Seven Steps to Cells Stellate

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, hepatische Sternzellen aus der Leber der Maus zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst in C zwei Perfusionen von Mauslebern mit Verdauungsenzymen durchgeführt werden. Nach der Perfusion werden die Lebern in kleine Stücke geschnitten, um die Effizienz der In-vitro-Verdauung zu erhöhen, die als nächstes durchgeführt wird.

In einem letzten Schritt werden die hepatischen Sternzellen durch Dichtegradientenzentrifugation von anderen Leberzelltypen getrennt. Letztendlich werden hepatische Sternzellen gewonnen, deren Reinheit durch Licht- und Immunfluoreszenzmikroskopie beurteilt werden kann. Das Verfahren wird von Patrick Meyer, einem Doktoranden aus einem Labor, demonstriert. Zur Vorbereitung der NC erwärmen zwei Perfusionen von Mauslebern zunächst die SC, einen Puffer und Enzymperfusionslösungen in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad.

Stellen Sie als Nächstes die Peristaltikpumpe so ein, dass sie eine laminare Strömung von 6,5 Millilitern pro Minute erreicht, und äquilibrieren Sie den Silikonschlauch der Pumpe mit der Lösung SC one. Bestätigen Sie nun durch einen Verlust der Reflexe, dass die betäubte Maus tief sediert ist. Fixiere dann die Maus in Rückenlage auf einer geeigneten Unterlage.

Führen Sie mit Schere und Pinzette einen Längsschnitt in der Bauchhaut durch und legen Sie das Bauchfell frei. Öffnen Sie vorsichtig das Bauchfell und bewegen Sie den Darm aus der Bauchhöhle auf die linke Seite des Tieres, um die Pfortader freizulegen. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist die Zeto-Perfusion der Leber mit Verdauungsenzymen, die demonstriert wird.

Als nächstes ist es wichtig, beim Einführen der Kanüle ein Stereomikroskop zu verwenden und die Veränderung der Leberstrukturen während der Perfusion genau zu überwachen. Führen Sie bei der Arbeit unter einem Stereomikroskop die Kanüle des Infusionssets in die Pfortader ein. Beginnen Sie die Durchblutung der Leber mit 30 Millilitern SC one Lösung. Öffnen Sie den Vanna Cava inferior sofort nach dem Initiieren des Flusses.

Eine erfolgreiche Spülung der Leber wird durch einen Farbverlust des Lebergewebes angezeigt, als nächstes wird die Leber mit 30 Millilitern Pronase E-Lösung untersucht. Die Leberlappen schwellen an und die Läppchen erscheinen deutlich durch die Kapsel nach dem Aufgießen mit Pronase-E-Lösung, die mit 30 Millilitern Kollagenase-P-Lösung durchblutet wurde. Wenn die Fülle mit Kollagenase P abgeschlossen ist, entnehmen Sie der Maus die Leber, indem Sie sie vorsichtig vom Zwerchfell und den umgebenden Organen trennen und in 70 Millilitern SC-Zwei-Lösung auf Eis lagern.

Die Leber hat zu diesem Zeitpunkt ihre Form verloren und sieht atonisch und amorph aus. Das Verfahren zur Verdauung von Mauslebern sollte unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. In einer Laminar-Flow-Haube.

Schneide die Leber mit einer scharfen Schere in Stücke von etwa zwei mal zwei mal zwei Kubikmillimetern. Kombinieren Sie dann die Suspension von 70 Millilitern SC zwei und die Leberstücke mit 50 Millilitern Protease E Kollagenase P-Lösung. Fügen Sie einen Milliliter DNA und eine Lösung hinzu und verdauen Sie die Leber 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius unter Rühren.

Nach enzymatischer Verdauung des Lebergewebes werden die Sternzellen durch Dichtegradientenzentrifugation von anderen Leberzelltypen getrennt. Um dieses Verfahren zu starten, filtrieren Sie die Zellsuspension durch 70-Mikrometer-Zellsiebe in sechs 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen und waschen Sie die Zellen mit einer Ez-Zwei-Puffer-Zentrifuge für 10 Minuten bei 600 G und vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation werden vorsichtig 40 Milliliter des Überstands aus jedem Röhrchen abgesaugt.

Geben Sie dann 150 Mikroliter DNA, eine Lösung in jedes Röhrchen und resuspendieren Sie die Zellen. Die Zellsuspensionen in vier 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen geben und 10 Minuten lang mit G-B-S-S-P-Zentrifuge bei 600 g und vier Grad Celsius waschen. Saugen Sie vorsichtig so viel Überstand wie möglich an, ohne das Pellet zu stören, und fügen Sie 150 Mikroliter DNA, eine Lösung in jedes Röhrchen, hinzu.

Wir suspendieren die Zellpellets in 10 Millilitern G-B-S-S-B pro Röhrchen. Poolen Sie die Zellen in zwei 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen und fügen Sie G-B-S-S-B zu einem Gesamtvolumen von 36 Millilitern pro Röhrchen hinzu. Geben Sie 14 Milliliter Den-Lösung in jedes Röhrchen und mischen Sie gut.

Als nächstes werden 10 Milliliter der Zellsuspension in ein 12-Milliliter-Gradientenzentrifugationsröhrchen überführt, was zu insgesamt 10 Röhrchen führt. Überlagern Sie die Zellsuspension vorsichtig mit 1,5 Millilitern G-B-S-S-B pro Tube. Zentrifugieren Sie die Gradienten 15 Minuten lang bei 1500 G und vier Grad Celsius ohne Pause.

Anschließend werden die Hepatozyten am Boden des Röhrchens pelletiert, während sich Sternzellen in der Grenzfläche als weißer Ring befinden. Entnehmen Sie mit einer Fünf-Milliliter-Pipette vorsichtig die Grenzfläche, die die Sternzellen enthält, und geben Sie sie in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von G-B-S-S-B und Zentrifusion für 10 Minuten bei 600 G und vier Grad Celsius.

Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 20 Millilitern DMEM mit Nahrungsergänzungsmitteln. Nach dem Zählen der Zellen werden sie in Gewebekulturflaschen mit einer Konzentration von zwei mal 10 der vierten Zellen pro Quadratzentimeter überführt, die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert. Etwa zwei Stunden nach ihrer Herstellung sollten die hepatischen Sternzellen adhäriert sein, das Medium wechseln, um abgestorbene Zellen und Zelltrümmer abzuwaschen.

Bringen Sie die Zellen wieder in den Inkubator zurück, repräsentative Ergebnisse der Präparation von Lebern aus Mäusen unter Verwendung dieses Protokolls. Die Zellen am ersten und dritten Tag der In-vitro-Kultur zeigen die charakteristische Morphologie der hepatischen Sternzellen. Sie haben die Form von astro-Flechten und weisen eine Speicherung von Lipidvesikeln auf.

An den Kernstellen kann die Reinheit der isolierten hepatischen Sternzellen auch durch die Expression von glialfibrillärem saurem Protein oder GFAP verifiziert werden. Diese Bilder zeigen eine repräsentative Immunfluoreszenzfärbung für GFAP in rot dargestellten Lebersternzellen, die nach der Zellisolierung drei Tage lang kultiviert wurden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Lebersternzellen aus der Neuronenleber isoliert werden können, um eine ausreichende Ausbeute an reinen Sternzellen zu erzielen.

Es ist wichtig, eine effiziente Verdauung nach der Leberperfusion zu gewährleisten. Schließlich ist es wichtig, die richtige Einheit der isolierten Zellen zu bestimmen, indem die Morphologie und der Phänotyp der hepatischen Dal-Zellen beurteilt werden.