Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, schnell spenderspezifische, virus-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten oder CTLs zu erzeugen, die für die adoptive Übertragung auf allogene Empfänger von hämatopoetischen Stammzelltransplantaten oder HSCT geeignet sind. Dies wird erreicht, indem man zunächst dendritische Zellen oder DCs mittels Plasmide, die virale Antigene kodieren, nukleofiziert, um die Zellen für die Antigenpräsentation zu sensibilisieren. In einem zweiten Schritt werden die nukleofizierten DCs verwendet, um antigenspezifische T-Zellen zu stimulieren, die anschließend in Gegenwart von IL-4 und IL-7 in einer gasdurchlässigen Kulturgefäßvorrichtung, einem sogenannten GRE, expandiert werden.

Anschließend werden die Zellen nach sieben Tagen Kultur geteilt und verdünnt, und das Kulturmedium wird erneuert, um eine maximale in-vitro-Expansion der CTL aufrechtzuerhalten. Schließlich werden die Zellen am Tag 12 gewonnen und auf Reinheit, Wirksamkeit und Sicherheit getestet sowie für die anschließende klinische Anwendung kryokonserviert. Letztendlich lassen sich CTL-Linien mit Multivirus-Spezifität und minimaler alloreaktiver Aktivität erzeugen, wie durch intrazelluläre Zytokinstainings, Interferon-gamma-Produktion und Zytotoxizität belegt wird.

Die Herstellung von multivirusspezifischen zytotoxischen T-Zelllinien ist zeitaufwändig und umständlich. Sie erfordert die Verwendung von EBV-transformierten B-Zelllinien (EP Epstein-Barr-Virus) und adenoviralen Vektoren, und das Verfahren dauert etwa drei Monate. Unsere neue Methode verwendet keine viralen Vektoren.

Die Zellen wachsen in Kultur exponentiell mit minimalem Zellverlust, weshalb das Verfahren schnell und kosteneffizient ist. Demonstriert wird dieses Verfahren von Eureka Gerdeman, einer klinischen Assistentin im Labor. Ernte monocytenstammende DCs, die in Cellgenic-Medien ergänzt mit IL-4 und G-M-C-S-F generiert wurden, und reife sie dann 24 Stunden in Reifungszytokinen durch sanftes Aufschwemmen mit einer 3-Milliliter-Transferpipette. Verwende Trypanblau, um die DCs zu zählen, und überführe sie anschließend in drei 15-Milliliter-Röhrchen mit nicht weniger als 0,5 × 10⁶ und nicht mehr als 2 × 10⁶ Zellen pro Röhrchen.

Zentrifugieren Sie danach das DCS 10 Minuten lang bei 200 × g. Bereiten Sie in dieser Zeit sechs Milliliter Cell-Genix-Medien vor, die mit dem gleichen DC-Maturations-Zytokingemisch wie zuvor ergänzt wurden, und geben Sie zwei Milliliter in drei Vertiefungen einer 12-Loch-Zellkulturplatte. Füllen Sie die ungenutzten Vertiefungen mit je zwei Millilitern steriler Wasser. Überführen Sie die Platte in einen Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2, um sie vorzuwärmen.

Nachdem die Zellen fertig zentrifugiert wurden, entfernen Sie die Überstände und geben Sie die entsprechenden DNA-Plasmide in jedes Reagenzglas bei einer Endkonzentration von fünf Mikrogramm DNA pro Gefäß hinzu. Hier wird das Plasmid, das IE1-PP65 kodiert, in Reagenzglas Nummer eins gegeben, Penton in Reagenzglas Nummer zwei und EBNA1-LMP2-BZLF1 in Reagenzglas Nummer drei. Suspendieren Sie die DCs und die DNA in 100 Mikrolitern Nukleofektionslösung.

Sorgfältig mischen und die Mischung in NU Kernaffektionsküvetten überführen. Die Küvetten in den vier D-Nukleoeffektor stellen. Programm CB eins 50 auswählen und unmittelbar nach der Kernaffektion starten.

Fügen Sie 500 µL des vorgewärmten CELLGENIC-DC-Maturierungsmediums zu jedem Vial hinzu, mischen Sie die Zellen durch vorsichtiges zweimaliges bis dreimaliges Auf- und Abpipettieren und überführen Sie die nukleinsäuretransfizierten DCs in die vorbereitete 12-Loch-Platte, die die restlichen 1,5 mL vorgewärmten DC-Maturierungsmediums enthält. Überführen Sie die Platte für weitere 12 bis 18 Stunden in den Inkubator, ernten und zählen Sie anschließend die nukleinsäuretransfizierten DCs, waschen Sie die Zellen einmal mit 10 mL CTL-Medium und resuspendieren Sie sie anschließend mit 3 × 10⁵ DCs pro mL Medium. Poolsen Sie mindestens 7,5 × 10⁵ oder 2,5 mL und maximal 15 × 10⁵ oder 5 mL der DCs aus allen drei Nukleinsäuretransfektionen und überführen Sie die gepoolten, plasmidtransfizierten DCs in die G-Rex-Vorrichtung.

Bringen Sie das Gerät dann zum Inkubator, um die Respondierzellen vorzubereiten. Verwenden Sie die nicht-adhärenten mononukleären Zellen, die nach der DC-Auswahl verbleiben. Überführen Sie die Respondern in die vorgewärmte Kulturlösung.

Waschen Sie sie einmal mit CTL-Medium. Suspendieren Sie die Zellen in CTL-Medium. Zählen Sie die Zellen und stellen Sie sie auf eine Konzentration von zweimal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter ein.

Nehmen Sie 15 mal 10 hoch 6 Zellen oder 7,5 Milliliter und ergänzen Sie mit den Zytokinen IL-4 und IL-7. Überführen Sie 7,5 Milliliter PBMC in den G Rex und ergänzen Sie den Bioreaktor mit CTL-Medium auf ein Gesamtvolumen von 30 Millilitern. Stellen Sie abschließend den G REX sechs bis sieben Tage lang in den Inkubator; am Tag sechs bis sieben aspirieren Sie 10 Milliliter des Mediums.

Anschließend die verbleibenden 20 Milliliter Medium mit einer 10-Milliliter-Pipette mischen. Zur Zellzählung Tripanblau verwenden, falls weniger als 50 × 10⁶ Zellen vorhanden sind. Die Kultur mit frischem Medium und Zytokinen auffrischen.

Wenn mehr als 50 mal 10 hoch 6 Zellen vorhanden sind, entfernen Sie 10 Milliliter der Zellsuspension, überführen Sie die Zellen in einen neuen G rex und versorgen Sie beide G rex mit frischem CTL-Medium und Zytokinen. Kultivieren Sie die Zellen für weitere vier bis sechs Tage, um die Zellen in ausreichender Zahl zu vermehren, ernten und zählen Sie die Zellen. Anschließend kryokonservieren Sie alle Zellen, die nicht für phänotypische oder funktionelle Analysen verwendet werden, für zukünftige Zwecke. Repräsentative Ergebnisse zeigen, dass multizyklische DNA-Plasmide multi-virus-spezifische T-Zellen induzieren, gemessen mittels Interferon-gamma-ELISpot und die Frequenz reaktiver Zellen überlegen ist gegenüber Linien, die mit konventionellen PHU-Plasmiden, die dieselben Antigene exprimieren, generiert wurden.

Das optimale Verhältnis von DC zu PBMC ist wichtig für eine potente T-Zell-Stimulation, wie in dieser Abbildung gezeigt, bei der ein Verhältnis von eins zu 50 eine suboptimale Reaktivierung im Vergleich zu einem Verhältnis von eins zu 20 (Stimulator zu Respondern) ergibt. Die CTL-Kultur im G rex ermöglicht, wie in dieser Abbildung zu sehen, eine überlegene T-Zell-Expansion im Vergleich zu herkömmlichen 24-Well-Platten. Die Zugabe von IL-4 und IL-7 zu den Kulturen erhöht das Repertoire und die Spezifität der expandierten Zellen, wie hier gezeigt, wobei die Häufigkeit von T-Zellen, die gegen das von CMV PP65 abgeleitete, HLA-A2-restriktive NLV-Peptid reagieren, in Kulturen bewertet wurde, die in Gegenwart oder Abwesenheit von IL-4 und/oder IL-7 generiert wurden. Diese Abbildung zeigt eine repräsentative Probe des Phänotyps der schnell expandierten multiviralen CTLs, die polyklonal sind und eine Mischung aus CD4-positiven und CD8-positiven T-Zellen aufweisen, wobei die Mehrheit die Gedächtnismarker CD45RO und CD62L exprimiert. Die expandierten CTLs sind spezifisch für alle stimulierenden Antigene und polyfunktional, wie hier durch intrazelluläre Zytokinstainung zur Detektion der Produktion von Interferon-γ und TNF-α nach Antigenstimulation sowie durch den Chromfreisetzungsassay bewertet.

Die expandierten CTL können virale Zielstrukturen spezifisch abtöten, zeigen jedoch keine unspezifische Aktivität gegen nicht-virale HLA-Mismatch-Zielstrukturen, was eine entscheidende Sicherheitsüberlegung darstellt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mehrfach virus-spezifische zytotoxische T-Zelllinien schnell herstellt, die GMP-konform sind und sich für die adoptive Übertragung in Patienten mit virusassoziierten Erkrankungen eignen. Die Vereinfachung dieses Verfahrens sollte die Ausweitung über spezialisierte Herstellungseinrichtungen hinaus erleichtern und ermöglichen, dass das Verfahren zum Standard der Versorgung für immungeschwächte Patienten wird, die besonders anfällig für virusassoziierte Erkrankungen sind.