Solide Plate-basierte diätetische Einschränkung in Caenorhabditis elegans

Das Verfahren führt eine diätetische Restriktion auf der Standardplatte in Sea Elegance durch, um ihre Wirkung auf Langlebigkeit, Fortpflanzung und Stoffwechsel zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Konzentration der Bakterien, die als Nahrungsquelle verwendet werden, genau gemessen wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Bakterienkultur richtig auf geeignete Konzentrationen zu verdünnen.

Bereiten Sie dann abgenutzte SDR-Platten mit abgetöteten Bakterien vor. Richten Sie schließlich SDR-Experimente mit einer alterssynchronisierten Population von Würmern ein. Die Ergebnisse der Nachkommenproduktion und der Lebensdauermessungen können eine verzögerte und verminderte Nachkommenproduktion sowie eine erhöhte mittlere Lebensdauer zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber 60 Methoden wie Dian im AZA-Medium besteht darin, dass alle Experimente auf einem standardmäßigen festen AGA-basierten Spiel durchgeführt werden, das von den meisten warmen Laboratorien verwendet wird. Für Experimente zur diätetischen Restriktion und sehen Sie Eleganz, erstellen Sie separate Kalibrierungskurven für jeden Bakterienstamm, der als Nahrungsquelle verwendet wird. Pflücken Sie eine einzelne Kolonie von e coli OP 50 Bakterien aus einem frischen Streifen auf lb Agar und impfen Sie über Nacht drei Milliliter flüssige lb Bouillonkultur in einem 37 Grad Celsius heißen Shaker. Bereiten Sie die serielle zweifache Verdünnung der Übernachtkultur vor.

Messen Sie dann die Absorption jeder Verdünnung bei 600 Nanometern mit einem Spektralphotometer in dreifacher Ausfertigung. Des Weiteren wird in jeder Bakteriensuspension 1 Million Mal gleichmäßig 0,4 Milliliter Bakteriensuspension jeder Verdünnung auf eine 100 Millimeter lb schwere Agri-Platte ausgesät und bei 37 Grad Celsius für 18 bis 24 Stunden inkubiert. Zählen Sie die Anzahl der auf jeder Platte gewachsenen Bakterienkolonien, um die koloniebildenden Einheiten pro Milliliter für jede Probe zu berechnen.

Stellen Sie nun OD 600 als Funktion der Bakterienkonzentration dar und führen Sie eine lineare Regressionsanalyse durch, um die Beziehung zwischen den gemessenen OD 600-Werten und den OP 50-Bakterienkonzentrationen zu ermitteln. Für dieses Verfahren wird eine Bakterienkonzentration von eins mal 10 bis 11 KBE pro Milliliter in der ad lido-Fütterungsbedingung und einmal 10 bis zur achten KBE pro Milliliter als optimale DR-Fütterungsbedingung verwendet. Es können jedoch vier bis sechs verschiedene Bakterienkonzentrationen erforderlich sein, um eine vollständige dosisabhängige Beziehung herzustellen.

Für SDR und seine Antworten. Bereiten Sie ein Inokulum mit einer einzigen Kolonie von E. coli OP 50-Bakterien in drei Millilitern flüssiger LB-Brühe vor, die in einem 37 Grad Celsius heißen Shaker für sechs bis acht Stunden kultiviert wird. Die OP 50-Kultur wird in einen neuen Kolben mit 500 Millilitern LB-Brühe überführt und über Nacht wachsen gelassen, damit die Bakterien bei Bedarf die Sättigung erreichen.

Bereiten Sie eine geeignete Verdünnung der OP 50-Kultur für die Messung der Extinktion bei OD 600 vor. Um die Bakterienkonzentration zu bestimmen, pelletieren Sie die Bakterien durch Zentrifugation bei 1500 g für 20 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Bakterien auf eine Konzentration von eins mal 10 at der 12. KBE pro Milliliter.

Bereiten Sie nun 10 Milliliter Bakterienkulturen in sechs verschiedenen Konzentrationen vor, die von eins mal 10 der 12. bis eins mal 10 der siebten KBE pro Milliliterpipette reichen. Richten Sie zwei Milliliter Bakterienkultur in die Mitte einer 60 Millimeter erstarrten N GM-Platte. Vermeiden Sie es, die Oberfläche der Platte mit der Pipettenspitze zu berühren, da Kerben auf der Oberfläche es Würmern ermöglichen, sich in die Belüftungsöffnungen einzugraben.

Legen Sie die Platten für eine Stunde in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Tragen Sie dann 10 Mikroliter 100 Milligramm pro Milliliter Kohlendioxid und 10 Mikroliter 50 Milligramm pro Milliliter Dose Mycin auf jede Platte auf, um das Wachstum der Bakterien zu schonen. Lagern Sie Teller mit unterschiedlichen Konzentrationen von Antibiotika, abgetöteten Bakterien, bei vier Grad Celsius für die zukünftige Verwendung bis zu einem Monat.

Es ist wichtig, genügend Platten vorzubereiten und zu lagern, am besten die gleiche Charge für die gesamte Anlage. Experimentieren Sie mindestens ein bis zwei Tage im Voraus, um die Lebensfähigkeit der Bakterien zu überprüfen. Kratzen Sie einige Bakterien aus den SDR-Platten und verteilen Sie sie auf einer leeren N GM-Platte mit Kohlensäure, Sein und Antimycin.

Stellen Sie die Platte für sechs bis acht Stunden in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator und vergewissern Sie sich, dass kein Bakterienwachstum vorhanden ist. Für die meisten SDR-bezogenen Studien, wie z. B. die Analyse der Lebensspanne und die Erstellung von Profilen der Nachkommenproduktion, ist die Vorbereitung einer alterssynchronisierten Population von Würmern unerlässlich. Verwenden Sie einen Platin-Wurmsammler, um 20 bis 30 fortpflanzungsaktive erwachsene Tiere auf mehrere reguläre NGM-Platten zu übertragen.

Mit OP 50. Abhängig von der Anzahl der für die Experimente benötigten Eizellen können weitere erwachsene Tiere benötigt werden. Lassen Sie die Platten vier Stunden lang bei 20 Grad Celsius, damit die Eiablage möglich ist.

Nehmen Sie die erwachsenen Tiere vom Teller und untersuchen Sie die Teller visuell auf Eier. Inkubieren Sie die Platten weiterhin bei 20 Grad Celsius, damit sich die Nachkommen in das späte L-Vier-Tage-Stadium des ersten Tages entwickeln können. Normalerweise dauert dies bei N zwei Wildtyp-Würmern bei 20 Grad Celsius drei Tage.

Für die Lebensdaueranalyse. Übertragen Sie 10 bis 12 adulte Würmer auf eine SDR-Platte, um die diätetische Einschränkung einzuleiten. Um eine ausreichende statistische Aussagekraft zu erhalten, verwenden Sie insgesamt 60 bis 100 Würmer für jede SDR-Bedingung.

Bewerte die Lebensfähigkeit jedes Wurms alle zwei bis drei Tage, bis alle Würmer abgestorben sind. Wichtig ist, dass Sie die Würmer jeden zweiten Tag auf frische SDR-Platten umfüllen, um Hunger zu vermeiden. Diese Kalibrierkurve stellt die OP 50-Konzentration im Verhältnis zu OD 600 dar.

Die durch die lineare Regressionsanalyse generierte Gleichung kann für alle zukünftigen Berechnungen der OP 50-Bakterienkonzentrationen verwendet werden. In dieser Studie wird die Wirkung chronischer SDR-Behandlungen auf die mittlere Lebensdauer verschiedener Wurmstämme im Vergleich zu einer normalen dosisabhängigen Reaktion von Wildtyp-Würmern auf SDR untersucht. Der Lifespan-Effekt von SDR wird teilweise durch eine DR-2-Überexpression unterdrückt, während die DAF 16 MU 86-Mutation keinen Einfluss auf die SDR-induzierte Lebensdauerverlängerung hat.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Dian auf dem Standard-AGA-basierten Spiel in Meereseleganz ausführen können.