Name: Nicht-chirurgische Intratrachealbiopersistenztest von Mäusen mit Analyse der Lungen-und Lungenforschung Lymphknoten mittels Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Lernen Sie eine nicht-chirurgische intratracheale Methode zur Testsubstanz-Applikation in Mäusen mit anschließender Durchflusszytometrie-Analyse von Lungen- und Lymphknotenzellen.

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1. Bevor der Prozess vorbereiten und sammeln Sie die folgenden Elemente <ol><li> Bitte beachten Sie das Bild in Abbildung 1a) und 1b) für den Bau einer hölzernen Plattform, um die Maus während des Verfahrens zu beschränken. </li><li> Verdauung Mix für Lymphknoten - HBSS + 1.25mg/ml Collagenase TypIV oder 2,5 mg / ml Collagenase D </li><li> Verdauung Mix für Lungen - HBSS + 1 mg / ml Collagenase </li><li> Verdünnen Latexkügelchen (1:20) in PBS für intraperitoneale Injektion der LDLNs visualisieren </li></ol> Hinweis: LDLNs sind klein und schwer zu finden. Um zu erfahren, wie Sie sie finden, injizieren 200 ul der 1:20 verdünnt rot fluoreszierende Latexkügelchen ip in der Maus. Das Bauchfell Kanalisation, diese LDLNs 8. 24 hpi, setzen die Brusthöhle von der Maus wie oben beschrieben. Die LDLNs wird erscheint rosa von den Perlen, die aus der Bauchhöhle abgeleitet. <ol start="5"><li> Red Blood Cell (RBC) Lysis Buffer - 0,15 NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, 0,1 mM Na 2 EDTA in 1L dH 2 0. Der pH-Wert auf 7,2-7,4 und bei Raumtemperatur lagern. </li><li> 70μm oder 100 um Zellsieb </li><li> Stammlösung von 0,5 M EDTA, pH = 8,0 </li><li> HBSS ohne CaCl 2 und MgCl 2 </li><li> Scheren und stumpfem Ende Zange </li><li> Laryngoskop </li><li> Gavage Nadel (22 Gauge) abgewinkelt (Abb. 2) </li><li> Styropor Kost und Stifte für die Verbreitung der Maus </li><li> Top Waage </li><li> Anilinblau Solution - 10mg/ml in H 2 O </li></ol> Hinweis: Wir werden mit dieser Lösung für die Demonstration der es Injektionstechnik. 2. Herstellung und Anwendung von Maus-Narkose <ol><li> Bereiten Sie eine Mischung aus Xylazin und Ketamin in sterile PBS, so dass die Endkonzentrationen 2mg/ml und 10mg/ml sind jeweils. </li><li> Wiegen Sie die Maus auf eine Top-Waage. </li><li> Berechnen Sie die Dosis für jede Maus erforderlich. Dosis am Xylazin (2-4 mg / kg) und Ketamin (70-80 mg / kg) Körpergewicht durch geeignete Volumen der hergestellten Mischung und injizieren intaperitoneally. Jede Maus-Stamm kann verlangen, Optimierung der Narkose. Mäuse, die zu viel Narkosemittel kann eine verminderte Atemfrequenz, die tödlich sein könnte, nachdem Inokulum in die Lunge instilliert wird. </li><li> Nach 3-5 Minuten, beachten Sie die Maus um die Effekte aus der Narkose. Überprüfen Sie die folgenden Zeichen, um zu bestätigen, dass die Maus vollständig betäubt ist: <ol><li> Die Atemfrequenz verlangsamen sollte. </li><li> Die Maus sollte nicht strecken den Arm, wenn sie durch den Hals griff. </li><li> Es sollte keine Reaktion, wenn die Hinterbeine stimuliert werden. Sind diese Kriterien nicht erfüllt sind, für ein paar Minuten warten und erneut prüfen, bevor Sie den nächsten Schritt. </li></ol></li></ol> 3. Intratracheale Injektion <ol><li> Bereiten Sie das Inokulum in 50 ul Kochsalzlösung. Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit einer sterilen Nadel verbogen Magensonde mit dem Inokulum ausgestattet. Die Spritze sollte mit einer 100 &amp;mgr; Luftpolster hinter dem Inokulum geladen werden, um sicherzustellen, dass alle von der Flüssigkeit in der Lunge ist anerzogen. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf den abgewinkelten Holzplattform hängen von seinen Schneidezähnen auf dem Draht und sanft zurückhalten Sie ihn mit einem Stück Band. </li><li> Schalten Sie das Laryngoskop mit der linken Hand (wenn Sie Rechtshänder sind) und greifen ein Paar stumpfe Ende einer Pinzette. Verwenden Sie die Spitze des Laryngoskop und die Zange zu hebeln öffnen Sie den Mund. </li><li> Mit der Zange, ziehen Sie die Zunge heraus und halten Sie sie zur Seite. Führen Sie die Laryngoskopspatel in Richtung der Rückseite des Mundes. Halten Sie das Laryngoskop nach unten sehr vorsichtig in einem 90 ° Winkel gedrückt, bis Sie die Öffnung der Luftröhre zu sehen. Halten Sie das Laryngoskop in Kraft. Vorsicht beim Ziehen der Zunge aus dem Mund, und dies sollte vorsichtig erfolgen, damit keine Gewebeschäden auftritt. </li><li> Mit der anderen Hand nehmen Sie die 1 ml Spritze mit dem Inokulum, mit dem gebogenen Sonde Nadel mit der rechten Hand montiert und die Nadel in die Luftröhre bis zur Biegung der Nadel wird durch den vorderen Schneidezähnen. Drücken Sie den Kolben gleichmäßig auf die Inokulum zu liefern. Das Inokulum sollte nicht Blase. Ziehen Sie die Nadel aus der Luftröhre so schnell wie möglich. Mäuse ersticken und sterben, wenn die Luftröhre zu lange blockiert wird. Halten Sie die Maustaste aufrecht für ein paar Sekunden, bis Inokulum in die Lunge eingeatmet werden. </li><li> Nehmen Sie die Maus aus der Plattform und stellen Sie es in der Nähe einer Wärmelampe. Lassen Sie keine Mäuse unter direkter Hitze für längere Zeit. Die Maus sollte hellwach innerhalb von 30 min nach dem Eingriff (Recovery-Zeit kann auf der Grundlage Stämme variieren). Mäuse fleißig sollte während dieser Zeit beobachtet werden und darf nicht zu heiß oder zu kalt werden, könnte dies auch stellen die Mäuse in Atemnot zum Tod führen. </li></ol> 4. Ernte und Verarbeitung Lung Lymphknoten und die Lunge für die Durchflusszytometrie<ol><li> Sacrifice Mäusen mit der gewünschten Methode sollte nach dem AVMA Euthanasie-Richtlinien. Dies kann je nach individuellen Ernte Ergebnisse. Die Verabreichung einer tödlichen hat der Natrium-Pentobarbital ist ein Beispiel für ein geeignetes Verfahren Euthanasie. Wir haben keine negativen Effekte in der Lunge der Euthanasie von CO 2 zu sehen. </li><li> Pin den Armen und Beinen auf einer Dissektion Bord. Machen Sie einen Schnitt entlang der Mitte der Bauchseite mit einer Schere. Ziehen Sie die Haut und setzen die Brustwand Muskeln. </li><li> Machen Sie Schnitte durch die Brustwand Muskeln, um die Bauchorgane aussetzen. </li><li> Halten Sie die Spitze des Brustbeins mit der Zange und Punktion der Membran. Schneiden Sie die Membran an den Seiten des Brustkorbs. </li><li> Mit der Schere parallel zur Dissektion Plattenoberfläche durch die Brusthöhle entlang der dorso-ventralen Linie auf beiden Seiten abgeschnitten. </li><li> Heben Sie den Brustkorb auf. Auf der rechten Seite des Herzens, etwas unterhalb des Thymus, für zwei Lymphknoten zu suchen. Ein etwas größeres dritten Lymphknoten unter einer kleinen arteriellen Blutgefäße, die senkrecht zu der Luftröhre entfernt. Ernte Lymphknoten in 1 ml der Lymphknoten Verdauung zu mischen. </li><li> Nach der Ernte der Lymphknoten, halten das Herz mit einer Pinzette und greifen die Lungen mit einem anderen. Ernte Lungen in 3 ml eiskaltem PBS in einer 6-Well-Platte. </li><li> Trennen Sie die Lappen der Lunge, absaugen PBS und hacken die Lappen in kleine Stücke mit einer Pinzette und Schere. Add 3ml der Verdauung Mix für Lungen. Halten Sie die 6-Well-Platte auf Eis bei diesem Schritt. </li><li> Inkubieren Sie die Lymphknoten für 25-30 min und Lunge für 30 min bei 37 ° C. Add EDTA zu einer Endkonzentration von 10mM zu jedem der Verdauung Mischungen, die Reaktion und auf Eis zu stoppen. </li><li> Mit einer 3 ml Spritze, pass Stücke von Lunge durch eine 18GA Nadel 3 mal. Mash die Stücke der Lunge und der LNS durch 70-100 um Zelle Siebe mit dem hinteren Ende eines 1ml Spritzenkolben. Waschen Sie die Zelle Siebe mit 10 ml HBSS ohne Ca 2 + und Mg 2 +. Zentrifuge bei 500 xg für 5 min. </li><li> Das Pellet in 5 ml RBC Lysispuffer und Inkubation für 3 min bei Raumtemperatur. Fügen Sie 10 ml HBSS ohne Ca 2 + und Mg 2 + zur Lyse zu stillen. Zentrifuge bei 500 xg für 5 min. Rufen Sie die Lunge und LDLN einzelnen Zellsuspensionen bis 10 ml und 5 ml bzw.. Graf lebenden Zellen mit Hilfe eines Hämazytometer durch Trypanblau-Ausschluss. Die Zellen sind nun bereit, für die Durchflusszytometrie Fleck. 1 Lappen der Lunge ausreichend sein für die Durchflusszytometrie. Andere Lappen kann auch für andere experimentelle Fragestellungen innerhalb der gleichen Maus wie Homogenaten für Zytokine oder Gewebe für die Histologie verwendet werden. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: LDCs und Alveolarmakrophagen in der Lunge zu erwerben Antigen aus dem Alveolarräumen der Lunge unmittelbar darauf folgenden Injektion. Abbildung 3 zeigt den Prozentsatz von CD11c + (ausgedrückt auf LDCs und Alveolarmakrophagen) Zellen, die positiv für fluoreszenzmarkierten Bacillus anthracis Sporen, 30 min post es Injektion. Zu diesem Zeitpunkt hegte ~ 15,9% der CD45 + CD11c + Zellen in der Lunge einzigen Zellsuspension Bacillus anthracis Sporen (Abbildung 3, untere Reihe). Zur weiteren Charakterisierung der CD11c + Zellen in der Lunge, um Kim und Braciale 4 beziehen. Fluoreszenzmarkierten Beads werden routinemäßig eingesetzt zur Bekämpfung von partikulären Antigenen an LDLNs 9 zu bewerten. Zur Beurteilung dieser Transport von der Lunge zu LDLNs wurden fluoreszierende Latexkügelchen mit LPS und LDLNs wurden bei 24 hpi analysiert injiziert. Etwa 4% der CD11c hallo Zellen in der LDLNs hegte fluoreszierende Kügelchen in 24hpi (Abbildung 4). Diese repräsentative Experimente zeigen, dass dieses Protokoll effizient genutzt werden kann, um Zellen, die eingeatmet Partikel Antigene zu erwerben in den Lungen und in der Folge Verkehr sie die LDLNs verfolgen. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Holzplattform für die Fesselung von Mäusen während es Injektion. Ein Holzblock wurde in einem Winkel geschnitten und Metallstangen wurden eingebaut, Vorderansicht Abbildung 1a) und Seitenansicht Bild 1b). Ein kleines Stück Draht um den Metallstab gewickelt, um die vorderen Schneidezähne der Maus zu verankern. Ein Stück Band wurde auf die Plattform rund um die Maus binden, um ihn zu halten, während des Verfahrens angebracht. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Gavage Nadel für ihn Injektion. Eine Magensonde Nadel (rechts) wurde in einem Winkel von ~ 135 ° (links) für ihn Injektion gebogen. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Prozentsatz aller CD11c + Zellen in der Lunge, die es injiziert GFP-exprimierenden Bacillus anthracis (Sterne-p6GFP), 5 Stunden post Challenge Hafen. AJ-Mäuse wurden Herausforderung mit 1x10 8 GFP-Bacillus anthracis Sporen und die Lungen wurden in 5 Stunden nach der Infektion analysiert. Die Dot-Plots zeigen Anteil der CD11c + Lungenzellen, die positiv für Bacillus anthracis sind. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Detektion von fluoreszierenden Kügelchen (gelb / grün) in der Lunge Lymphknoten 24 Stunden nach der i. T Injektion. AJ-Mäuse wurden entweder mit PBS (linkes Bild) oder 5x10 9 Fluoresbrite YG Microspheres (0,5 um) mit 10 ug LPS (rechts) und es LDLNs analysiert 24hpi gegeben wurden. Vertreter Dot-Plots zeigen Anteil der CD11c hallo Zellen in der LDLNs, dass Hafen fluoreszierende Kügelchen gegen einen leeren Kanal aufgezeichnet.

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</ol>

Wir haben dieses Protokoll genutzt werden, um den Handel mit Bacillus anthracis Sporen aus der Lunge zu den LDLNs studieren. Für ähnliche Anwendungen, sollte die Anzahl der Partikel, die die Lunge sorgfältig ausgewählt werden, so dass das eingespritzte Material in der LDLNs kann mittels Durchflusszytometrie detektiert werden. Wir haben auch erfolgreich diese Methode für adoptiven Transfer von Zellen und die Kennzeichnung von bestimmten Lungen-Zell-Populationen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern eingesetzt. D...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> 70μm Zelle stariner </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anilinblau </td><td> Fischer </td><td> A967-25 </td><td></td></tr><tr><td> Tierfütterung Nadel </td><td> Popper and Sons Inc </td><td> 7920 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> Sigma </td><td> C2139 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase TypIV </td><td> Worthington </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> Roche </td><td> 11088974103 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite YG Microspheres (0,5 um) </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 17152 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid </td><td> Invitrogen </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamin HCl (100mg/ml) </td><td> Hospira Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laryngoskopspatel </td><td> PennCentury, Inc </td><td> Für Modell LS-1 </td><td> Siehe <a href="http://www.penncentury.com">www.penncentury.com</a> </td></tr><tr><td> Lightweight Fiber Optik Laryngoskop </td><td> WelchAllyn </td><td> 80814 </td><td></td></tr><tr><td> Red Fluorescent Perlen (0,5 um) </td><td> Invitrogen </td><td> F8812 </td><td> Für ip-Injektion </td></tr><tr><td> Xylazin (100mg/ml) </td><td> Lloyd Laboratories </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nicht-chirurgische intratrachealbiopersistenztest von mäusen mit analyse der lungen-und lungenforschung lymphknoten mittels durchflusszytometrie

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagozytierenden Zellen wie Alveolarmakrophagen und Lunge dendritischen Zellen (LDCs) kontinuierlich Probe Antigene aus dem Alveolarräumen in der Lunge. LDCs, insbesondere, sind dafür bekannt, in die Lunge Lymphknoten (LDLNs), wo sie vorhanden inhalative Antigene an T-Zellen zur Einleitung einer entsprechenden Immunantwort auf eine Vielzahl von Immunogenen 1,2. Migrieren Zur Modellierung Wechselwirkungen zwischen den Lungen und in der Luft-Antigene in Mäusen können Antigene intranasal 1,3,4 verabreicht werden, intratracheal 5 oder als Aerosole 6. Lieferung bis jede Route umfasst verschiedene technische Fähigkeiten und Einschränkungen, die vor der Gestaltung eines Experiments berücksichtigt werden müssen. Zum Beispiel liefert intranasale und Aerosol Exposition Antigene sowohl die Lungen und die oberen Atemwege. Daher Antigene können auf die Nase assoziierten lymphatischen Gewebe (NALT) 7, möglicherweise erschweren die Interpretation der Ergebnisse. Darüber hinaus können beim Schlucken, Niesen und die Atemfrequenz der Maus auch zu Inkonsistenzen in den Dosen geliefert führen. Obwohl die Beteiligung der oberen Atemwege bei einigen Studien bevorzugt werden, kann es die Experimente mit Schwerpunkt auf Veranstaltungen speziell in der Lunge ausgelöst. In dieser Einstellung wird die intratracheale (it) Route vorzuziehen, da sie Testmaterialien liefert direkt in die Lunge und umgeht die NALT. Viele es Injektion Protokolle beinhalten entweder blind Intubation der Luftröhre durch die Mundhöhle oder chirurgische Freilegung der Luftröhre in die Lunge zugreifen. Hier beschreiben wir eine einfache, konsistente, nicht-chirurgische Methode für die es Instillation. Die Öffnung der Luftröhre wird visualisiert mit einem Laryngoskop und eine gebogene Nadel Sonde wird dann direkt in die Luftröhre eingeführt, um die Inokulum zu liefern. Wir beschreiben auch Verfahren für die Ernte und Verarbeitung von LDLNs und Lunge für die Analyse von Antigen Handel mittels Durchflusszytometrie.

Wir illustrieren nicht-chirurgische Lieferung von Testmaterialien in den Lungen von narkotisierten Mäusen über die Luftröhre. Dieses Verfahren ermöglicht die Lunge Exposition gegenüber bakteriellen und viralen Erregern, Zytokine, Antikörper, Perlen, Chemikalien oder Farbstoffe. Wir beschreiben ferner die Ernte und Verarbeitung der Lunge und der Lunge Lymphknoten (LDLNs) für die Durchflusszytometrie.

Nicht-chirurgische Intratrachealbiopersistenztest von Mäusen mit Analyse der Lungen-und Lungenforschung Lymphknoten mittels Durchflusszytometrie

Phagozytierende Zellen wie Alveolarmakrophagen und dendritische Lungenzellen (LDCs) nehmen kontinuierlich Antigene aus den Alveolarräumen der Lunge auf. LDCs, ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Testmaterialien auf nicht-chirurgischem Weg mittels einer Gavagenadel in die Lungen von Mäusen einzubringen und anschließend die Lungen sowie die lungendrainierenden Lymphknoten zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein beleuchtetes Laryngoskop und eine gebogene Gavagenadel in die Trachea einer anästhesierten Maus eingeführt werden. Anschließend wird das Testmaterial über das Laryngoskop und die Gavagenadel in die Lungen des Tieres appliziert.Anschließend werden die Lungen und die drainierenden Lymphknoten entnommen. Schließlich werden die Lungen und Lymphknoten zu Einzelzell-Suspensionen verarbeitet. Letztendlich ermöglicht diese Methode die Durchflusszytometrie-Analyse der Assoziation des Testmaterials mit den Immunzellen der Lunge sowie des Traffickings der Zellen zu den drainierenden Lungenlymphknoten.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie intranasalen oder aerosolisierten Expositionen besteht darin, dass sie eine gezielte Applikation des Testmaterials in die Lunge ermöglicht, wobei das nasenassoziierte lymphatische Gewebe umgangen wird. Außerdem ist sie im Vergleich zu chirurgischen Methoden der intratrachealen Instillation einfach durchzuführen. Die Durchführung der Prozedur wird Elizabeth Enti, eine Postdoktorandin im Labor von Richie, und Manji, ein Doktorand im Labor von Lens, demonstrieren.Nach der Anästhesie der Maus das Inokulum in 50 Mikrolitern Kochsalzlösung herstellen. Eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer sterilen gebogenen Gavage-Kanüle ausgestattet ist, mit dem Inokulum füllen. Die Spritze mit einer 100-Mikroliter-Luftblase hinter dem Inokulum befüllen, um sicherzustellen, dass die gesamte Flüssigkeit in die Lunge eingebracht wird.Platzieren Sie die Maus auf der schrägen Holzplattform, die an einem Draht hängt, wobei sie sich mit den Schneidezähnen festhält, und fixieren Sie sie vorsichtig mit einem Stück Band. Schalten Sie danach mit einer Hand das Laryngoskop ein und nehmen Sie mit der anderen Hand ein Paar stumpfe Pinzette. Benutzen Sie die Spitze des Laryngoskops und die Pinzette, um vorsichtig den Mund mit der Pinzette zu öffnen.Ziehen Sie die Zunge heraus und halten Sie sie zur Seite. Führen Sie die Laryngoskopklinge in Richtung des hinteren Mundbereichs. Halten Sie das Laryngoskop sanft nach unten gedrückt in einem Winkel von 90 Grad, bis die Öffnung der Luftröhre sichtbar ist.Während Sie das Laryngoskop mit einer Hand festhalten, nehmen Sie mit der anderen Hand die Ein-Milliliter-Spritze, die mit der gebogenen Gavagesonde, gefüllt mit dem Inokulum, ausgestattet ist. Führen Sie die Sonde in die Luftröhre ein, bis sich die Biegung der Sonde an den Schneidezähnen befindet. Drücken Sie den Kolben gleichmäßig, um das Inokulum blasenfrei zu verabreichen.Ziehen Sie die Nadel so schnell wie möglich aus der Luftröhre heraus. Halten Sie die Maus einige Sekunden lang aufrecht, damit das Inokulum in die Lungen eingeatmet werden kann. Stellen Sie die Maus in die Nähe einer Wärmelampe und lassen Sie sie aufwachen.Nach der Tötung befestigen Sie die Gliedmaßen der Maus an einem Präparationsbrett. Führen Sie mit einer Schere einen Schnitt entlang der Mitte der Bauchseite durch. Ziehen Sie vorsichtig die Haut zurück und legen Sie das Peritoneum frei.Erstellen Sie Einschnitte am Peritoneum, um die Bauchorgane freizulegen. Halten Sie die Spitze des Brustbeins mit der Pinzette fest und perforieren Sie das Zwerchfell mit der Schere. Schneiden Sie das Zwerchfell entlang der Seiten des Rippenbogens mit der Schere parallel zur Oberfläche des Präparationsbretts.Schneiden Sie leicht entlang der dorsoventralen Linie beidseits der Brusthöhle durch. Heben Sie das Rippengeflecht auf der rechten Seite des Herzens an. Suchen Sie direkt unterhalb des Thymus nach zwei Lymphknoten.Ein dritter, leicht größerer Lymphknoten befindet sich unterhalb eines kleinen arteriellen Blutgefäßes, das senkrecht zur Luftröhre verläuft. Gewinnen Sie die Lymphknoten in ein Milliliter Lymphknotendigestionslösung, mischen Sie vorsichtig und stellen Sie auf Eis. Nach der Gewinnung der Lymphknoten entnehmen Sie die Lungen und geben sie in eine sechslochige Platte.Halten Sie die 6-Loch-Platte auf Eis, saugen Sie das PBS ab und zerkleinern Sie die Lappen mit Pinzette und Schere in kleine Stücke. Halten Sie jedes Lymphknoten mit einer Nadel der Größe 26 fest und zupfen Sie es mit einer zweiten Nadel der Größe 26 auseinander. Um die Freisetzung aller Zellen sicherzustellen, geben Sie drei Milliliter des Verdauungsgemischs für die Lungen und einen Milliliter für die Lymphknoten hinzu.Nach einer Inkubation der Lymphknoten für 25 bis 30 Minuten und der Lunge für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius EDTA zu jeder Verdauungsmischung bis zu einer Endkonzentration von 10 Millimolar hinzufügen, um die Reaktion zu stoppen, und anschließend auf Eis stellen. Mit einer 3-Milliliter-Spritze Stücke der Lunge durch eine 18-Gauge-Nadel pressen. Die Stücke der Lunge und der Lymphknoten dreimal durch Zellsiebe mit einer Porenweite von 70 bis 100 Mikrometern zerkleinern.Spülen Sie die Zellfilter mit dem Kolben eines Ein-Milliliter-Spritzenstößels mit 10 Milliliter HBSS ohne Calcium und Magnesium. Zentrifugieren Sie die Zellproben bei 500 × g fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie die Pellets in fünf Milliliter Puffer zur Lyse der roten Blutkörperchen und inkubieren Sie drei Minuten lang.Bei Raumtemperatur 10 Milliliter HBSS ohne Calcium und Magnesium hinzufügen, um die Lyse zu stoppen, und die Proben fünf Minuten lang bei 500 × g zentrifugieren. Die Einzelzell-Suspensionen aus Lunge und lungendrainierenden Lymphknoten auf jeweils 10 Milliliter und 5 Milliliter auffüllen. Die Zellen mit der Trypanblau-Ausschlussmethode in einem Hämozytometer zählen.In diesen beiden Abbildungen wurden AJ-Mäuse mit einer Konzentration von 1 × 10⁸ Bacillus anthracis-Sporen herausgefordert, und die Lungen wurden 30 Minuten nach der Infektion mittels Durchflusszytometrie analysiert. Diese Punktdiagramme zeigen die Gating-Strategie. Diese Felder zeigen den Prozentsatz der CD45-positiven, CD11c-positiven Lungenzellen, die positiv für Bacillus anthracis-Sporen sind.In dieser Abbildung wurden AJ-Mäuse intratracheal injiziert und anschließend ihre lungendrainierenden Lymphknoten analysiert. Repräsentative Dotplots zeigen den Prozentsatz von CD11c-hoch-Zellen in den lungendrainierenden Lymphknoten, die fluoreszierende Kügelchen enthalten, aufgetragen gegen einen leeren Kanal. Das linke Panel zeigt die Ergebnisse von Mäusen, die mit PBS injiziert wurden, und das rechte Panel zeigt die Ergebnisse von Mäusen, die mit fünf mal 10 hoch neun Flora-besiedelten, hellgelb-grünen Mikrokügelchen mit 10 Mikrogramm LPS injiziert wurden.Mit dieser Methode können zentrale Fragen in diesem Forschungsbereich beantwortet werden, beispielsweise welche Ereignisse spezifisch in den Lungen ausgelöst werden und wie inhalierte Antigene von den Lungen in die drainierenden Lymphknoten transportiert werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Die Verwendung eines Modells, das den Zustand von Lungenerkrankungen in Menschen nachahmt, ist für die Untersuchung der Pathophysiologie und / oder Ätiologie von bestimmten Krankheiten und für die Entwicklung von therapeutischen Eingriff. Hier eine nicht-invasive Methode, die intratracheale Intubation direkt liefern kann exogene Materialien Maus Lunge wird vorgestellt.

Nichtinvasive Intratracheale Intubation, die Pathologie und Physiologie der Maus Lung Study

Die Immunantwort des Wirts auf Pathogen-Infektion ist eine streng reguliert Prozess. Mit Hilfe eines Lipopolysaccharid Lungenexpositionsmodell in Mäusen, ist es möglich, hochauflösende Auswertungen der komplexen Mechanismen der Krankheitsentstehung verbunden durch.

Die Nutzung der Oropharyngeale Intratracheale PAMP Verwaltung und bronchoalveoläre Lavage, um die Immunantwort in Mäusen Bewerten

Intubation vermittelte intratracheale (IMIT) Instillation von Reagenzien ist ein ausgezeichnetes, nicht-invasive Methode zur Untersuchung Atemwegserkrankungen, sowie ein Verfahren zum Einträufeln therapeutische Reagenzien direkt in die Lunge. Es ist eine schnelle und hoch reproduzierbare Methode, die sich für vorklinische Tests ist.

Intubation vermittelte Intratracheale (IMIT) Instillation: eine nichtinvasive, lungenspezifischen Delivery System

Das Ziel dieser Arbeit ist es, einfache Methoden, die sich stark in den Aufbau und die Analyse von Mauslungen mit Lungenkrebs oder anderen Pathologien helfen werden zu beschreiben. Wir stellen 3-Protokolle, um einfach und zuverlässig durchführen Lungen Instillationen, Fixierung, und Lungenvolumenmessungen.

Instillation und Fixationsmethoden Nützlich in Maus Lung Cancer Research

Dieser Artikel stellt eine schnelle und einfache Methode zur Bleomycin direkt in die Luftröhre Maus über Intubation verabreicht wird. Die wichtigsten Vorteile dieser Methode sind, dass sie in hohem Maße reproduzierbar, leicht zu beherrschen ist, und nicht spezialisierte Ausrüstung oder langwierige Wiederherstellungszeiten erfordern.

Ein verbessertes Verfahren zur schnellen Intubation der Luftröhre in Mice

Wir beschreiben ein Verfahren zur Erzeugung von Precision-cut Lung Slices (PCLS) und immunostaining sie die Lokalisierung verschiedenen Immunzelltypen in der Lunge sichtbar zu machen. Unser Protokoll kann erweitert werden, um die Position und Funktion vieler verschiedenen Zelltypen unter einer Vielzahl von Bedingungen zu visualisieren.

Precision-cut Maus Lung Slices Live-Pulmonary Dendritische Zellen sichtbar zu machen

Hier beschreiben wir eine minimalinvasive Phänomen orthotopen Transplantation Modell der Lunge Adenokarzinom Mauszellen als Zeit und kostensenkende Modell, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs zu studieren.

Orthotopen Transplantation von Phänomen Lungenzellen Adenokarzinom, PD-L1 Ausdruck zu studieren

Die intratracheale (IT) Verabreichung von Versuchsmitteln bei Mäusen führt oft zu einer asymmetrischen Abgabe in die distale Lunge.  In diesem Bericht beschreiben wir einen direkten intrabronchialen (IB) Ansatz, um jede Lunge bei lebenden Mäusen nicht operativ zu nulaten.  Dieser Ansatz kann verwendet werden, um Wirkstoffe selektiv in eine Lunge zu verabreichen, oder kann angepasst werden, um die symmetrische Wirkstoffabgabe in beide Lungen zu verbessern.

Direkte intrabronchiale Verabreichung zur Verbesserung der selektiven Agentenablagerung innerhalb der Mauslunge

In dieser Studie stellen wir ein effektives und reproduzierbares Protokoll zur Isolierung der Immunpopulationen der murinen Atemwege vor. Wir bieten auch eine Methode zur Identifizierung aller angeborenen und adaptiven Immunzellen, die sich in den Lungen gesunder Mäuse befinden, unter Verwendung eines 9-farbbasierten Durchflusszytometrie-Panels.

Durchflusszytometrische Analyse zur Identifizierung der angeborenen und adaptiven Immunzellen der murinen Lunge

In dieser Arbeit schlagen wir ein Protokoll für die intratracheale Lipopolysaccharid-Abgabe (LPS) mittels nicht-invasiver oropharyngealer endotrachealer Intubation vor. Diese Methode minimiert das Trauma des chirurgischen Eingriffs für das Tier und gibt LPS genau in die Luftröhre und dann in die Lunge ab.

Nichtinvasive intratracheale Lipopolysaccharid-Instillation bei Mäusen

Das Modell der intrapulmonalen Trachealtransplantation (IPTT) ist wertvoll für die Untersuchung der obliterativen Atemwegserkrankung (OAD) nach Lungentransplantation. Es bietet Einblicke in das lungenspezifische immunologische und angiogene Verhalten bei der Atemwegsobliteration nach Allotransplantation mit hoher Reproduzierbarkeit. Hier beschreiben wir das IPTT-Verfahren und die zu erwartenden Ergebnisse.

Intrapulmonale Trachealtransplantation bei Mäusen: Ein Modell zur Untersuchung obliterativer Atemwegserkrankungen nach Lungentransplantation

Lernen Sie eine nicht-chirurgische intratracheale Methode zur Testsubstanz-Applikation in Mäusen mit anschließender Durchflusszytometrie-Analyse von Lungen- und Lymphknotenzellen.

Nicht-chirurgische Intratrachealbiopersistenztest von Mäusen mit Analyse der Lungen-und Lungenforschung Lymphknoten mittels Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal

Nicht-chirurgische Intratrachealbiopersistenztest von Mäusen mit Analyse der Lungen-und Lungenforschung Lymphknoten mittels Durchflusszytometrie

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