Name: Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Lernen Sie die GMP-konforme Herstellung multivirusspezifischer zytotoxischer T-Lymphozyten zur Immuntherapie nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Diese Methode ermöglicht eine schnelle und kosteneffiziente CTL-Expansion.

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Diese Arbeit wird von einer Produktion Assistance for Cellular Therapies (Vertrag NIH-NHLBI (HB-10 bis 03) HHSN26820100000C) (CMR), eine spezialisierte Zentren für Zell-basierten Therapie unterstützt Zuschuss NIH-NHLBI 1 U54 HL081007 (CMR), ein ASBMT Young Investigator Award (UG und JV), ein Leukemia and Lymphoma Society Special Fellow in Clinical Research Award (UG), und eine Amy Strelzer Manasevit Scholar Award (AML).

1. DC Nukleofektion <ol><li> Ernte Monozyten-abgeleiteten DCs, die angereichert sind mit Kunststoff-Haftung, für 5 Tage mit Zell Genix Medien mit IL4 (1000U/ml) ergänzt, GMCSF (800IU/ml) und weitere 24 Stunden lang mit dem DC-Reifung Zytokine IL4 (1000U gereift kultivierten / ml), GMCSF (800IU/ml), IL6100ng/ml, TNF-α 10ng/ml, IL1-β 10ng/ml und PGE2 (1μg/ml) 1, durch vorsichtiges Resuspendieren mit 3ml Transferpipette. </li><li> Graf lebensfähig DCs mit Trypanblau, Transfer in 3x 15ml Röhrchen mit nicht weniger als 0.5x10 6 und nicht mehr als 2x10 6 Zellen / Röhrchen. </li><li> Centrifuge DCs für 10 Minuten @ 200g. 2ml/well in drei Wells einer 12-well Zellkultur behandelte Platte in einem 37 ° C / 5% CO 2-Inkubator - Während dieser Zeit vorwärmen Zelle Genix Medien mit der DC-Reifung Zytokine (DC Reifung media) ergänzt. </li><li> Sobald Zellen fertig sind Spinnen, saugen Sie den Überstand und fügen Sie die entsprechende DNA-Plasmide zu jedem der Rohre in einer finalen Konzentration von 5μg DNA / Rohr. In diesem Fall fügen Sie die Plasmid-Kodierung IE1-pp65 zu Rohr Nr. 1, Hexon-Penton zu Rohr Nr. 2 und EBNA1-LMP2-BZLF1 zu Rohr Nr. 3. </li><li> Resuspendieren DCs und DNA mit 100 &amp;mgr; l der Amaxa nucloefection verdünnen, gut mischen und Transfer zum Nukleofektion Küvetten. </li><li> Legen Sie Küvetten in der 4D Nucleofector, wählen Sie Programm CB150 (Amaxa / Lonza), und drücken Sie Start. </li><li> Unmittelbar nach Nukleofektion 500μl der 2ml vorgewärmten Zelle Genix DC Reifung Medien in die Küvette hinzu, mischen Sie vorsichtig durch Auf-und Abpipettieren 2-3 mal, und übertragen nucleofected DCs auf die vorbereitete 12-Well-Platte mit den restlichen 1,5 ml vorgewärmtem DC Reifung Medien. Transfer zum 37 ° C / 5% CO 2-Inkubator für eine weitere 12-18h. </li></ol> 2. T-Zell-Stimulation <ol><li> Ernte und zählen nucleofected DCs, und bestrahlen bei 30 Gy. Wash einmal mit 10 ml CTL-Medium (45% RPMI, 45% Klicks EHAA, 10% FBS, 2 mM Glutamax) und resuspendieren @ 3 x 10 5 DCs pro ml CTL Medien. </li><li> Pool ein Minimum von 7.5x10 5 (2,5 ml) und einem Maximum von 15x10 5 (5 ml) der DCs mit jedem der Plasmide und Transfer der gepoolten DCs auf die G-Rex Gerät, das dann in den Inkubator platziert werden. </li><li> Für die Herstellung der Responder-Zellen entweder vorher eingefroren PBMCs oder nicht haftende mononukleären Zellen, die nach dem DC-Auswahl (Einhaltung oder CD14 Auswahl) bleiben. Thaw die Zellen, um vorgewärmte Kulturmedium übertragen, einmal abwaschen mit CTL-Medien. Resuspendieren der Zellen in CTL Media, zählen die Zellen und bringt sie zu einer Konzentration von 2x10 6 Zellen pro ml. Nehmen 15x10 6 Zellen oder 7,5 ml und ergänzen mit 30000U IL4 (1000U/ml -. Endkonzentration) und 300ng IL7 (10ng/ml - Endkonzentration.). </li><li> Transfer 7.5ml von PBMC (15x10 6 Zellen), die G-Rex und Aufstockung des Bioreaktors mit CTL Medien bis zu einem Gesamtvolumen von 30ml. </li><li> Kultur der G-Rex für 6-7 Tage in einem 37 ° C / 5% CO 2 befeuchteten Inkubator. </li></ol> 3. T-Zell-Expansion <ol><li> Am Tag 6-7, absaugen 10ml von Medien, dann mischen die Zellen in den verbleibenden 20 ml Medium mit 10ml Pipette und zählen lebensfähigen Zellen unter Verwendung von Trypanblau. Wenn es &lt;50x10 6 mit frischen Medien + Zytokine aufzufüllen. Wenn es&gt; 50x10 6 Zellen zu entfernen 10ml Zellsuspension, um eine neue G-Rex zu übertragen, und dann füttern beide G-Rexs mit frischen CTL media + Zytokine. </li><li> Kultur für weitere 4-6 Tage. Sobald genügend Zellen wurden erweitert, führen phänotypische und funktionelle Charakterisierung der CTL und Kryokonservierung überschüssiger für die zukünftige Verwendung. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Eine schematische Darstellung unserer FDA-Zulassung multivirus-spezifischen CTL-Generation ist in Abbildung 1 dargestellt. Im Gegensatz zu Konventionen multivirus CTL-Protokolle, die Adenovektoren und EBV-LCL verwenden, um Virus-reaktiven T-Zellen zu stimulieren 2 haben wir infektiösen Virus-Material mit DNA-Plasmiden ersetzt dass kodieren mehrere Antigene aus jedem der Viren 3 abgeleitet. Zur Stimulierung trivirus CTL wir entwarf drei multicistronischen Plasmiden Hexon und Penton von Adenovirus, IE1 und pp65 von CMV und EBNA1, LMP2 und BZLF1 des EBV. Diese Antigene wurden auf der Grundlage ermutigenden klinischen Ergebnisse unserer eigenen und anderer Gruppen zeigen, dass T-Zellen gegen Adv-Hexon und Penton 2,4-6 gerichtet, und CMV-1E1 und CMV-pp65 sind Schutzmaßnahmen in vivo 7 gewählt. Für EBV ist EBNA1 ein immundominantes CD4 + T-Zell-Target-Antigen in allen EBV-assoziierten Tumoren und in normalen EBV-infizierten B-Zellen exprimiert 8,9, LMP2 immunogen ist über mehrere HLA-Typen und ausgedrückt in den meisten EBV Malignome, 10,11, während BZLF1 kodiert für ein immundominante, immediate early lytischen Zyklus Antigen, das sowohl CD4 + und CD8 + T-Zellen stimuliert von den meisten Menschen und ist wahrscheinlich wichtig für die Zusammenarbeitntrol von Zellen replizieren Virus 12. Zur weiteren Optimierung unserer Fertigung Methoden, die wir in Zusammenarbeit mit Nature-Technologie, die minimalized, Antibiotika-freien (FDA-konform) Plasmide für CTL Stimulation 13,14 erzeugt. Mit dieser Strategie setzen wir konsequent erreichen Nukleofektion Wirkungsgrade von&gt; 35% unter Beibehaltung der hohen Zellvitalität (Daten nicht gezeigt) 3. Abbildung 2 zeigt, dass die Häufigkeit von Virus-spezifischen T-Zellen als Reaktion auf optimierten DNA-Plasmide wie IFNy ELIspot gemessen, größer war als Reaktion auf herkömmliche pShuttle-basierten Expressionsplasmiden Ausdruck der gleichen Antigene (n = 8 Adenovirus, n = 4 CMV, und n = 2 EBV). Das optimale Verhältnis von DC: PBMC wurde für potente T-Zell-Stimulation, wie in Abbildung 3, wo ein Verhältnis von 1:50 produziert sub-optimale Aktivierung im Vergleich zu einer 1:20 S gezeigt wichtig: R-Verhältnis (n = 2 Geber). Produktion von ausreichenden CTL Zahlen mit breiten Antigen-Spezifität ist eine Voraussetzung für die klinische Wirksamkeit gegen alle drei Viren. Dies wird durch CTL Kultur in der G-Rex, der überlegene T-Zell-Expansion unterstützt im Vergleich zu herkömmlichen 24-Well-Platten (Abbildung 4A) 15 erreicht, während die Zugabe von IL4 und IL7 die Kulturen steigt das Repertoire und Spezifität, wie in Abbildung 4B dargestellt wobei die Frequenz von T-Zellen reaktiv gegen das CMV-pp65-derived HLA-A2 resticted NLV Peptid wurde in Kulturen in der Gegenwart oder Abwesenheit von IL-4 und / oder IL7 16,17 generiert beurteilt. Zur Beurteilung der Phänotyp und funktionellen Kapazität der expandierten Zellen führen wir durchflusszytometrische Analyse intrazellulärer Zytokin-Färbung / IFNy ELIspot und Cr 51 Release Assays, die auf das Endprodukt für die Kryokonservierung / Infusion. Typischerweise werden die erzeugten Zellen sind polyklonale mit einer gemischten Bevölkerung von CD4 + und CD8 + T-Zellen mit Antigen-Spezifität nachweisbar in beiden T-Zell-Kompartimenten. Die CTL sind in der Lage, virale Antigen-exprimierenden Zielzellen töten, aber nicht negativ Virus teilweise HLA abgestimmt Zielen unter Angabe, dass sie nicht veranlassen Graft-versus-Host Erkrankung (GvHD) in vivo (Abbildung 5). <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. RCTL Generation-Protokoll. Erstens sind DCs mit dem viralen Antigen-kodierenden Plasmiden nucleofected und anschließend mit autologen PBMCs bei einem R: S 10 oder 20:1. Die Zellen werden in der G-Rex für 10-14 Tage in Gegenwart von IL4 und IL7, dann geerntet, gezählt, funktionsgeprüft, Identität und Sterilität, und dann für den klinischen Gebrauch kryokonserviert erweitert. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Optimized DNA-Plasmide bewirken überlegene T-Zell-Aktivierung in vitro. DCs wurden mit einer optimierten, FDA-konforme Plasmiden Hexon und Penton (Adv), IE1 und pp65 (CMV), und EBNA1, LMP2 und BZLF1 (EBV) oder konventionelle pShuttle Plasmiden die gleichen Antigene nucleofected. Diese wurden verwendet, um T-Zellen zu stimulieren und Spezifität wurde durch IFNy ELIspot 10 Tage post-Stimulation untersucht. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3 Optimale DC:. T-Zell-Verhältnisse für CTL-Aktivierung. DCs von 2 Spendern wurden mit allen drei optimierten Plasmiden nucleofected und dann zur autologen PBMCs um 1:20 oder 1:50 DC stimulieren: PBMC-Verhältnis. Die Häufigkeit der reaktivierten T-Zellen wurde am Tag 10 nach IFNy ELIspot beurteilt. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. T-Zell-Expansion in den G-Rex mit Verbesserung Zytokine. Panel A zeigt die G-Rex-Gerät sowie CTL Auftritt auf dem Gas-Membran, durch Mikroskopie untersucht. Ein Vergleich zwischen Messsignaländerung in Konvention Gewebekultur behandelten Platten vs G-Rex erreicht wird ebenfalls angezeigt. Panel B zeigt die Häufigkeit von CMV-Pentamer positive CTL in Kulturen in der Gegenwart keine Zytokin, IL4 allein IL7 allein und IL4 + IL7 erweitert erreicht. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Phänotyp und Funktion erweitert CTL. Panel A zeigt ein repräsentatives Beispiel für den Phänotyp des erweiterten multivirus CTL, die polyklonale mit einer Mischung aus CD4 + (45% - Helfer) und CD8 + (42% - zytotoxische) T-Zellen, von denen die Mehrheit (95%) äußerte die Merker CD45RO + / CD62L +. Panel B zeigt, dass diese Zellen, die für alle die stimulierende Antigene sind und polyfunktionellen als durch intrazelluläre Zytokin-Färbung beurteilt, die Produktion von IFN &amp;ggr; und TNF nach Antigen-Stimulation zu erkennen. Panel C zeigt, dass die erweiterte CTL funktional wie gemessen werden von Cr 51-Assay. Autologe LCL, entweder allein oder transduziert mit einem Null-Vektor oder einem adenoviralen Vektor, CMV-pp65 wurden als tar verwendetbekommt. Alloreaktivität wurde mittels allogener PHA Blasten als Ziel.

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Juan F. Vera ist als Berater für Wilson Wolf Manufacturing. Die anderen Autoren haben keine entsprechenden Angaben.

Virale Infektionen entfallen erhebliche Morbidität und Mortalität bei Patienten, die durch ihre Krankheit oder deren Behandlung immunsupprimierten. Nach HSCT, sind zum Beispiel Infektionen, die durch anhaltende Herpesviren wie EBV und CMV sowie durch respiratorische Viren wie Respiratory Syncytial Virus (RSV) hervorgerufen, bekannt, während die Bedeutung von Infektionen durch Adv, BK-Virus verursacht, und die menschliche Herpesvirus (HHV) -6 wurden in jüngerer Zeit gewürdigt worden. Während pharmakologische Wirkstoffe Standard-Therapie für einige Infektionen sind, haben sie erhebliche Nebenwirkungen erzeugen resistente Varianten, und sind häufig wirkungslos. Im Gegensatz dazu haben virus-spezifischen T-Zellen aus Stammzellen Spender stammen nachweislich sicher und wirksam für die Prävention und Behandlung von viralen Infektion oder Erkrankung in den blutbildenden Stammzellentransplantation (HSCT) Einstellung 2,5,6,18-21. Allerdings ist die breitere Umsetzung von T-Zell-Immuntherapie letztlich durch die Kosten, Komplexität und Zeit für CTL Produktion erforderliche Maß beschränkt. Unsere neuartige und schnelle Annäherung an multivirus CTL, in der aktuellen Manuskript beschrieben, erzeugen sollte deutlich erhöhen die Machbarkeit von zytotoxischen T-Zell-Therapeutikum für Viruserkrankungen, so dass die Strategie zu einem Standard in der Versorgung der immungeschwächten Host geworden. Die Verwendung von Plasmid nucleofected DCs als APCs ermöglicht Antigen-Präsentation auf beiden MHC-Klasse I und II ohne Konkurrenz durch virale Vektoren oder auch von mehreren viralen Antigenen, die innerhalb einer einzelnen Zelle zum Ausdruck, da verschiedene DC-Populationen für jedes Plasmid 3 sind eingesetzt. Die Verwendung von IL-7.4 erhöht T-Zell-Überleben und die Proliferation, die entsprechend trägt zur Steigerung der Frequenz und des Repertoires zu reagieren Antigen-spezifischen T-Zellen 16,17. Schließlich, Kultur in der G-Rex drastisch reduziert T-Zell-Apoptose während der Kultur. Der Gasaustausch (O 2 und CO 2 in out) tritt über eine gasdurchlässige Silikonmembran am Boden der Flasche und verhindert Hypoxie und ermöglicht eine größere Tiefe des Mediums über den Zellen, die mehr Nährstoffe und Verdünnen Abfallprodukte. Diese Plattform kann auch zusätzliche Viren als wenn schützende Antigene identifiziert erweitert werden.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> CellGenix </td><td> CellGenix </td><td> 2005 </td></tr><tr><td> IL4 </td><td> R + D Systems </td><td> 204-IL/CF </td></tr><tr><td> IL7 </td><td> PeproTech </td><td> 200-15 </td></tr><tr><td> Hyclone RPMI 1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30096.01 </td></tr><tr><td> Humanem AB-Serum </td><td> Tal Biomedical Inc. </td><td> HP1022 </td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Amaxa / Lonza </td><td> AAF-1001B &amp; AAF-1001X </td></tr><tr><td> Nucleofection Kit </td><td> Amaxa / Lonza </td><td> V4XP-3012 </td></tr><tr><td> Plasmide </td><td> NTC </td><td> n / a </td></tr><tr><td> GM-CSF </td><td> R &amp; D </td><td> 215-GM/CF </td></tr><tr><td> IL1 </td><td> R &amp; D </td><td> 201-LB-025 </td></tr><tr><td> IL6 </td><td> R &amp; D </td><td> 206-IL-CF </td></tr><tr><td> TNF </td><td> R &amp; D </td><td> 210-TA-010 </td></tr><tr><td> PGE2 </td><td> Sigma </td><td> P6532-1MG </td></tr><tr><td> G-Rex </td><td> Wilson Wolf Fertigung </td><td> AY11-00027 </td></tr></tbody></table>

generierung von multivirus-spezifischen t-zellen zu verhindern / zu behandeln virale infektionen nach allogenen hämatopoetischen stammzelltransplantation

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Virale Infektionen verursachen Morbidität und Mortalität in allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) Empfänger. Wir und andere haben erfolgreich erzeugt und infundiert T-Zellen spezifisch für Epstein Barr Virus (EBV), Cytomegalovirus (CMV) und Adenovirus (Adv) mit Monozyten und EBV-transformierten lymphoblastische Zellen (EBV-LCL) mit einem Adenovirus-Vektor-Gen-modifiziert Antigen-präsentierende Zellen (APC). So wenig wie 2x10 5 / kg trivirus-spezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) durch mehrere Protokolle nach der Infusion vermehrt und erschien zur Vorbeugung und Behandlung sogar schwere Viruserkrankung beständig zu anderen verfügbaren Therapien. Vorbereitung - Der breiter gefasste Umsetzung dieser ermutigenden Ansatz wird durch die hohen Produktionskosten, die Komplexität der Herstellung und der längere Zeit (insgesamt 10-14 Wochen 4-6 Wochen für die EBV-LCL-Generation, und 4-8 Wochen für CTL Herstellung) begrenzt. Um diese Einschränkungen zu überwinden haben wir eine neue, GMP-konforme Produktion CTL-Protokoll entwickelt. Erstens, an Stelle des Adenovektoren auf T-Zellen verwenden wir dendritische Zellen (DCs) mit DNA Plasmiden LMP2, EBNA1 und BZLF1 (EBV), Hexon und Penton (Adv) und pp65 und IE1 (CMV) als Antigen-präsentierende nucleofected stimulieren Zellen. Diese APCs aktivieren T-Zellen spezifisch für alle stimulierenden Antigenen. Zweitens, die Kultur von aktivierten T-Zellen in Anwesenheit von IL-4 (1.000 U / ml) und IL-7 (10ng/ml) erhöht und erhält das Repertoire und die Häufigkeit von spezifischen T-Zellen in unseren Linien. Drittens haben wir eine neue, gasdurchlässige Kultur-Gerät (G-Rex), dass die Expansion und das Überleben der großen Zellzahlen fördert nach einer einzigen Stimulation, wodurch der Bedarf an EBV-LCL und die Verringerung der Techniker Intervention verwendet. Durch die Umsetzung dieser Veränderungen können wir jetzt produzieren multispezifische CTL Targeting EBV, CMV, und Adv zu einem Preis pro 10 6 Zellen, die von&gt; 90% reduziert wird, und in nur 10 Tagen statt 10 Wochen mit einem Ansatz, um zusätzliche verlängert werden kann Schutz virale Antigene. Unsere von der FDA zugelassene Ansatz sollte der Wert für die prophylaktische Behandlung und Anwendungen für ein hohes Risiko einer allogenen HSCT Empfängern werden.

Eine schnelle, einfache und kostengünstige Protokoll für die Erzeugung von Spender-derived multivirus-spezifische CTLs (RCTL) zur Infusion einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) Empfänger die Gefahr der Entwicklung CMV, Adv. oder EBV-Infektionen. Dieses Herstellungsverfahren ist GMP-konform und sollte die breitere Umsetzung von T-Zell-Immuntherapie über spezialisierte Zentren zu gewährleisten.

Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Virusinfektionen führen zu Morbidität und Mortalität bei Empfängern allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantationen (HSCT). Wir und andere haben erfolgreich ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, schnell spenderspezifische, virus-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten oder CTLs zu erzeugen, die für die adoptive Übertragung auf allogene Empfänger von hämatopoetischen Stammzelltransplantaten oder HSCT geeignet sind. Dies wird erreicht, indem man zunächst dendritische Zellen oder DCs mittels Plasmide, die virale Antigene kodieren, nukleofiziert, um die Zellen für die Antigenpräsentation zu sensibilisieren. In einem zweiten Schritt werden die nukleofizierten DCs verwendet, um antigenspezifische T-Zellen zu stimulieren, die anschließend in Gegenwart von IL-4 und IL-7 in einer gasdurchlässigen Kulturgefäßvorrichtung, einem sogenannten GRE, expandiert werden.Anschließend werden die Zellen nach sieben Tagen Kultur geteilt und verdünnt, und das Kulturmedium wird erneuert, um eine maximale in-vitro-Expansion der CTL aufrechtzuerhalten. Schließlich werden die Zellen am Tag 12 gewonnen und auf Reinheit, Wirksamkeit und Sicherheit getestet sowie für die anschließende klinische Anwendung kryokonserviert. Letztendlich lassen sich CTL-Linien mit Multivirus-Spezifität und minimaler alloreaktiver Aktivität erzeugen, wie durch intrazelluläre Zytokinstainings, Interferon-gamma-Produktion und Zytotoxizität belegt wird.Die Herstellung von multivirusspezifischen zytotoxischen T-Zelllinien ist zeitaufwändig und umständlich. Sie erfordert die Verwendung von EBV-transformierten B-Zelllinien (EP Epstein-Barr-Virus) und adenoviralen Vektoren, und das Verfahren dauert etwa drei Monate. Unsere neue Methode verwendet keine viralen Vektoren.Die Zellen wachsen in Kultur exponentiell mit minimalem Zellverlust, weshalb das Verfahren schnell und kosteneffizient ist. Demonstriert wird dieses Verfahren von Eureka Gerdeman, einer klinischen Assistentin im Labor. Ernte monocytenstammende DCs, die in Cellgenic-Medien ergänzt mit IL-4 und G-M-C-S-F generiert wurden, und reife sie dann 24 Stunden in Reifungszytokinen durch sanftes Aufschwemmen mit einer 3-Milliliter-Transferpipette. Verwende Trypanblau, um die DCs zu zählen, und überführe sie anschließend in drei 15-Milliliter-Röhrchen mit nicht weniger als 0,5 × 10⁶ und nicht mehr als 2 × 10⁶ Zellen pro Röhrchen.Zentrifugieren Sie danach das DCS 10 Minuten lang bei 200 × g. Bereiten Sie in dieser Zeit sechs Milliliter Cell-Genix-Medien vor, die mit dem gleichen DC-Maturations-Zytokingemisch wie zuvor ergänzt wurden, und geben Sie zwei Milliliter in drei Vertiefungen einer 12-Loch-Zellkulturplatte. Füllen Sie die ungenutzten Vertiefungen mit je zwei Millilitern steriler Wasser. Überführen Sie die Platte in einen Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2, um sie vorzuwärmen.Nachdem die Zellen fertig zentrifugiert wurden, entfernen Sie die Überstände und geben Sie die entsprechenden DNA-Plasmide in jedes Reagenzglas bei einer Endkonzentration von fünf Mikrogramm DNA pro Gefäß hinzu. Hier wird das Plasmid, das IE1-PP65 kodiert, in Reagenzglas Nummer eins gegeben, Penton in Reagenzglas Nummer zwei und EBNA1-LMP2-BZLF1 in Reagenzglas Nummer drei. Suspendieren Sie die DCs und die DNA in 100 Mikrolitern Nukleofektionslösung.Sorgfältig mischen und die Mischung in NU Kernaffektionsküvetten überführen. Die Küvetten in den vier D-Nukleoeffektor stellen. Programm CB eins 50 auswählen und unmittelbar nach der Kernaffektion starten.Fügen Sie 500 µL des vorgewärmten CELLGENIC-DC-Maturierungsmediums zu jedem Vial hinzu, mischen Sie die Zellen durch vorsichtiges zweimaliges bis dreimaliges Auf- und Abpipettieren und überführen Sie die nukleinsäuretransfizierten DCs in die vorbereitete 12-Loch-Platte, die die restlichen 1,5 mL vorgewärmten DC-Maturierungsmediums enthält. Überführen Sie die Platte für weitere 12 bis 18 Stunden in den Inkubator, ernten und zählen Sie anschließend die nukleinsäuretransfizierten DCs, waschen Sie die Zellen einmal mit 10 mL CTL-Medium und resuspendieren Sie sie anschließend mit 3 × 10⁵ DCs pro mL Medium. Poolsen Sie mindestens 7,5 × 10⁵ oder 2,5 mL und maximal 15 × 10⁵ oder 5 mL der DCs aus allen drei Nukleinsäuretransfektionen und überführen Sie die gepoolten, plasmidtransfizierten DCs in die G-Rex-Vorrichtung.Bringen Sie das Gerät dann zum Inkubator, um die Respondierzellen vorzubereiten. Verwenden Sie die nicht-adhärenten mononukleären Zellen, die nach der DC-Auswahl verbleiben. Überführen Sie die Respondern in die vorgewärmte Kulturlösung.Waschen Sie sie einmal mit CTL-Medium. Suspendieren Sie die Zellen in CTL-Medium. Zählen Sie die Zellen und stellen Sie sie auf eine Konzentration von zweimal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter ein.Nehmen Sie 15 mal 10 hoch 6 Zellen oder 7,5 Milliliter und ergänzen Sie mit den Zytokinen IL-4 und IL-7. Überführen Sie 7,5 Milliliter PBMC in den G Rex und ergänzen Sie den Bioreaktor mit CTL-Medium auf ein Gesamtvolumen von 30 Millilitern. Stellen Sie abschließend den G REX sechs bis sieben Tage lang in den Inkubator; am Tag sechs bis sieben aspirieren Sie 10 Milliliter des Mediums.Anschließend die verbleibenden 20 Milliliter Medium mit einer 10-Milliliter-Pipette mischen. Zur Zellzählung Tripanblau verwenden, falls weniger als 50 × 10⁶ Zellen vorhanden sind. Die Kultur mit frischem Medium und Zytokinen auffrischen.Wenn mehr als 50 mal 10 hoch 6 Zellen vorhanden sind, entfernen Sie 10 Milliliter der Zellsuspension, überführen Sie die Zellen in einen neuen G rex und versorgen Sie beide G rex mit frischem CTL-Medium und Zytokinen. Kultivieren Sie die Zellen für weitere vier bis sechs Tage, um die Zellen in ausreichender Zahl zu vermehren, ernten und zählen Sie die Zellen. Anschließend kryokonservieren Sie alle Zellen, die nicht für phänotypische oder funktionelle Analysen verwendet werden, für zukünftige Zwecke. Repräsentative Ergebnisse zeigen, dass multizyklische DNA-Plasmide multi-virus-spezifische T-Zellen induzieren, gemessen mittels Interferon-gamma-ELISpot und die Frequenz reaktiver Zellen überlegen ist gegenüber Linien, die mit konventionellen PHU-Plasmiden, die dieselben Antigene exprimieren, generiert wurden.Das optimale Verhältnis von DC zu PBMC ist wichtig für eine potente T-Zell-Stimulation, wie in dieser Abbildung gezeigt, bei der ein Verhältnis von eins zu 50 eine suboptimale Reaktivierung im Vergleich zu einem Verhältnis von eins zu 20 (Stimulator zu Respondern) ergibt. Die CTL-Kultur im G rex ermöglicht, wie in dieser Abbildung zu sehen, eine überlegene T-Zell-Expansion im Vergleich zu herkömmlichen 24-Well-Platten. Die Zugabe von IL-4 und IL-7 zu den Kulturen erhöht das Repertoire und die Spezifität der expandierten Zellen, wie hier gezeigt, wobei die Häufigkeit von T-Zellen, die gegen das von CMV PP65 abgeleitete, HLA-A2-restriktive NLV-Peptid reagieren, in Kulturen bewertet wurde, die in Gegenwart oder Abwesenheit von IL-4 und/oder IL-7 generiert wurden. Diese Abbildung zeigt eine repräsentative Probe des Phänotyps der schnell expandierten multiviralen CTLs, die polyklonal sind und eine Mischung aus CD4-positiven und CD8-positiven T-Zellen aufweisen, wobei die Mehrheit die Gedächtnismarker CD45RO und CD62L exprimiert. Die expandierten CTLs sind spezifisch für alle stimulierenden Antigene und polyfunktional, wie hier durch intrazelluläre Zytokinstainung zur Detektion der Produktion von Interferon-γ und TNF-α nach Antigenstimulation sowie durch den Chromfreisetzungsassay bewertet.Die expandierten CTL können virale Zielstrukturen spezifisch abtöten, zeigen jedoch keine unspezifische Aktivität gegen nicht-virale HLA-Mismatch-Zielstrukturen, was eine entscheidende Sicherheitsüberlegung darstellt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mehrfach virus-spezifische zytotoxische T-Zelllinien schnell herstellt, die GMP-konform sind und sich für die adoptive Übertragung in Patienten mit virusassoziierten Erkrankungen eignen. Die Vereinfachung dieses Verfahrens sollte die Ausweitung über spezialisierte Herstellungseinrichtungen hinaus erleichtern und ermöglichen, dass das Verfahren zum Standard der Versorgung für immungeschwächte Patienten wird, die besonders anfällig für virusassoziierte Erkrankungen sind.

generation-multivirus-specific-t-cells-to-preventtreat-viral

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Papier beschreibt eine einfache Technik, um Alloantigen-spezifische Anergie in humanen peripheren mononukleären Zellen zu induzieren. Die Technik kann klinisch angewendet werden, um nicht alloreaktive Spenderzellen zu generieren. Infusion dieser Zellen verbessern könnte Immunrekonstitution und reduzieren Toxizität nach allogener Stammzelltransplantation.

Induktion von Alloantigen-spezifische Anergie in humanen peripheren mononukleären Zellen durch Alloantigen Stimulation mit Co-stimulatorische Signal Blockade

Hier beschreiben wir die erste Good Manufacturing Practice (GMP)-kompatiblen Verfahren zur Herstellung virus-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) aus Nabelschnurblut, eine Quelle von überwiegend naiven T-Zellen.

Ausbau zytotoxische T-Lymphozyten aus Nabelschnurblut, dass Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus und Adenovirus

Das Video zeigt einen Assay, bei dem von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleitete CD8+ T-Zellen verwendet werden, um die Replikation des Hepatitis-B-Virus (HBV) in Mäusen zu hemmen. Diese T-Zellen, die mit HBV-spezifischen Rezeptoren versehen sind, werden in transgene Mäuse übertragen. Replikationskompetente HBV-Genom-Plasmide werden dann direkt in die Leber injiziert und ermöglichen so die Aufnahme viraler DNA. Sobald virale Antigene exprimiert und von hybriden...

Unterdrückung der Hepatitis-B-Virusreplikation mit viralen Antigen-spezifischen T-Zellen

Neue Generationen von Funktionstests, wie Gamma-Interferon (IFN-γ) ELISpot, die Zytokin-Produktion zu erkennen an der Einzelzellebene und bieten sowohl quantitative und qualitative Charakterisierung der T-Zell-Reaktionen können zum Zell-vermittelten Immunantworten gegen Varicella-Zoster-gerichtet zu bewerten Virus (VZV).

Entwicklung eines IFN-γ ELISPOT-Assay zu beurteilen, Varicella-Zoster-Virus-spezifische Zellvermittelte Immunität nach Nabelschnurblut-Transplantation

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Erzeugung und Vermehrung von menschlichen T-Zell-Klonen, die spezifisch auf ein definiertes Alloantigen reagieren. Dieses Protokoll kann für die Klonierung menschlicher T-Zellen angepasst werden, die für eine Vielzahl von Peptid-MHC-Liganden spezifisch sind.

Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

Das Ziel dieses Protokolls ist es, pathogenspezifische T-Zellen in klinischer Qualität herzustellen, indem ein automatisiertes Zellanreicherungsgerät der zweiten Generation verwendet wird, das ein geschlossenes Zytokin-Capture-System enthält und kein spezielles Personal oder die Verwendung einer GMP-Einrichtung erfordert. Die erzeugten pp65-spezifischen T-Zellen des Cytomegalievirus können direkt an Patienten verabreicht werden.

Automatisierte Zellanreicherung des Cytomegalovirus-spezifischen T-Zellen für die klinische Anwendung mit der Zytokin-Capture-System

Dieses Protokoll beschreibt die Methoden zur Konstruktion eines humanisierten Knochenmark-/Leber-/Thymus-Mausmodells mit stammzellbasierter künstlicher Immunität gegen HIV-Infektionen.

Stammzellen Basierend Engineered Immunität gegen HIV-Infektion in der humanisierten Maus-Modell

Dieses Protokoll beschreibt einen detaillierten Workflow für die Generierung und ex-Vivo Charakterisierung von onkolytische Viren für den Ausdruck von Immunmodulatoren, Masern-Viren Codierung bispezifische T Zelle Engagers als Beispiel verwenden. Anwendung und Anpassung an andere Vektor-Plattformen und transgene beschleunigt die Entwicklung von neuartigen Immunovirotherapeutics für klinische Übersetzung.

Paramyxoviruses für Tumor-gezielte Immunmodulation: Gestaltung und Evaluation Ex Vivo

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Erzeugung funktioneller Tumorantigen-spezifischer induzierter pluripotenter Stammzell-abgeleiteterCD8- + einzelner positiver T-Zellen mit OP9/DLL1-Kokultursystem.

Verwendung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen T-Zellen

Hier wird ein Protokoll zur wirksamen Unterdrückung der Hepatitis-B-Virus -Replikation (HBV) bei Mäusen unter Verwendung des Adoptivzelltransfers (ACT) von Stammzell-abgeleitetem viralem Antigen (Ag)-spezifischen T-Lymphozyten vorgestellt. Dieses Verfahren kann für eine mögliche ACT-basierte Immuntherapie der HBV-Infektion angepasst werden.

Stammzell-abgeleitete virale Ag-spezifische T-Lymphozyten unterdrücken HBV-Replikation bei Mäusen

Lernen Sie die GMP-konforme Herstellung multivirusspezifischer zytotoxischer T-Lymphozyten zur Immuntherapie nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Diese Methode ermöglicht eine schnelle und kosteneffiziente CTL-Expansion.

Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (Video) | JoVE Journal

Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

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