Name: Solide Plate-basierte diätetische Einschränkung in Caenorhabditis elegans /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Lernen Sie die plate-basierte diätetische Einschränkung in Caenorhabditis elegans mit abgetöteten Bakterien. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Lebensdauer, Fortpflanzung und Stoffwechsel.

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Diese Arbeit wurde von einem Piloten Auszeichnung des Nathan Shock Center (P30 AG13283) und R01 zu gewähren (R01 AG028516) aus dem National Institute on Aging (NIA) auf A.-LH unterstützt

1. Herstellen einer Eichkurve für die Bestimmung von Bakterien-Konzentrationen Dieser Abschnitt beschreibt eine Methode zur Abschätzung der Bakterien-Konzentration für einen bestimmten Bakterienstamm (zB OP50, HT115), die als Nahrungsquelle für Diätetische Einschränkung Experimente in C verwendet werden elegans. Separate Kalibrierkurven sollten für jeden Bakterienstamm verwendet eingerichtet werden. <ol><li> Impfen einer einzelnen Kolonie von E. coli OP50 Bakterien aufgenommen von einem frischen Streifen von Bakterien auf LB-Agar in 3 ml flüssiges LB-Brühe. </li><li> Legen Sie OP50 Kultur in 37 ° C Schüttler und lassen Bakterien wachsen über Nacht. </li><li> Bereiten Sie serielle 2-fache Verdünnungen der Bakteriensuspension aus der Übernacht-Kultur (2x, 4x, 8x, 16x, 32x). </li><li> Die Extinktion (optische Dichte) von jeder Verdünnung bei 600 nm mittels Spektralphotometer in dreifacher Ausfertigung. </li><li> Weitere verdünnen jeder Bakteriensuspension 1.000.000-fache (1000-facher Verdünnung zweimal). </li><li> Verbreiten Sie 0,4 ml Bakteriensuspension jeder Verdünnung gleichmäßig auf einem 100 mm LB-Agar-Platte. </li><li> Legen LB-Platten mit OP50 in einem 37 ° C Inkubator für 18-24 Stunden. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der Bakterienkolonien auf jeder Platte gewachsen. Die Kolonie zählt werden verwendet, um KBE (Kolonie bildende Einheit) pro ml für jede Probe berechnet werden. </li><li> Die Beziehung zwischen der gemessenen OD 600 Werte und OP50 Bakterien-Konzentrationen können durch Auftragen von OD 600 als Funktion der Konzentration der Bakterien (KBE / ml) und eine lineare Regressionsanalyse (Abbildung 1) festgestellt werden. </li></ol> Solutions: <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Luria Broth (LB), 1L: </td></tr><tr><td> 10 g </td><td> Bacto-Trypton </td></tr><tr><td> 5 g </td><td> Hefeextrakt </td></tr><tr><td> 10 g </td><td> NaCl </td></tr></tbody></table> Add entionisiertem Wasser auf 1L. Autoklaven und bei Raumtemperatur lagern. 2. Herstellung von festen Platte für die Ernährung Einschränkung (SDR)-Platten Dieser Abschnitt beschreibt die Herstellung von Platten für den Einsatz in der Fest-Platte für die Ernährung Einschränkung (SDR) Experimente. Normalerweise betrachten wir eine Bakterien-Konzentration von 1 x 10 11 KBE / mL als ad libitum-Fütterung Zustand und 1 x 10 8 KBE / ml als optimal DR Fütterung Voraussetzung für diese Methode. Allerdings können 4-6 verschiedene Bakterien-Konzentrationen benötigt, um eine vollständige Dosis-abhängige Beziehung zum SDR und ihre Antworten zu etablieren. <ol><li> Impfen einer einzelnen Kolonie von E. Coli Bakterien OP50 in 3 ml flüssiges LB-Brühe. </li><li> Setzen Sie den OP50 Kultur in 37 ° C Schüttler und ermöglichen die Bakterien für 6-8 Stunden wachsen. </li><li> Übertragen Sie die OP50 Kultur zu einer neuen Kolben mit 500 mL LB-Bouillon, und platzieren Sie den OP50 Kultur wieder in 37 ° C Schüttler über Nacht. </li><li> Messen Sie die OD 600 der OP50 Kultur, um die Bakterien-Konzentration (die Konzentration wird anhand der Kalibrierkurve in Teil 1 erzeugt) zu bestimmen. Geeignete Verdünnungen können für eine genaue Messung der Absorption erforderlich sein. </li><li> Pellet OP50 Bakterien durch Zentrifugation bei 1.500 g für 20 Minuten. </li><li> Resuspendieren Bakterien zu einer Konzentration von 1 x 10 12 KBE / mL. </li><li> Bereiten Sie 10 mL Bakterienkultur in sechs verschiedenen Konzentrationen: 1 x 10 12, 10 11, 10 10, 10 9, 10 8, 10 7 cfu / mL. </li><li> Pipette 0,2 ml Bakterienkultur in der Mitte eines 60 mm verfestigt NGM Platte. Berühren Sie die Oberfläche der Platte mit Pipettenspitze, wie Kerben auf der Oberfläche erlauben Würmer bohren sich in die Agarplatten. </li><li> Legen Platten in 37 ° C Inkubator für 1 Stunde. </li><li> Übernehmen 10 &amp;mgr; l von 100mg/ml Carbenicillin und 10 ul 50mg/ml Kanamycin zu jeder Platte das Wachstum der Bakterien zu verhaften. </li><li> Shop-Platten mit unterschiedlichen Konzentrationen von Antibiotika-abgetöteten Bakterien bei 4 ° C für den zukünftigen Gebrauch (bis zu 1 Monat). Es ist wichtig für die Vorbereitung und speichern genug Platten für die gesamte geplante Experiment mindestens 1-2 Tage im Voraus. Mit der gleichen Charge von Platten für die gesamte Experimenten vorzuziehen ist. </li><li> Um zu überprüfen, die Lebensfähigkeit der Bakterien, kratzen einige Bakterien aus der SDR-Platten und breitete sie auf einem leeren NGM-Platte mit Carbenicillin und Kanamycin. Die Platte wird in 37 ° C Inkubator für 6-8 Stunden und dann für das Wachstum der Bakterien (kein Wachstum von Bakterien zu beachten) zu überprüfen. </li></ol> Lösungen <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Nematode Growth Media (NGM), 1L: </td></tr><tr><td> 3 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 2,5 g </td><td> Bacto-Pepton </td></tr><tr><td> 20g </td><td> Agar </td></tr></tbody></table>ove_content "&gt; Autoklaven für 40 Minuten abkühlen lassen und auf 65 ° C, dann hinzuzufügen: <table border="1"><tbody><tr><td> 1 mL </td><td> 1 M MgSO 4 </td></tr><tr><td> 1 mL </td><td> 1 M CaCl 2 </td></tr><tr><td> 1 mL </td><td> 5 mg / ml Cholesterin </td></tr><tr><td> 25 mL </td><td> 1 M Kaliumphosphat, pH 6,0 </td></tr></tbody></table> Unmittelbar pour Flüssigkeit NGM auf 60 mm x 15 mm Petrischalen in 10 ml Aliquots 3. Einrichten SDR Experimente Für die meisten der SDR-Fächer, wie z. B. Lebensdauer Analyse und Fruchtbarkeit Profiling, Erstellung eines Alters-synchronisierte Bevölkerung von Würmern ist unerlässlich. Für andere Studien, einfach übertragen Würmer aus einer regelmäßigen OP50 Platte ein SDR Platte auf die diätetische Einschränkung zu initiieren. In diesem Abschnitt ist ein Protokoll zur Einrichtung einer Lebensdauer-Analyse für SDR Tiere als Beispiel beschrieben. <ol><li> Verwenden Sie ein Platin-Wurm-Picker auf 20-30 reproduktiv aktiven Erwachsenen auf mehrere regelmäßige NGM-Platten mit OP50 zu übertragen. Abhängig von der Anzahl der Eier für die Experimente benötigt wird, kann mehr Erwachsene benötigt werden. </li><li> Verlassen Sie die Platten bei 20 ° C für 4 Stunden, damit der Eiablage. </li><li> Entfernen Sie die Erwachsenen von der Platte. Die Platten sollten visuell auf Eier überprüft werden. </li><li> Verlassen Sie die Platten bei 20 ° C und ermöglichen die Nachkommen in die Late-L4/day 1 Erwachsener Bühne zu entwickeln. Normalerweise dauert dies 3 Tage N2 wilden Arten Würmer bei 20 ° C. </li><li> Übertragen einer geeigneten Anzahl von Tag 1 Erwachsenen auf SDR Platte auf die diätetische Einschränkung zu initiieren. </li><li> Für eine Lebensdauer-Analyse, die Einrichtung eines insgesamt von 6-8 Platten mit 10-20 Würmer pro Platte für jeden SDR Zustand. </li><li> Ergebnis der Lebensfähigkeit eines jeden Wurms alle 2 Tage, bis alle Würmer gestorben. Es ist wichtig, dass Würmer an die frische SDR-Platten übertragen werden jedes 12-48 Stunden in Anspruch Entzug von Nahrung zu vermeiden. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: In Abbildung 1 ist ein Diagramm einer repräsentativen Eichkurve für die Schätzung der OP50-Konzentration in Bezug auf OD 600. Die Gleichung von Liner Regressionsanalyse erzeugt wird, kann für alle zukünftigen Berechnungen der OP50 Bakterien Konzentrationen eingesetzt werden. In Abbildung 2 ist ein Beispiel zur Untersuchung der Wirkung von chronischen SDR-Behandlungen auf die mittlere Lebensdauer der verschiedenen Stämme Wurm. Die blaue Linie stellt eine normale Dosis-abhängige Reaktion von Wildtyp-Würmer SDR. Die rote Linie zeigt an, dass die Lebensdauer Wirkung von SDR teilweise von DRR-2 oe unterdrückt, während daf-16 (mu86) hat keine Auswirkung auf SDR-induzierte Laufzeitverlängerung. Detail-Methode für die Durchführung von Lebensdauer-Analyse in C. elegans ist in der bisherigen Literatur 1-3 beschrieben. <img src="/files/ftp_upload/2701/2701fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Repräsentatives Ergebnis einer Eichkurve für die Abschätzung der E. Coli OP50 Konzentration. OP50-Konzentration als Funktion der gemessenen OD 600-Werte aufgetragen. Fehlerbalken = SD Übernachtung Bakterienkultur wurde 1.5x, 2x, 4x, 8x, 16x, 32x, bevor Extinktionsmessung verdünnt und weiter verdünnt 1.000 x zweimal, bevor cfu Messung. <img src="/files/ftp_upload/2701/2701fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Repräsentatives Ergebnis einer C. elegans Lebensdauer Experiment verglichen Wildtyp N2 Tiere (blau) mit zwei verschiedenen Mutanten (grün und rot) in Reaktion auf SDR (Abbildung von Ching et al. 4). Fehlerbalken = SEM

<ol><li>Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aging+and+age-related+disease+by+DAF-16+and+heat-shock+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor.</a> Science. 300, 1142-1145 (2003).</li>
<li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li>
<li>Apfeld, J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lifespan+by+sensory+perception+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of lifespan by sensory perception in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 402, 804-809 (1999).</li>
<li>Ching, T. T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((drr-2+encodes+an+eIF4H+that+acts+downstream+of+TOR+in+diet-restriction-induced+longevity+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">drr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans.</a> Aging Cell. 9, 545-557 (2010).</li>
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<li>Masoro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subfield+history%3A+caloric+restriction%2C+slowing+aging%2C+and+extending+life%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Aging+Knowledge+Environ%22%5BJournal%5D)">Subfield history: caloric restriction, slowing aging, and extending life.</a> Sci Aging Knowledge Environ. , RE2-RE2 (2003).</li>
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<li>Houthoofd, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+reduction+of+metabolic+rate+in+food+restricted+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">No reduction of metabolic rate in food restricted Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 37, 1359-1369 (2002).</li>
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<li>Bishop, N. A., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+neurons+mediate+diet-restriction-induced+longevity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Two neurons mediate diet-restriction-induced longevity in C. elegans.</a> Nature. 447, 545-549 (2007).</li>
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<li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+caloric+restriction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13091-13096 (1998).</li>
<li>Kaeberlein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans+by+complete+removal+of+food%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food.</a> Aging Cell. 5, 487-494 (2006).</li>
<li>Greer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+AMPK-FOXO+pathway+mediates+longevity+induced+by+a+novel+method+of+dietary+restriction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in C. elegans.</a> Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).</li>
</ol>

Diätetische Einschränkung (DR) ist bekannt, dass Lebensdauer zu erhöhen und das Einsetzen der verschiedenen altersbedingten Erkrankungen in einer Vielzahl von Arten, darunter Säugetiere 5-7. Sowohl Umwelt-und genetischen Manipulationen zu Modell DR in C eingesetzt elegans, einschließlich Kultivierung Würmer in einem semi-definierten flüssigen Medium 8,9, Verdünnung der bakteriellen Nahrungsquelle in einem flüssigen Medium 10-12, und die Verwendung von Verhaltens-Mutante...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Carbenicillin </td><td> Duchefa Biochemie </td><td> C0109.25 </td><td> In Wasser gelöst. </td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td> Roche </td><td> 10106801001 </td><td> In Wasser gelöst. </td></tr><tr><td> Bacto-Pepton </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> DF0118072 </td><td></td></tr><tr><td> Bacto-Trypton </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> DF0123075 </td><td></td></tr><tr><td> Bacto-Hefeextrakt </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> DF0127071 </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> DF00145170 </td><td></td></tr><tr><td> Sterile Kulturröhrchen </td><td> USA Scientific </td><td> 1485-0810 </td><td></td></tr><tr><td> Spektrophotometer </td><td> Amersham Biosciences </td><td> Gene Quant pro </td><td> Amersham ist jetzt Teil von GE Healthcare. </td></tr><tr><td> Präpariermikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Stemi 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Zentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> Accuspin FR </td><td></td></tr></tbody></table>

solide plate-basierte diätetische einschränkung in caenorhabditis elegans</em

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduktion der Nahrungsaufnahme, ohne Unterernährung oder Hunger ist bekannt, dass Lebensdauer zu erhöhen und das Einsetzen der verschiedenen altersbedingten Erkrankungen in einer Vielzahl von Arten, darunter Säugetiere. Es führt auch zu einer Abnahme des Körpergewichts und der Fruchtbarkeit sowie niedrigere Plasma-Glukose, Insulin und IGF-1 in dieser Tiere. Diese Behandlung wird oft als diätetische Einschränkung (DR) oder kalorische Restriktion (CR) bezeichnet. Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans wurde als ein wichtiger Modellorganismus für die Erforschung der Biologie des Alterns entwickelt. Sowohl Umwelt-und genetischen Manipulationen zu Modell DR verwendet worden und haben gezeigt, dass Lebensdauer in C verlängern elegans. Allerdings sind viele der gemeldeten DR Studien in C. elegans wurden durch die Weitergabe von Tieren in flüssigen Medien, während die meisten genetischen Studien in der alternden Feld auf der Standard-festem Agar in Petrischalen durchgeführt wurden durchgeführt. Hier präsentieren wir Ihnen eine DR-Protokoll unter Verwendung von Standard solide NGM-Agar-Basis-Platte mit abgetöteten Bakterien.

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Durchführung von festen Platte für die Ernährung Einschränkung in<em&gt; C. elegans</em&gt; Mit abgetöteten Bakterien.

Solide Plate-basierte diätetische Einschränkung in Caenorhabditis elegans</em

Es ist bekannt, dass die Reduzierung der Nahrungsaufnahme ohne Mangelernährung oder Verhungern die Lebensspanne verlängert und das Auftreten verschiedener altersbedingter Erkrankungen in einem weiten ...

Das Verfahren führt eine Nahrungseinschränkung auf dem standardmäßigen Agarplatte in Sea Elegance durch, um deren Auswirkungen auf Langlebigkeit, Fortpflanzung und Stoffwechsel zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Konzentration der Bakterien, die als Nahrungsquelle verwendet werden, genau gemessen wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Bakterienkultur korrekt auf geeignete Konzentrationen zu verdünnen.Dann bereiten Sie SDR-Platten mit abgetöteten Bakterien vor. Richten Sie abschließend SDR-Experimente mit einer alterssynchronisierten Population von Würmern ein. Die Ergebnisse von Nachkommenschaftsproduktion und Lebensdauermessungen können eine verzögerte und verminderte Nachkommenschaftsproduktion sowie eine verlängerte mittlere Lebensdauer zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber 60 Methoden wie Dian in AZA-Medium besteht darin, dass das gesamte Experiment auf einem standardmäßigen festen AGA-basierten Medium durchgeführt wird, das von den meisten Wärme-Laboren für Diätrestriktionsversuche verwendet wird. Erstellen Sie separate Kalibrierkurven für jeden Bakterienstamm, der als Nahrungsquelle eingesetzt wird. Entnehmen Sie eine einzelne Kolonie des Bakteriums E. coli OP50 von einer frischen Strichplatte auf LB-Agar und impfen Sie drei Milliliter flüssige LB-Brühe in einem 37-Grad-Celsius-Schüttler über Nacht an. Bereiten Sie serielle Verdünnungen im Verhältnis 1:2 der Übernachtkultur vor. Danach die Extinktion jeder Verdünnung bei 600 Nanometern mittels Spektrophotometer im Dreifachansatz messen. Weitere Verdünnung jeder Bakteriensuspension um den Faktor 1 Million; jeweils 0,4 Milliliter der Bakteriensuspension jeder Verdünnung gleichmäßig auf einer 100 Millimeter LB-Agarplatte ausplattieren und 18 bis 24 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Anzahl der auf jeder Platte gewachsenen Bakterienkolonien zählen, um die Anzahl an koloniebildenden Einheiten pro Milliliter für jede Probe zu berechnen.Tragen Sie nun den OD 600 als Funktion der bakteriellen Konzentration auf und führen Sie eine lineare Regressionsanalyse durch, um den Zusammenhang zwischen den gemessenen OD-600-Werten und den OP-50-Bakterienkonzentrationen zu ermitteln. Für diese Methode wird eine Bakterienkonzentration von 1 × 10¹¹ KBE pro Milliliter unter ad libitum-Fütterungsbedingungen und 1 × 10⁸ KBE pro Milliliter als optimale DR-Fütterungsbedingung verwendet. Es können jedoch vier bis sechs verschiedene Bakterienkonzentrationen erforderlich sein, um einen vollständigen dosisabhängigen Zusammenhang zu etablieren.Für SDR und deren Reaktionen. Bereiten Sie ein Inokulum mit einer einzelnen Kolonie von E. coli OP50-Bakterien in drei Millilitern flüssigem LB-Brühe vor, das bei 37 Grad Celsius im Schüttelinkubator sechs bis acht Stunden lang kultiviert wird. Überführen Sie die OP50-Kultur in einen neuen Kolben, der 500 Milliliter LB-Brühe enthält, und züchten Sie sie über Nacht, falls erforderlich, bis die Bakterien die Sättigung erreicht haben.Stellen Sie eine geeignete Verdünnung der OP 50-Kultur zur Messung der Absorption bei OD 600 her. Um die Bakterienkonzentration zu bestimmen, pelletieren Sie die Bakterien durch Zentrifugation bei 1500 Gs für 20 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Bakterien in einer Konzentration von einem Mal 10 hoch 12 KBE pro Milliliter.Bereiten Sie nun 10 Milliliter Bakterienkulturen in sechs verschiedenen Konzentrationen vor, die von 1 × 10¹² bis 1 × 10⁷ KBE pro Milliliter reichen. Pipettieren Sie 0,2 Milliliter Bakterienkultur in die Mitte einer 60 Millimeter großen, festen N-GM-Platte. Vermeiden Sie es, mit der Pipettenspitze die Oberfläche der Platte zu berühren, da Kratzer auf der Oberfläche es Würmern ermöglichen, in die Belüftungsschicht einzudringen.Stellen Sie die Platten eine Stunde lang in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator. Geben Sie anschließend auf jede Platte jeweils 10 Mikroliter einer 100 Milligramm pro Milliliter Carbonic-Sojin-Lösung und 10 Mikroliter einer 50 Milligramm pro Milliliter Canmycin-Lösung, um das Bakterienwachstum zu hemmen. Lagern Sie die Platten mit unterschiedlichen Konzentrationen an antibiotikabehandelten Bakterien bei vier Grad Celsius für zukünftige Verwendung bis zu einem Monat.Es ist wichtig, ausreichend Platten vorzubereiten und aufzubewahren, vorzugsweise aus derselben Charge für die gesamte Pflanze. Führen Sie das Experiment mindestens ein bis zwei Tage im Voraus durch, um die Lebensfähigkeit der Bakterien zu überprüfen. Entnehmen Sie etwas Bakterienmaterial von den SDR-Platten und streichen Sie es auf eine leere N-GM-Platte mit Kohlensäure, Sein und Antimycin. Stellen Sie die Platte sechs bis acht Stunden lang in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator und überprüfen Sie das Fehlen von bakteriellem Wachstum. Für die meisten SDR-bezogenen Studien, wie beispielsweise die Analyse der Lebensdauer und die Profilierung der Nachkommenproduktion, ist die Herstellung einer alterssynchronisierten Population von Würmern unerlässlich. Übertragen Sie mithilfe eines Platin-Wurm-Pickers 20 bis 30 reproduktiv aktive adulte Tiere auf mehrere gewöhnliche NGM-Platten.Bei OP 50. Abhängig von der Anzahl der für die Experimente benötigten Eier können mehr erwachsene Tiere erforderlich sein. Belassen Sie die Platten vier Stunden lang bei 20 Grad Celsius, um die Eiablage zu ermöglichen.Entfernen Sie die erwachsenen Tiere von der Platte und untersuchen Sie die Platten visuell auf Eier. Inkubieren Sie die Platten weiterhin bei 20 Grad Celsius, damit die Nachkommen sich bis zum späten L4-Stadium oder Ein-Tages-erwachsenen-Stadium entwickeln können. Normalerweise dauert dies drei Tage für N2-Wildtyp-Würmer bei 20 Grad Celsius.Für die Lebensdaueranalyse. Überführen Sie 10 bis 12 ein Tage alte erwachsene Würmer auf eine SDR-Platte, um die diätetische Restriktion zu beginnen. Um eine ausreichende statistische Aussagekraft zu erzielen, verwenden Sie insgesamt 60 bis 100 Würmer pro SDR-Bedingung.Bewerten Sie die Lebensfähigkeit jedes Wurms alle zwei bis drei Tage, bis alle Würmer verstorben sind. Wichtig: Überführen Sie die Würmer jeden zweiten Tag auf frische SDR-Platten, um Verhungern zu vermeiden. Diese Kalibrationskurve zeigt die OP50-Konzentration in Abhängigkeit von OD 600.Die durch die lineare Regressionsanalyse erhaltene Gleichung kann für alle zukünftigen Berechnungen der OP 50-Bakterienkonzentrationen verwendet werden. Diese Studie untersucht den Effekt chronischer SDR-Behandlungen auf die mittlere Lebensdauer verschiedener Wurmsorten im Vergleich zu einer normalen dosisabhängigen Reaktion von Wildtyp-Würmern auf SDR. Der Einfluss von SDR auf die Lebensdauer wird durch die Überexpression von DR zwei teilweise unterdrückt, während die DAF 16 MU 86-Mutation keinen Einfluss auf die von SDR induzierte Lebensverlängerung hat.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Dian auf dem Standard-AGA-basierten Spiel in Sea Elegance durchführt.

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Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

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Der genetisch traktierbare Fadenwurm Caenorhabditis elegans kann als einfaches und kostengünstiges Modell für die Wirkstoffforschung verwendet werden. Hier wird ein Protokoll zur Identifizierung von Krebsmedikamenten beschrieben, die die nachgeschaltete Signalübertragung von RAS- und EGFR-Proteinen hemmen.

Identifizierung von EGFR- und RAS-Inhibitoren mittels Caenorhabditis elegans

Das folgende Protokoll beschreibt die Entwicklung und Optimierung eines Hochdurchsatz-Workflows für die Wurmkultivierung, Fluoreszenzbildgebung und automatisierte Bildverarbeitung zur Quantifizierung von Polyglutaminaggregaten als Bewertung von Veränderungen der Proteostase.

Automatisierung der Aggregatquantifizierung bei Caenorhabditis elegans

Dies ist eine häufig verwendete Methode für die C.  elegans-Gonadendissektion, gefolgt von Freeze Crack, bei der Keimbahnproben für die Immunfluoreszenz durch Antikörperfärbung oder für die einfache DAPI-Färbung zur Visualisierung von DNA hergestellt werden. Dieses Protokoll war erfolgreich für Studenten in einem Forschungslabor und in einer kursbasierten Bachelor-Forschungserfahrung.

C. elegans Gonadendissektion und Gefrierriss für Immunfluoreszenz und DAPI-Färbung

Dieses Protokoll beschreibt einen Assay zur Quantifizierung der Fütterungsrate von Caenorhabditis elegans , der auf der Messung der Clearance von Bakterien in Flüssigkulturen basiert.

Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Lernen Sie die plate-basierte diätetische Einschränkung in Caenorhabditis elegans mit abgetöteten Bakterien. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Lebensdauer, Fortpflanzung und Stoffwechsel.

Solide Plate-basierte diätetische Einschränkung in Caenorhabditis elegans

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