Nicht-chirurgische Intratrachealbiopersistenztest von Mäusen mit Analyse der Lungen-und Lungenforschung Lymphknoten mittels Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit einer Sondensonde nicht-chirurgisch noch Material in die Lunge von Mäusen zu testen und anschließend die Lunge und die lungendrainierenden Lymphknoten zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein leuchtendes Laryngoskop und eine gebogene Sondennadel in die Luftröhre einer anästhesierten Maus eingeführt werden. Anschließend wird das Testmaterial über das Laryngoskop und die Sondennadel in die Lunge des Tieres eingeflößt.

Als nächstes werden die Lunge und die drainierenden Lymphknoten extrahiert. Schließlich werden die Lungen und Lymphknoten zu einzelligen Suspensionen verarbeitet. Letztendlich ermöglicht diese Methode die durchflusszytometrische Analyse der Assoziation des Testmaterials mit Immunzellen der Lunge und des Transports der Zellen zu den lungendrainierenden Lymphknoten

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie intranasalen und aerosolisierten Expositionen besteht darin, dass sie eine gezielte Abgabe des Testmaterials in die Lunge unter Umgehung des nasalassoziierten lymphatischen Gewebes ermöglicht. Darüber hinaus ist es im Vergleich zu chirurgischen Ratten bei der Trachealinstallation einfach durchzuführen. Elizabeth Enti, Postdoktorandin im Labor von Richie, und Manji, Doktorandin im Linsenlabor, werden das Verfahren vorführen.

Nachdem Sie die Maus betäubt haben, bereiten Sie das Inokulum in 50 Mikrolitern Kochsalzlösung vor. Füllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer sterilen gebogenen Sondennadel versehen ist, mit dem Inokulum. Laden Sie die Spritze mit einer 100-Mikroliter-Lufttasche hinter das Inokulum, um sicherzustellen, dass die gesamte Flüssigkeit in die Lunge eingebracht wird.

Platzieren Sie die Maus auf der abgewinkelten Holzplattform, die an ihren Schneidezähnen am Draht hängt, und halten Sie sie vorsichtig mit einem Stück Band fest. Schalten Sie dann das Laryngoskop mit einer Hand ein und greifen Sie mit der anderen Hand nach einer stumpfen Pinzette. Hebeln Sie mit der Spitze des Laryngoskops und der Pinzette den Mund vorsichtig mit der Pinzette auf.

Ziehe die Zunge heraus und halte sie zur Seite. Führen Sie die Laryngoskop-Klinge in Richtung Mundrücken. Halten Sie das Laryngoskop sehr sanft in einem 90-Grad-Winkel nach unten, bis die Öffnung der Luftröhre zu sehen ist.

Während Sie das Laryngoskop mit einer Hand an Ort und Stelle halten, nehmen Sie mit der anderen Hand die Ein-Milliliter-Spritze, die mit der gebogenen Sondennadel ausgestattet ist, die das Inokulum enthält. Führen Sie die Nadel in die Luftröhre ein, bis sich die Biegung der Nadel an den vorderen Schneidezähnen befindet. Drücken Sie den Kolben gleichmäßig, um das Inokulum ohne Blasenbildung abzugeben.

Ziehen Sie die Nadel so schnell wie möglich aus der Luftröhre. Halten Sie die Maus einige Sekunden lang aufrecht, damit das Inokulum in die Lunge eingeatmet werden kann. Platzieren Sie die Maus in der Nähe einer Heizlampe und lassen Sie sie aufwachen.

Nach dem Einschläfern stecken Sie die Arme und Beine der Maus an ein Sezierbrett. Machen Sie mit einer Schere einen Schnitt in der Mitte der Bauchseite. Ziehen Sie sanft an der Haut und legen Sie das Bauchfell frei.

Machen Sie Schnitte am Bauchfell, um die Bauchorgane freizulegen. Halten Sie die Spitze des Brustbeins mit der Pinzette fest und stechen Sie mit der Schere in das Zwerchfell. Schneiden Sie das Zwerchfell mit der Schere parallel zur Oberfläche des Sezierbretts an den Seiten des Brustkorbs ab.

Schneiden Sie die Brusthöhle entlang der dorsalen Bauchlinie auf beiden Seiten leicht ein. Hebe den Brustkorb auf der rechten Seite des Herzens an. Direkt unter dem Thymus suchen Sie nach zwei Lymphknoten.

Ein dritter, etwas größerer Lymphknoten befindet sich unter einem kleinen arteriellen Blutgefäß, das senkrecht zur Luftröhre verläuft. Die Lymphknoten in einen Milliliter Lymphknotenverdauung ernten, mischen und auf Eis legen. Nach der Entnahme der Lymphknoten entnehmen Sie die Lunge in eine Sechs-Well-Platte.

Halten Sie die Sechs-Well-Platte auf Eis, saugen Sie das PBS an und hacken Sie die Lappen mit Pinzette und Schere in kleine Stücke. Halten Sie jeden Lymphknoten mit einer 26-Gauge-Nadel fest und ziehen Sie ihn mit einer zweiten 26-Gauge-Nadel auseinander. Um die Freisetzung aller Zellen zu gewährleisten, fügen Sie drei Milliliter der Verdauungsmischung für die Lunge und einen Milliliter für die Lymphknoten hinzu.

Nachdem Sie die Lymphknoten 25 bis 30 Minuten lang und die Lunge 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, fügen Sie EDTA in einer Endkonzentration von 10 Millimolar zu jeder der Verdauungsmischungen hinzu, um die Reaktion zu stoppen, und legen Sie sie dann auf Eis. Führen Sie mit einer Drei-Milliliter-Spritze Lungenstücke durch eine 18-Gauge-Nadel. Dreimal die Stücke der Lunge und der Lymphknoten durch 70 bis 100 Mikron dicke Zellsiebe zerdrücken.

Waschen Sie die Zellsiebe mit dem hinteren Ende eines Ein-Milliliter-Spritzenkolbens mit 10 Millilitern HBSS ohne Kalzium- und Magnesiumzentrifuge. Die Zelle probiert bei 500-facher Schwerkraft für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Reese biegt die Pellets in fünf Milliliter Lyse der roten Blutkörperchen, puffert sie und inkubiert sie drei Minuten lang.

Bei Raumtemperatur 10 Milliliter HBSS ohne Kalzium und Magnesium zugeben, um die Lysezentrifuge zu stillen, zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei der 500-fachen Schwerkraft. Bringen Sie die Lunge und die lungendrainierenden Lymphknoten, einzellige Suspensionen auf 10 Milliliter bzw. fünf Milliliter. Verwenden Sie den Triam-Blau-Ausschluss in einem Hämozytometer, um Zellen zu zählen.

In diesen beiden Abbildungen wurden AJ-Mäuse mit einer mal 10 bis acht Basiliras-Sporen herausgefordert, und die Lunge wurde 30 Minuten nach der Infektion mittels Durchflusszytometrie analysiert. Diese Punktdiagramme zeigen die Gating-Strategie. Diese Tafeln zeigen den Prozentsatz der CD 45-positiven CD 11 C-positiven Lungenzellen, die positiv für Bacillus anthrax-Sporen sind.

In dieser Abbildung wurden AJ-Mäuse intratracheal injiziert und dann ihre lungendrainierenden Lymphknoten analysiert. Repräsentative Punktdiagramme zeigen den prozentualen Anteil an CD 11 C-Hochzellen in den lungendrainierenden Lymphknoten, die fluoreszierende Kügelchen beherbergen, die gegen einen leeren Kanal aufgetragen sind. Das linke Feld zeigt die Ergebnisse von Mäusen, denen PBS injiziert wurde, und das rechte Feld zeigt die Ergebnisse von Mäusen, denen fünfmal 10 an die neun Floren injiziert wurden, hellgelb-grüne Mikrokügelchen mit 10 Mikrogramm LPS.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf diesem Gebiet zu beantworten, z. B. welche Ereignisse spezifisch in der Lunge ausgelöst werden und wie inhalative Antigene in die drainierenden Lymphknoten aus der Lunge transportiert werden.