Die Messung der Aggregate Zusammenhalt durch Gewebeoberfläche Tensiometrie

Dieses Verfahren zeigt, wie die Stärke der intrazellulären Kohäsion in 3D-Geweben wie Aggregaten gemessen wird. Der erste Schritt besteht darin, kugelförmige Gewebeaggregate zu erzeugen und diese in eine mit Zellkulturmedium gefüllte Petrischale zu überführen. Anschließend werden einzelne Aggregate mit einer Pasteurpipette aufgesaugt und in die untere Kompressionsplatte der Messkammer des Tensometers geladen.

Dann wird die obere Druckplatte mit einem Nickel-Chrom-Draht verbunden, der sie mit der Elektronikwaage verbindet und ein Null-Basiseinheitsgewicht, bezeichnet als F null, etabliert. Das Experiment wird gestartet, indem die untere Druckplatte angehoben wird, bis das Aggregat zwischen der unteren und oberen Druckplatte komprimiert ist, und endet, wenn die Aggregate Form- und Kraftgleichgewicht oder FEQ erreichen. Die letzten Schritte des Verfahrens bestehen darin, Bilder aufzunehmen, die Geometrie des Aggregats und die Widerstandskraft zu messen und diese Messwerte in die Young-Laplace-Gleichung einzugeben.

Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die Veränderungen in der Gewebeadhäsion zeigen und wie diese sich auf die Tumorausbreitung oder die räumliche Anordnung zwischen verschiedenen Zellpopulationen auswirken könnten, jeweils durch Aggregatverbreitungs-Assays oder Zellsortierungs-Assays. Somit kann diese Methode dabei helfen, zentrale Fragen in den Bereichen der Tumorbiologie, der embryonalen Entwicklung und des Gewebegenerierens zu beantworten. Fragen wie: Wie beeinflusst die Tumoradhäsion die maligne Invasion, die Schichtung der Keimblätter während der Gastrulierung?

Oder wie können wir tatsächlich Kohäsion so konstruieren, dass funktionelle, organähnliche Strukturen in vitro entstehen? Experimentelle Manipulationen, die das Kultivieren lebender Zellen beinhalten, müssen unter sterilen Bedingungen in einer dafür vorgesehenen laminaren Flusswerkbank durchgeführt werden. Sterile Lösungen und steriles Laborzubehör sind während des gesamten Vorgangs zu verwenden. Um dieses Experiment zu beginnen, werden Anheftungszellen bei 90 % Konfluenz geerntet.

Zunächst das Kulturmedium abpipettieren und die Zellschicht zweimal mit PBS spülen. Danach das PBS abpipettieren und zwei Milliliter einer 0,05 %igen Trypsin-Lösung in EDTA-Lösung auf die Zellschicht geben. Die Platte in den 37 °C warmen Zellkultur-Inkubator stellen und inkubieren, bis sich die Zellen lösen.

Entfernen Sie anschließend die Platte aus dem Inkubator und stoppen Sie die ization durch Zugabe von zwei Milliliter komplettem Medium. Verwenden Sie die fünf-Milliliter-Pipette, um die Mischung so lange zu trieren, bis sich die Zellen vollständig in Suspension befinden. Überführen Sie dann die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Konischgefäß.

Pipettieren Sie 40 Mikroliter einer 10 Milligramm pro Milliliter DNA-Lösung in die Zellsuspension und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation vortexen Sie die Zellsuspension kurz und zentrifugieren sie anschließend fünf Minuten bei 200 × g. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, aspirations das Überstand und entsorgen Sie ihn. Dann resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter komplettem Medium und wiederholen Sie die Zentrifugation, um erneut zu waschen.

Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter komplettem Medium, führen Sie anschließend eine Zellzählung durch und stellen gegebenenfalls die Konzentration der Zellsuspension auf 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter mit komplettem Medium mithilfe einer Pipette ein. Geben Sie drei Milliliter der Zellsuspension in einen 10-Milliliter-Rundkolben und inkubieren Sie diese in einem schüttelnden Wasserbad bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid für vier Stunden bei 120 Umdrehungen pro Minute, bis sich die Zellen von der Ionenbelastung erholt haben, was daran erkennbar ist, dass die Zellen aneinanderhaften und kleine Zellhaufen bilden.

Überführen Sie die Zellen anschließend in ein Glaszentrifugenröhrchen mit rundem Boden und zentrifugieren Sie sie vier Minuten lang mit 200 × g, um nach der Zentrifugation einen dünnen Zellbelag zu bilden. Lösen Sie den Verschluss des Röhrchens, um einen Gasaustausch zu ermöglichen, und stellen Sie das Röhrchen dann in den Zellkulturtrockenschrank. Inkubieren Sie für 24 Stunden, wobei der Belag dabei kohärent werden sollte.

Nach 24 Stunden vorsichtig den Zentrifugenröhrchen anschwellen lassen, um die Zellschicht zu lösen. Anschließend den Inhalt des Kulturröhrchens in eine kleine sterile Glaszellkultur-Schale gießen. Mit Mikroskalpell die Zellschicht in Fragmente unterschiedlicher Größe schneiden und diese dann in einen 10-Milliliter-Rundkolben mit drei Millilitern Zellkulturmedium überführen.

Inkubieren Sie die Fragmente bei 37 Grad Celsius im schüttelnden Wasserbad bei 120 Umdrehungen pro Minute unter 5 % Kohlendioxid für zwei bis drei Tage oder bis sie kugelförmig werden. Die Aggregatbildung kann auch mit der Hänge-Tropfen-Methode durchgeführt werden. Laut dem zuvor veröffentlichten Protokoll besteht die TENSIOMETER- oder TST-Apparatur für die Gewebeoberfläche aus der Haupttensiometerkammer mit der Kompressionszelle, einem Wasserbad zur Aufrechterhaltung der Kammer-Temperatur, einem Stereomikroskop mit angeschlossener CCD-Kamera, einer Autowägezelle mit Stromversorgung und einem Schreibmessgerät.

Die Kompressionszelle des TST besteht aus zwei Kammern, einer äußeren Kammer und einer inneren Kammer. In der inneren Kammer befinden sich die mit Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) beschichtete obere und untere Kompressionsplatte. Stellen Sie zunächst die Umwälzpumpe für Wasser auf 37 Grad Celsius ein und vergewissern Sie sich, dass die Schläuche mit den Anschlüssen an der äußeren Kammer verbunden sind.

Danach die untere Baugruppe einschrauben, die verwendet wird, um das Aggregat anzuheben, um die Kompression im Inneren der Kammer zu beginnen. Als Nächstes ein Stück flammengerechtigten Nickel-Chrom-Draht vorbereiten, indem man zunächst ein 15 Zoll langes Stück Draht an einem Reagenzglashalter befestigt und eine kleine Büroklammer am Ende befestigt. Dann einen Bunsenbrenner entlang des Drahtes auf und ab bewegen, bis der Draht rotglühend wird.

Verwenden Sie Drahtschneider, um den gestreckten Draht auf die geeignete Länge zu kürzen. Biegen Sie den Draht anschließend mit zwei Rasierklingen etwa ein Viertel Zoll vom Ende entfernt, um einen kleinen Haken zu formen. Füllen Sie schließlich die innere Kammer des TST mit kohlendioxidunabhängigem Zellkulturmedium, das durch Inkubation bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden entgast wurde.

Verwenden Sie eine Pipette, um eventuell an der unteren Druckplatte entstandene Luftblasen zu entfernen. Die TST-Vorrichtung ist nun bereit für den Kompressionsversuch mit Aggregaten. Verwenden Sie eine APA-Pipette, um ein Zellaggregat mit einem Durchmesser von 200 bis 300 Mikron aus der Kulturplatte aufzusaugen.

Drücken Sie den Aggregat vorsichtig auf die untere Druckplatte in der inneren Kammer des TST-Geräts. Positionieren Sie den Aggregat so nah wie möglich in der Mitte der unteren Druckplatte, indem Sie ihn vorsichtig mit einer Kapillare, die mit einer kleinen Haarschleife ausgestattet ist, anstoßen. Verbinden Sie den Nickel-Chrom-Draht einer Plattenanordnung mit dem Wägearm der Aufzeichnungswaage Can Venton Modell 2000.

Stellen Sie die Position der Waage so ein, dass die oberen und unteren Druckplatten parallel zueinander und direkt übereinander liegen. Lassen Sie die obere Platte absinken. Dann stellen Sie den Schreibkopf des Diagrammregistriergeräts auf das festgelegte Basisliniengewicht null.

Verwenden Sie das Stereomikroskop, das mit einer CCD-Kamera ausgestattet ist, um ein Bild des unkomprimierten Aggregats aufzunehmen. Anschließend stellen Sie die Höhe der Innenkernvorrichtung ein, um den gewünschten Kompressionsgrad zu steuern, und heben die untere Kompressionsplatte an, bis das Aggregat gegen die obere Kompressionsplatte gedrückt wird. Nutzen Sie das Stereomikroskop mit CCD-Kamera, um die Kompression zu überwachen und Bilder des Aggregats aufzunehmen, wie beispielsweise das hier gezeigte.

Notieren Sie kontinuierlich die scheinbare Gewichtsänderung der oberen Druckplatte auf einem Streifen-Schreiber während der gesamten Kompression, bis die gewünschte Form erreicht ist. Das Gleichgewicht wird durch das Abflachen der Ausgangsspannung der Waage angezeigt. Verwenden Sie erneut das mit einer CCD-Kamera ausgestattete Stereomikroskop, um ein Bild des komprimierten Aggregats aufzunehmen.

Dieses Bild wird zur Messung der Aggregatgeometrie verwendet. Nach der Aufnahme des Bildes senken Sie die Kompressionsplatte ab, um das Aggregat zu entlasten, und messen Sie die Druckkraft im Gleichgewichtszustand. Lesen Sie die Aufzeichnung des Schreibers als Differenz zwischen der Kraft, die unmittelbar vor der Entlastung des Aggregats gemessen wurde, und der etablierten Null-Basislinie ab. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem anderen Kompressionsgrad, um diesmal die Kraft im Gleichgewicht zu bestimmen.

Messen Sie die Druckkraft und Geometrie im Kraftequilibrium und wenden Sie diese Messungen zusammen mit den Messungen für das Formequilibrium auf die Young-Laplace-Gleichung an, um numerische Werte der scheinbaren Gewebeoberflächenspannung zu berechnen. Gemäß den Anweisungen im schriftlichen Protokoll zeigt diese Tabelle Messungen der Gewebeoberflächenspannung und die Bestätigung der Fließfähigkeit von Aggregaten aus Ratten-Prostata-, Fibroblasten- und glatten Muskelzellen. Aggregate aus Fibroblasten der Ratten-Prostata weisen eine Oberflächenspannung von 22,8 ± 1,1 dyn/cm auf.

Außerdem waren die mittleren Oberflächenspannungswerte nach der ersten und nach der zweiten Kompression statistisch identisch, wenn sie mittels eines gepaarten T-Tests verglichen wurden. Wir verglichen ebenfalls die Verhältnisse von Sigma zwei zu Sigma eins und von F zwei zu F1, um sicherzustellen, dass diese Aggregate nicht dem Hookeschen Gesetz folgen, wie es bei elastischen Festkörpern der Fall wäre, wie in Tabelle eins gezeigt. Das Verhältnis von Sigma zwei zu Sigma eins nähert sich tatsächlich eins an.

Außerdem war das Verhältnis von F zwei zu F1 signifikant größer als das von sigma zwei zu sigma, was weiterhin bestätigt, dass diese Aggregate nicht dem Hookeschen Gesetz folgen und sich tatsächlich wie Flüssigkeiten verhalten. Im Gegensatz dazu, wie in Tabelle eins ersichtlich, ist das Verhältnis von sigma zwei zu sigma eins von Ratten-Prostata-Smooth-Muscle-Zellen signifikant größer als eins und statistisch nicht unterschiedlich von dem von F zwei zu F1. Um das flüssigkeitsähnliche Verhalten weiter zu demonstrieren, untersuchten wir die Beziehung zwischen Oberflächenspannung und Aggregatvolumen, wie hier dargestellt. Das Volumen ist für RPF-Zellen unabhängig von sigma, wie durch die rote Regressionslinie veranschaulicht, während für Ratten-Prostata-Smooth-Muscle-Zellen eine gewisse Abhängigkeit von sigma in Bezug auf das Volumen besteht, wie durch die blaue Regressionslinie dargestellt.

Diese Daten bestätigen weiterhin, dass sich Aggregate von Ratten-Prostata-Fibroblasten flüssigkeitsartig verhalten, während jene von Ratten-Prostata-Glättungsmuskelzellen eher wie elastische Festkörper erscheinen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf den Gebieten embryonale Entwicklung, maligne Invasion und Gewebeengineering den Weg, um die Rolle der Gewebeadhäsion bei der Bildung von Kompartimenten und Grenzen zwischen verschiedenen Zelltypen während der Entwicklung embryonaler Keimblätter, während der Interaktion von Tumor-Stromazellen sowie bei der Umordnung von Pankreas-Inselzellen in einer Reihe unterschiedlicher Tiermodelle – einschließlich Amphibien, Teleostern, Reptilien, Vögeln und humanen Modellen – zu untersuchen.