Name: Lineage Kennzeichnung von Zebrafisch-Zellen mit Laser Uncagable Fluorescein Dextran (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Erfahren Sie die Linienmarkierung von Zellen in Zebrafisch-Embryonen mittels UV-Laser-Aktivierung von caged Fluorescein. Diese Methode ermöglicht die Verfolgung von Zellschicksalen durch Immunfluoreszenzmikroskopie.

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Wir möchten Dan Carlin für Hilfe bei der Herstellung Käfig Fluorescein. Darüber hinaus möchten wir die folgenden Finanzierungsquellen danken: Vanderbilt University Medical School Program für Entwicklungsbiologie Training Grant zu JAC und NIH HD054534to JTG.

1. Synthese von Fluorescein Dextran Caged <ol><li> Messen Sie 3,5 bis 4 mg Aminodextran und fügen in die Invitrogen bereitgestellte getönte Röhre mit 1 mg CMNB-Käfig Fluorescein SE. In unseren Händen dieses Verhältnis ergibt eine durchschnittliche Belastung von ~ 2,5 Farbstoffmoleküle pro Dextran. </li><li> Add 500 ul von 0,1 M Na 2 B 4 O 7 (Natriumborat) Puffer, um das Rohr. </li><li> Cap und Vortex für 30 Sekunden, um die Aminodextran und eingesperrt Fluorescein aufzulösen. </li><li> Lassen Sie reagieren über Nacht auf einem Vortex-Mischer. </li><li> Twist off unten Schließung auf einer Zeba Spin-Säule und lösen Sie die Kappe. Markieren Sie einen Punkt auf der Säule mit einem Filzstift. Legen Spalte in einer 15-mL konischen Rohr. </li><li> Zentrifugation bei 1000 xg für 2 min mit dem Punkt vor der Mitte des Rotors. Verwenden Sie die Spalte sofort nach dem Verdichten. </li><li> Ort verdichtet Spalte in eine neue 15-mL konischen Rohr. </li><li> Pool Reaktionsgemisch und Transfer zum Zentrum des verdichteten Spalte Harzbett. Wieder aufsetzen. </li><li> Zentrifugation bei 1000 xg für 2 min mit dem Punkt vor der Mitte des Rotors. Nach dem Spin, wird dem Eluenten und der Kopf der Kolonne in etwa die gleichen Schatten in der Farbe gelb. </li><li> Übertragen Sie die gelbe Eluent (~ 350 mL) zu einer 1,5-ml-Reaktionsgefäß. </li><li> Lyophilisieren zur Trockne Speedvac. Decken Sie die Speedvac mit Folie. </li><li> Re-suspend die daraus resultierenden ~ 2-3 mg hellgelber Schaum im Wasser bis zu einer Endkonzentration von 1% w / v. </li><li> Bewahren Sie diese Lösung bei -20 ° C in Folie abgedeckten Rohre. Es ist eine gute Idee, Aliquot der Dextranlösung, um sich wiederholende Einfrieren und Auftauen zu vermeiden. </li></ol> 2. Die Injektion von Caged Fluorescein Dextran In Zebrafisch-Embryos <ol><li> Verdünnen Sie 1% w / v Bestand Käfig Fluorescein Dextran 1:5 oder 1:10 in 0,2 M KCl. </li><li> Inject 0,5 - 1.0nL der Käfig Fluorescein-Lösung in den Dotter von einer Zelle Embryonen mit einem Injektor. Nach der Injektion muss Kupplungen von Embryonen im Dunkeln bei 28,5 ° C gehalten werden, um unspezifische Uncaging reduzieren. </li><li> Entfernen Sie manuell Chorion aus Embryonen. </li><li> Anesthetize Embryonen in 4% Tricaine. </li><li> Embryonen werden in 0,8% Agarose in 35mmx10mm Petrischale angebracht werden, dann mit Ei mit Wasser bedeckt. </li><li> Äquilibrieren geschmolzener Agarose in 50 ° C Hitze-Block für mindestens 15 Minuten. </li><li> Mit einer Glaspipette, Ausarbeitung eines Embryos in einer minimalen Menge Wasser und geben es in die Agarose. Hinweis: Es ist wichtig, um das Rohr von Agarose in Ihrer Hand kühl für ca. 30 Sekunden vor der Inbetriebnahme des Embryos in die Röhre zu vermeiden Tötung des Embryos. </li><li> Pipette der Embryo aus der Tube, zusammen mit etwa 50 ul Agarose und werfen den Inhalt auf der Mitte der Petrischale. </li><li> Schnell orientieren des Embryos mit einem Kunststoff-Faden mit den Zellen zu uncaged nach oben zeigt. Hinweis: Die Agarose mit kühlen schnell so voreilig sein mit der Ausrichtung des Embryos. Embryonen können beschädigt werden, wenn manipuliert, nachdem die Agarose erstarrt sein. </li><li> Lassen Sie die Agarose vollständig erstarren (das dauert ein paar Minuten) und füllen die Schüssel zu zwei Dritteln gefüllt mit Ei Wasser mit 4% Tricaine und 0,003% PTU. </li></ol> 3. Laser Uncaging von Fluorescein Dextran <ol><li> Das Mikroskop für Uncaging verwendet muss einen 40X Wasserimmersionsobjektiv. </li><li> Wir verwenden eine Photonics Instruments Laser mit der 365 nm Farbstoff-Zelle und die 70% / 30% aufgeteilt dichroitischen Spiegel. </li><li> Vor Uncaging, muss der Laser gemacht parfokal mit dem Ziel und abgeschwächt auf die entsprechende Leistung sein. </li><li> Zur Fokussierung des Lasers, statt eines gespiegelten Objektträger unter das Ziel und Schwerpunkt der Ziel bis Kratzer in der Folie sichtbar sind. </li><li> Passen Laser Abschwächer bis der Laser eine deutlich sichtbare Kratzer in den Spiegel mit einem einzigen Impuls erzeugen können. </li><li> Passen Sie das Ziel konzentrieren rauf und runter. Wenn der Laser einen Kratzer produzieren kann, wenn das Ziel ist unscharf, passen Sie die Laserfokus ¼ Drehung nach oben oder unten. Wiederholen, bis der Laser die Spiegel nur, wenn das Ziel fokussiert ist verkratzen können. </li><li> Ort montiert Embryo unter dem Objektiv und Fokussierung auf den Bereich um uncaged werden. </li><li> Um Uncage, auf eine Zelle von Interesse konzentrieren und Puls ist 10-20 mal bei 2-3 Hz. </li><li> Nach Uncaging, kostenlos den Embryo durch Schälen Agarose entfernt mit einer Pinzette und setzen sie in Ei-Wasser mit 0,003% PTU. Lassen Embryonen in einer lichtdichten Box zu entwickeln, bis sie fixiert sind. </li></ol> 4. Antikörper Markierung und Detektion von Uncaged Fluorescein Dextran <ol><li> Fix Embryonen in Ab Fixativ (4% Paraformaldehyd, 0,3 CaCl 2, 8% Saccharose, Buffered 1X Phosphat Saline, pH 7,3) für zwei Minuten vor vier Stunden bei Raumtemperatur (RT) oder über Nacht (O / N) bei 4 ° C. Keep Embryonen in einem lichtdichten Kasten oder Folie eingeschweißt Rohr für die Etikettierung Schritte. </li><li> Entfernen Fixiermittel und ersetzen mit 100% MeOH, lassen für 10 Minuten bei RT, entfernen MeOH und Replace mit frischen 100% MeOH. </li><li> Shop in MeOH bei -20 ° C für mindestens 30 Minuten. Hinweis: Sie können in MeOH für bis zu zwei Wochen lagern, bevor Epitope zu beeinträchtigen beginnen. </li><li> Rehydrieren Embryonen mit 5 Minuten Wäschen bei RT von 75% MeOH/1X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit 0,1% Tween 20 (1X PBSTw), dann 50% MeOH/50% 1XPBTw, dann 25% MeOH/75% 1X PBSTw. </li><li> Dreimal für 5 Minuten in 1XPBSTw. </li><li> Wenn Embryonen&gt; 24 Stunden alt sind, permiabilize Embryonen mit 10 pg / ml Proteinase K in 1XPBSTw. Permiabilization ist abhängig von der Bühne. Fünf Minuten in Proteinase K ist ausreichend, wenn die Embryonen zwischen 24 und 48 Stunden nach der Befruchtung (HPF) sind. Mehr Zeit kann, wenn für ältere Larven erforderlich. Re-fix in Ab Fixativ für 20 Minuten bei RT </li><li> Wash fünf Mal für 5 Minuten in 1XPBSTw bei RT. </li><li> Inkubieren in Block-Lösung (1XPBS, 0,1% Triton x100, 10% Schafserum, 10% Rinderserumalbumin, 1% Dimethylsulfoxid) für 1-2 Stunden bei RT. </li><li> Verdünnen primären Antikörper (Anti-Fluorescein sowie Antikörper gegen Zelltyp spezifische Marker) in Blocking-Lösung. </li><li> Inkubieren Embryonen O / N bei 4 ° C in Lösung mit primären Antikörpern. </li><li> Wash viermal für 20 Minuten in 1XPhosphate Kochsalzlösung mit 0,1% Triton x100 (PBSTx) bei RT. </li><li> Verdünnen fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper (in der Regel 1:300) in Blocking-Lösung. </li><li> Inkubieren O / N bei 4 ° C in Lösung mit Sekundärantikörper. </li><li> Wash viermal für 20 Minuten in 1XPBSTx bei RT. </li><li> Klare Embryonen in 50% glycerol/50% 1XPBS für mindestens zwei Stunden bei RT, dann entfernen Glycerin / PBS-Mischung und 100% Glycerin und stehen lassen O / N bei 4 ° C. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Nach Immunomarkierung, sollte es eine angereicherte Bereich der Färbung in den Zellen, die uncaged (Figure.1) waren. Es ist nicht ungewöhnlich, dass ein relativ hohes Signal-Rausch-Verhältnis sehen in&gt; 48 Stunden alten Zebrafisch, durch spontane Uncaging der Fluorescein. <img src="/files/ftp_upload/2672/2672fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Lineage Kennzeichnung von Zebrafisch Zirbeldrüse komplex. Bei 24 HPF, einen Teil der vorderen Epiphyse anlage, durch foxd3 angegeben:. GFP-Expression, uncaged wurde mit UV-Laserpulsen A) Durch 48hpf, rief einer linksseitigen Zellklumpen die parapineal (roter Kreis) hat von der uncaged entstanden Domain (weißer Kreis). B) Uncaged Fluorescein-Signal wird in der parapineal (roter Kreis angereichert) und das Pinealorgan (weißer Kreis).

<ol><li>Hatada, Y., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fate+map+of+the+epiblast+of+the+early+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A fate map of the epiblast of the early chick embryo.</a> Development. 120, 2879-2889 (1994).</li>
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<li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+%28caged%29+fluorescein+as+a+cell+tracer+for+fate+mapping+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo.</a> Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).</li>
<li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li>
<li>Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orientation+of+first+cleavage+in+the+sea+urchin+embryo%2C+Lytechinus+variegatus%2C+does+not+specify+the+axes+of+bilateral+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry.</a> Dev Biol. 175, 177-183 (1996).</li>
</ol>

Wie beschrieben, stellt dieses Protokoll eine relativ schnelle Linie Kennzeichnung Methode in Zebrafisch, dass bei den üblicherweise verwendeten Techniken der Mikroinjektion, Mikroskopie und Immunfluoreszenz gebaut wird. Wir haben festgestellt, dass Laser auf die effizienteste und kostengünstigste Weg, um Fluorescein in einer lokalisierten Mode Uncage werden Uncaging. Diese Methode könnte auf Linie Etikett mit experimentellen Endpunkte werden so spät wie 4 dpf verwendet. Doch wie sich Zellen teilen, die caged-Fluorescei...

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Erratum: Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

<table><tbody><tr><td>CMNB-gefangener Fluorescein SE</td><td>Invitrogen</td><td>C20050</td><td></td></tr><tr><td>Aminodextran, 10 kDa</td><td>Invitrogen</td><td>D1860</td><td></td></tr><tr><td>Zeba-Desalz-Spin-Säulen</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>89889</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Fluorescein-Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>A11095</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 Esel-Anti-Ziege-Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>A21082</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen, 35 mm × 10 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Aufrechtes Compound-Mikroskop mit 40x-Wasserimmersionsobjektiv</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM6000B</td><td></td></tr><tr><td>Manuelles Laser-Belichtungssystem MicroPoint</td><td>Photonic Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenylthioharnstoff (PTU)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06690</td><td></td></tr><tr><td>Tricain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche Group</td><td>03115836991</td><td></td></tr><tr><td>Kunststofffaden</td><td>Jeder Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Savant SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Mixer</td><td>VWR international</td><td>Vortex Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>Druckinjektor</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr></tbody></table>

lineage kennzeichnung von zebrafisch-zellen mit laser uncagable fluorescein dextran

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Ein zentrales Problem in der Entwicklungsbiologie ist es, den Ursprung der unzähligen Zelltypen, die in Wirbeltieren wie sie sich aus undifferenzierten Vorstufen entstehen abzuleiten. Die Forscher haben verschiedene Methoden der Linie Kennzeichnung, wie DiI Markierung 1 und Druck Injektion nachvollziehbar Enzyme 2 bis festzustellen Zellschicksal in späteren Stadien der Entwicklung in Modellsystemen eingesetzt. Die ersten Schicksal Karten im Zebrafisch (Danio rerio) wurden von iontophoretischen Injektion von Fluoreszenzfarbstoffen, wie Rhodamin Dextran montiert, in einzelne Zellen in diskreten Regionen des Embryos und Tracing der markierten Zelle das Schicksal im Laufe der Zeit 3-5. Während wirksam sind diese Methoden technisch anspruchsvoll und erfordern eine spezielle Ausrüstung nicht allgemein in Zebrafisch-Forschungsgruppen gefunden. In jüngster Zeit sind photoconvertable fluoreszierende Proteine, wie Eos und Kaede, die irreversibel von grünen Schalter auf rote Fluoreszenz bei UV-Licht ausgesetzt, sehen verstärkten Einsatz im Zebrafisch 6-8. Die optische Klarheit der Zebrafisch-Embryos und die relative Leichtigkeit der Transgenese haben diese besonders attraktiv Werkzeuge für die Linie Etikettierung gemacht und die Migration von Zellen in vivo 7 zu beobachten. Trotz ihrer Nützlichkeit, haben diese Proteine ​​auch einige Nachteile auf Farbstoff-vermittelte Linie Kennzeichnung Methoden verglichen. Der wichtigste ist die Schwierigkeit, die wir bei der Beschaffung von hoher 3-D-Auflösung während Photokonversion dieser Proteine ​​gefunden haben. In diesem Licht, vielleicht die beste Kombination aus Auflösung und Benutzerfreundlichkeit für Linie Kennzeichnung im Zebrafisch nutzt Käfig Fluorescein Dextran, einem Fluoreszenzfarbstoff, die zu einer Löschung Gruppe gebunden ist, dass Masken seine Fluoreszenz 9. Der Farbstoff kann dann &quot;uncaged&quot; (veröffentlicht von der Löschung Gruppe) innerhalb einer bestimmten Zelle mit UV-Licht von einem Laser-oder Quecksilber-Lampe, so dass Visualisierung der Fluoreszenz-oder Immundetektion. Im Gegensatz zu iontophoretischen Methoden können caged Fluorescein mit Standard-Einspritzvorrichtungen injiziert werden und uncaged mit einem Epifluoreszenzmikroskop mit einer Lochkamera 10 ausgestattet. Darüber hinaus erkennen Antikörper gegen Fluorescein nur die uncaged Form, und das Epitop überlebt Fixierung gut 11. Schließlich kann im Käfig Fluorescein mit einer sehr hohen 3-D-Auflösung aktiviert werden, besonders dann, wenn der Zwei-Photonen-Mikroskopie 12,13 eingesetzt. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode der Linie Kennzeichnung von caged Fluorescein und Laser Uncaging. Subsequenctly ist uncaged Fluorescein gleichzeitig mit anderen Epitope wie GFP durch Markierung mit Antikörpern nachgewiesen.

Dieses Protokoll zeichnet ein Weg, um Etiketten und Spurenelemente das Schicksal der kleinen Gruppen von Zellen Zebrafischembryonen mit UV-Uncaging der Käfig Fluorescein, durch whole mount Immunomarkierung, um das Signal aus dem uncaged Fluoreszein verstärken gefolgt.

Lineage Kennzeichnung von Zebrafisch-Zellen mit Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Ein zentrales Problem der Entwicklungsbiologie besteht darin, den Ursprung der Vielzahl von Zelltypen in Wirbeltieren abzuleiten, die aus undifferenzierten ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Zellen in einem Zebrafischembryo linienzuverfolgen. Dies wird erreicht, indem zunächst fluoreszeinmarkierte Substanz hergestellt und in die Zebrafischembryonen injiziert wird. Anschließend werden die Embryonen in Agarose eingebettet, sodass die zu markierenden Zellen zugänglich sind.Anschließend wird ein UV-Laser verwendet, um den cagierten Fluorescein in ausgewählten Zellen des Embryos zu aktivieren. Schließlich werden die Embryos geerntet, nachdem sie das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht haben, und die markierten Zellen in Bezug auf Marker bestimmter Zelllinien detektiert. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die das Schicksal ausgewählter Zellen in den Embryos mittels Photo-Entkäfigung und immunfluoreszenzbasierter Mikroskopie aufzeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie der Photo-Umwandlung von Cade besteht darin, dass multicolor Immunfluoreszenz zusätzlich zu anderen zellspezifischen Antikörpern auch freigesetztes Fluorescein nachweisen kann. Um caged Fluorescein-Dextran in Zebrafischembryonen zu injizieren, synthetisieren Sie es zunächst und bereiten Sie eine 1 %igen (Gewicht pro Volumen) Lösung vor. Lagern Sie Aliquots gemäß des beigefügten schriftlichen Protokolls ein. Als Nächstes Verdünnungsaliquot, eins zu fünf oder eins zu 10 in 0,2 molarem Kaliumchlorid. Danach 0,5 bis ein Nanoliter der cagierten Fluoresceinlösung in das Eiweiß von Ein-Zell-Stadium-Embryonen injizieren. Mithilfe eines Druckinjektors injiziert, müssen Gelege von Embryonen nach der Injektion im Dunkeln bei 28,5 Grad Celsius gehalten werden, um eine unspezifische Freisetzung zum gewünschten Entwicklungsstadium zu minimieren.Entfernen Sie manuell die Chorion von den Embryonen, betäuben Sie die Embryonen in 4 % Trica, um die Embryonen zu fixieren. Erhitzen Sie 0,8 % geschmolzenes Agarose in einem Wärmeblock bei 50 Grad Celsius mindestens 15 Minuten lang. Kühlen Sie das Röhrchen danach etwa 30 Sekunden lang in der Hand. Ziehen Sie vor dem Hinzufügen der Embryonen mithilfe einer Glaspipette einen Embryo mit einer minimalen Menge Wasser auf und geben Sie ihn in die Agarose. Pipettieren Sie den Embryo aus dem Röhrchen zusammen mit etwa 50 Mikrolitern Agarose und geben Sie das Gemisch in die Mitte einer 35 Millimeter mal 10 Millimeter großen Petrischale ab.Einem Kunststoff-Faden verwendend, das Embryo schnell so ausrichten, dass die zu entsperrenden Zellen nach oben zeigen. Darauf warten, dass das Aros vollständig erstarrt und die Schale füllt. Zwei Drittel mit Ei-Wasser, das 4 % Trica und 0,003 % PTU enthält, auffüllen und die Embryonen bis zur Entsperrung in einer lichtdichten Box aufbewahren.Um die Laser-Entkäfigung von Fluorescein-Dextran durchzuführen, verwenden Sie ein Verbundmikroskop mit einer 40x-Wasserimmersions-Objektivlinse. Wir verwenden ein Photonics-Instruments-Lasergerät mit einer 365-Nanometer-Farbstoffzelle und einem 70%30%-Dichroikspiegel vor der Entkäfigung. Der Laser muss parfokal zur Objektivlinse eingestellt und auf die geeignete Leistung abgeschwächt werden, um den Laser zu fokussieren.Platzieren Sie einen verspiegelten Objektträger unter dem Objektiv und fokussieren Sie das Objektiv, bis Kratzer auf dem Objektträger sichtbar sind. Stellen Sie den Laserdämpfer so ein, dass der Laser mit einem einzelnen Puls einen deutlich sichtbaren Kratzer im Spiegel erzeugt, und justieren Sie den Fokus des Objektivs nach oben und unten. Wenn der Laser einen Kratzer erzeugen kann, während das Objektiv defokussiert ist, stellen Sie den Laserfokus um ein Viertel ein.Hoch- oder herunterregeln. Wiederholen, bis der Laser den Spiegel ritzen kann. Erst wenn das Objektiv fokussiert ist, das befestigte Embryo unter das Objektiv bringen und auf den Bereich fokussieren, der entsperrt werden soll, um zu entsperren.Konzentrieren Sie sich auf eine Zelle von Interesse und stimulieren Sie sie 10 bis 20 Mal mit zwei bis drei Hertz. Nach der Freisetzung. Befreien Sie das Embryo, indem Sie die Aeros mit einer Pinzette ablösen, und legen Sie sie in Ei-Wasser, das 0,003 % PTU enthält. Fixieren Sie die Embryonen in Antikörperfixansatz zwei bis vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie das Fixativ und ersetzen Sie es durch 100 % Methanol. Inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend entfernen Sie das Methanol und ersetzen es durch frisches 100 % Methanol.Die Embryonen für mindestens 30 Minuten bei minus 20 Grad Celsius in Methanol lagern. Eine Lagerung in Methanol ist bis zu zwei Wochen möglich, bevor Epitope zu degradieren beginnen. Die Embryonen mit fünfminütigen Waschschritten bei Raumtemperatur mit 75 % Methanol, 25 % one x Phosphat-gepufferter Salzlösung mit 0,1 % Tween 20, danach 50 % Methanol, 50 % one x PBS Tween 20 und anschließend 25 % Methanol, 75 % one x PBS Tween 20 rehydrieren, dann dreimal fünf Minuten in one x PBS Tween 20 waschen.Wenn die Embryonen älter als 24 Stunden sind, permeabilisieren Sie sie mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Proteinase K in 1× PBS mit Tween 20. Die Permeabilisierungszeit hängt vom Entwicklungsstadium der Embryonen ab. Fünf Minuten in Proteinase K sind ausreichend.Wenn sich die Embryonen zwischen 24 und 48 Stunden nach der Befruchtung befinden, kann für ältere Larven mehr Zeit erforderlich sein. Erneut mit einem Antikörperfixansatz für 20 Minuten bei Raumtemperatur fixieren. Die Embryonen fünfmal je fünf Minuten in 1× PBS-Tween 20 bei Raumtemperatur waschen.Anschließend eine bis zwei Stunden bei Raumtemperatur in Blockierungslösung inkubieren. Primäre Antikörper in der Blockierungslösung verdünnen. Danach die Embryonen über Nacht bei vier Grad Celsius in einer Lösung mit den primären Antikörpern inkubieren und am nächsten Morgen die Embryonen viermal in 1× PBS mit Triton X-100 waschen, sekundäre Antikörper mit Fluoreszenzfarbstoff in der Blockierungslösung verdünnen.Die Embryonen über Nacht bei vier Grad Celsius in einer Lösung mit sekundären Antikörpern inkubieren. Nach viermaligem Waschen in 1x PBS mit Triton X-100 die Embryonen in 50 % Glycerin und 50 % 1x PBS mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur klären. Anschließend die Glycerin-PBS-Mischung entfernen und 100 % Glycerin zugeben, über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.Dargestellte Ergebnisse für Kontroll- und durch Licht freigesetzte Larven werden in Form von konfokalen Projektionen gezeigt. Kontrollembryonen wurden mit verkapseltem Fluorescein injiziert, aber 48 Stunden nach der Befruchtung keiner Lichtfreisetzung unterzogen. Der Kontrollembryo zeigt eine GFP-Markierung im Epiphysekomplex.Einige punktf&ouml;rmige Hintergrundanf&auml;rbung, jedoch keine lokalisierte Anreicherung von markiertem Fluorescein nachweisbar. Bei photo-entk&auml;figten Embryonen ist eine klare Anreicherung von entk&auml;figtem Fluorescein in einigen der GFP-markierten Zellen zu beobachten. Dies sind die Nachkommen der Zellen, die 24 Stunden zuvor durch die Photoentk&auml;figung gezielt behandelt wurden, mit geringf&uuml;gigen Modifikationen.Dieses Verfahren kann verwendet werden, um nahezu jedes Gewebe im Zebrafischembryo vor 48 Stunden nach der Befruchtung linienstammbezogen zu markieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt Abbildung von einzelnen Neuronen oder Neuralleistenzellen in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode wird verwendet, um zelluläre Verhaltensweisen und Aktin-Lokalisierung mittels Fluoreszenz konfokalen Zeitraffer-Mikroskopie zu untersuchen.

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

Schlüssel zum Verständnis der morphogenetischen Prozesse, die der frühe Embryo Form ist die Möglichkeit, Bild-Zellen in hoher Auflösung. Wir beschreiben hier eine Methode zur Kennzeichnung einzelner Zellen oder kleine Gruppen von Zellen in ganzen Zebrafisch-Embryos mit Membran-bezogene Green Fluorescent Protein.

Labeling und Imaging Cells in der Zebrafisch Hinterhirn

Sterbenden Zellen werden extrudiert aus epithelialen Geweben durch konzertierte Kontraktion der benachbarten Zellen ohne Unterbrechung Barrierefunktion. Die optische Klarheit zu entwickeln Zebrafisch bietet ein hervorragendes System der Extrusion in lebenden Epithelien zu visualisieren. Hier beschreiben wir Methoden zu induzieren und Bild Extrusion in der Larven Zebrafisch Epidermis auf zellulärer Auflösung.

Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Eine Methode ist beschrieben, um einzelne Zellen mit einem Käfig fluoreszierenden Proteins mit Zwei-Photonen-Absorption aus einer Ti photoaktivieren: Sapphire Femtosekunden-Laser-Oszillator. Um das Schicksal der Karte photoaktivierte Zelle, ist die Immunhistochemie verwendet. Diese Technik kann auf jeden Zelltyp angewendet werden.

Single Cell Fate Mapping im Zebrafisch

Function-Spacer-Lipid (FSL) Konstrukte erlauben die Oberflächeneigenschaften von lebenden Zellen und Virionen ohne Verlust der Vitalität geändert werden. Die Methode erfordert nur einfache Berührung eines FSL konstruieren Lösung mit einer Zelle / Virion und spontan und stabile Oberfläche Einarbeitung erfolgt.

FSL Konstrukte: Eine einfache Methode für das Ändern von Cell / Virion Oberflächen mit einer Reihe von biologischen Markern, ohne die Durchführung

Die Entwicklung von Zebrafisch kann über Tage mit Licht-Mikroskopie Blatt, wenn Embryonen werden in optisch klare Polymerrohren mit niedriger Konzentration Agarose eingebettet folgen.

Multilayer-Halterung für Langzeit-Licht-Mikroskopie Blatt der Zebrafisch

Die Abbildung des dynamischen Verhaltens von Organellen und anderen subzellulären Strukturen in vivo kann Aufschluss über ihre Funktion unter physiologischen und Krankheitsbedingungen geben. Hier stellen wir Methoden vor, mit denen zwei Organellen, Zentrosomen und Mitochondrien, genetisch markiert und ihre Dynamik in lebenden Zebrafischembryonen mittels Weitfeld- und Konfokalmikroskopie abgebildet werden können.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

Gezielte Manipulationen, um gezielten Stress oder Tod in einzelnen Zellen zu verursachen, waren relativ schwierig zu bewerkstelligen. Hier wird ein Ablationsansatz mit Einzelzellauflösung beschrieben, um einzelne Zellen in Zellkulturen und lebenden Tieren selektiv zu stressen und abzutöten, basierend auf einem konfokalen Standard-UV-Laser.

Das Auslösen Zellstress und Tod unter Verwendung von herkömmlichen UV-Laser konfokale Mikroskopie

Zilien Entwicklung ist wichtig, richtige Organogenese. Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zum Beschriften und ciliated Zellen der Zebrafisch zu visualisieren.

Visualisierung von Multiciliated Zellen in der Zebrabärbling durch ein kombiniertes Protokoll der ganze Berg Leuchtstofflampen In Situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz

Laserablation ist eine weit verbreitete Technologie zur Untersuchung der Regeneration in biologischen Systemen. Das vorgestellte Protokoll beschreibt den Einsatz eines Standard-Laserscanning-Konfokalmikroskops zur Laserablation und anschließender Zeitraffer-Bildgebung regenerierender Interneuromastzellen in der Zebrafisch-Seitenlinie.

Konfokale Mikroskop-basierte Laserablation und Regenerationstest in Zebrafisch Interneuromastzellen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Markierung von Proteinen mit einem Fluoreszenzprotein-Tag in Zebrafischlarven vor, ein neu entwickeltes und modifiziertes in vivo-System , das besonders nützlich für die Visualisierung von Proteinen mit geringer Abundanz im Zebrafisch ist.

Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

Erfahren Sie die Linienmarkierung von Zellen in Zebrafisch-Embryonen mittels UV-Laser-Aktivierung von caged Fluorescein. Diese Methode ermöglicht die Verfolgung von Zellschicksalen durch Immunfluoreszenzmikroskopie.

Lineage Kennzeichnung von Zebrafisch-Zellen mit Laser Uncagable Fluorescein Dextran

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