Seven Steps to Cells Stellate

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, hepatische sternförmige Zellen aus der Mausleber zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine zweistufige Perfusion der Mauslebern mit Verdauungsenzymen durchgeführt wird. Nach der Perfusion werden die Lebern in kleine Stücke geschnitten, um die Effizienz der anschließend durchgeführten in-vitro-Verdauung zu erhöhen.

Im letzten Schritt werden die hepatischen Sternzellen durch Dichtegradientenzentrifugation von anderen Leberzelltypen getrennt. Letztendlich werden hepatische Sternzellen gewonnen, und ihre Reinheit kann mittels Licht- und Immunfluoreszenzmikroskopie überprüft werden. Das Verfahren wird Patrick Meyer, ein Doktorand aus einem Labor, demonstrieren. Zur Vorbereitung der NC zwei Perfusion von Mauslebern erwärmen Sie zunächst den SC-eins-Puffer und die Enzymperfusionslösungen in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad.

Als Nächstes richten Sie die peristaltische Pumpe so ein, dass ein laminarer Fluss von 6,5 Milliliter pro Minute erzielt wird, und equilibrieren Sie den Silikonschlauch der Pumpe mit SC-Eins-Lösung. Überprüfen Sie nun, ob die anästhetisierte Maus tief sediert ist, indem Sie das Fehlen von Reflexen bestätigen. Befestigen Sie dann die Maus in Rückenlage auf einer geeigneten Unterlage.

Verwenden Sie eine Schere und eine Pinzette, um einen Längsschnitt in der Bauchhaut vorzunehmen und das Peritoneum freizulegen. Öffnen Sie das Peritoneum vorsichtig und verschieben Sie die Därme aus der Bauchhöhle auf die linke Seite des Tieres, um die Pfortader freizulegen. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist die Zeto-Perfusion der Lebern mit Verdauungsenzymen, die im Folgenden demonstriert wird.

Als Nächstes ist es wichtig, beim Einführen der Kanüle ein Stereomikroskop zu verwenden und die Veränderungen in der Leberstruktur während der Perfusion genau zu überwachen. Unter dem Stereomikroskop die Kanüle des Infusionssets in die Pfortader einführen. Die Perfusion der Leber mit 30 Milliliter SC-One-Lösung starten. Unmittelbar nach Einleitung des Flusses die Vena cava inferior öffnen.

Ein erfolgreicher Durchspülungsprozess der Leber zeigt sich durch eine Entfärbung des Lebergewebes. Danach spülen Sie die Leber mit 30 Milliliter Pronase-E-Lösung durch. Die Leberlappen schwellen an, und die Lobuli werden nach der Durchspülung mit Pronase-E-Lösung deutlich durch die Kapsel hindurch sichtbar, gefolgt von einer Perfusion mit 30 Milliliter Kollagenase-P-Lösung. Sobald die Perfusion mit Kollagenase P abgeschlossen ist, entnehmen Sie die Leber aus der Maus, indem Sie sie vorsichtig vom Zwerchfell und den umliegenden Organen ablösen, und lagern sie in 70 Milliliter SC-2-Lösung auf Eis.

Die Leber hat an diesem Punkt ihre Form verloren und erscheint atonisch und formlos. Das Verfahren zur Verdauung von Mauslebern sollte unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. In einer laminarer Luftstromwerkbank.

Verwenden Sie eine scharfe Schere, um die Lebern in Stücke von etwa zwei mal zwei mal zwei Kubikmillimetern zu schneiden. Anschließend mischen Sie die Suspension aus 70 Milliliter SC zwei und den Leberstücken mit 50 Milliliter Protease E-Kollagenase P-Lösung. Geben Sie ein Milliliter DNAase I-Lösung hinzu und verdauen Sie die Lebern 20 Minuten bei 37 Grad Celsius unter Rühren.

Nach der enzymatischen Verdauung des Lebergewebes werden die Sternzellen durch Dichtegradientenzentrifugation von anderen hepatischen Zelltypen getrennt. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Zellsuspension durch 70-Mikrometer-Zellsiebe in sechs 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen filtrieren und die Zellen mit Puffer E2 waschen. Zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 600 × g und 4 °C. Nach der Zentrifugation pipettieren Sie vorsichtig 40 Milliliter des Überstandes aus jedem Röhrchen ab.

Gegeben Sie dann 150 µL DNA's One-Lösung zu jedem Röhrchen hinzu und resuspendieren Sie die Zellen. Sammeln Sie die Zellsuspensionen in vier 50-mL-Falcon-Röhrchen und waschen Sie sie durch Zentrifugation mit G-B-S-S-P 10 Minuten bei 600 ×g und 4 °C. Aspirieren Sie vorsichtig so viel wie möglich vom Überstand, ohne das Pellet zu stören, und geben Sie 150 µL DNA's One-Lösung zu jedem Röhrchen hinzu.

Wir suspendieren die Zellpellets in 10 Milliliter G-B-S-S-B pro Röhrchen. Sammeln Sie die Zellen in zwei 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen und geben Sie G-B-S-S-B bis zu einem Gesamtvolumen von 36 Milliliter pro Röhrchen hinzu. Geben Sie 14 Milliliter Den-Lösung zu jedem Röhrchen hinzu und mischen Sie gründlich.

Überführen Sie anschließend 10 Milliliter der Zellsuspension in eine 12-Milliliter-Gradientenzentrifugenröhre, sodass insgesamt 10 Röhrchen entstehen. Überlagern Sie die Zellsuspension vorsichtig mit jeweils 1,5 Milliliter G-B-S-S-B pro Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Gradienten 15 Minuten lang bei 1500 ×g und vier Grad Celsius ohne Bremse.

Anschließend sedimentieren die Hepatozyten am Boden des Reaktionsrohrs, während sich die Sternzellen als weißer Ring an der Phasengrenze befinden. Mit einer fünf Milliliter-Pipette vorsichtig die Phasengrenze mit den Sternzellen abnehmen und in ein 50 Milliliter-Röhrchen überführen. Die Zellen durch Zugabe von G-B-S-S-B waschen und zehn Minuten bei 600 Gs und vier Grad Celsius zentrifugieren.

Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 20 Milliliter DMEM mit Zusätzen. Nach der Zellzählung überführen Sie die Zellen in Zellkulturgefäße mit einer Konzentration von zwei mal 10 hoch vier Zellen pro Quadratzentimeter und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Etwa zwei Stunden nach ihrer Herstellung sollten die hepatischen Sternzellen angeheftet sein; wechseln Sie das Medium, um tote Zellen und Zelltrümmer zu entfernen.

Bringen Sie die Zellen in den Inkubator zurück. Typische Ergebnisse der Gewinnung von hepatischen sternförmigen Zellen aus Mauslebern mit diesem Protokoll werden hier gezeigt. Zellen am ersten und dritten Tag der In-vitro-Kultur zeigen die charakteristische Morphologie hepatischer sternförmiger Zellen. Sie sind sternförmig geformt und weisen die Speicherung von Lipidvesikeln auf.

An perinukleären Stellen kann die Reinheit der isolierten hepatischen Sternzellen auch durch die Expression des glialen fibrillären sauren Proteins oder GFAP überprüft werden. Diese Bilder zeigen eine repräsentative immunfluoreszenzfarbliche Färbung für GFAP, dargestellt in Rot, in hepatischen Sternzellen, die nach der Zellisolierung drei Tage lang kultiviert wurden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie hepatische Sternzellen aus Neuronenleber für eine ausreichende Ausbeute an reinen Sternzellen isoliert werden können.

Es ist wichtig, eine effiziente Verdauung während der Leberperfusion sicherzustellen. Schließlich ist es entscheidend, die geeignete Entität der isolierten Zellen durch Beurteilung der Morphologie und des Phänotyps der hepatischen Dal-Zellen zu bestimmen.