs) der Maus vorgestellt, die eine wichtige Rolle bei mehreren neurologischen Erkrankungen spielen. Ziel dieses Protokolls ist es, eine integrierte Methode bereitzustellen, die sowohl die funktionale Bewertung der Tracerdrainage als auch eine detaillierte morphologische Charakterisierung des dorsalen MLVs-Netzwerks ermöglicht.

Integriertes Protokoll zur Beurteilung der meningealen Lymphatik: Cisterna-Magna-Injektion, Lymphknotenbildgebung, meningeale Dissektion und Ganz-Mount-Färbung

Lernen Sie die Präparation peripherer Lymphknoten und 2-Photonen-Imaging in Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von CD4+ T-Zell-Motilität und liefert Einblicke in Immunantworten.

Dissection und 2-Photonen-Imaging der peripheren Lymphknoten in Mäusen

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