Einem zellfreien Assay System Schätzung der neutralisierende Wirkung von GM-CSF Antikörper mit rekombinanten löslichen GM-CSF-Rezeptor

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, einen zellfreien Assay zu etablieren, der die neutralisierende Kapazität von G-M-C-S-F-Autoantikörpern quantifiziert. Wir beginnen mit der Beschaffung transgener Seidenraupen. Die humane SGMR-alpha-Gen wird eingeführt, um rekombinantes SGMR-alpha herzustellen, und anschließend wird das rekombinante humane G-M-C-S-F mittels bioTE markiert.

Anschließend bewerten wir die Korrelation zwischen dem zellfreien System und einem herkömmlichen Bioassay anhand einer Untersuchung der Hemmung der Bindung von G-M-C-S-F an SGMR-alpha durch G-M-C-S-F-Autoantikörper. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen eine signifikante Korrelation zwischen der Wachstumshemmung im Bioassay und der Bindungshemmung im zellfreien System durch Serum-IgG-Fraktionen sowie gereinigte G-M-C-S-F-Autoantikörper. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem TF-1-Bioassay besteht darin, dass dieses System eine hohe Analyseempfindlichkeit mit guter Reproduzierbarkeit zur Bestimmung der neutralisierenden Kapazität von GM-CSF-Autoantikörpern bietet.

Da Autoantikörper gegen GM-CSF eine autoimmune primäre Gesamtprognose verursachen, reichen die Implikationen dieser Technik bis hin zur Diagnose. Sie kann außerdem auf kompetitive Tib-Bindungsassays unter Verwendung rekombinanter Zytokinrezeptoren angewendet werden, wie beispielsweise Rezeptoren für BEGF und TNFA. Den Ablauf des Verfahrens wird ein Doktorand aus meinem Labor demonstrieren. Er hat zunächst dieses pH-freie System entwickelt.

Dieses Video zeigt den Seidenspinner, der zur Herstellung von rekombinantem SGMR-alpha verwendet wird. Der erste Schritt besteht darin, das cDNA für SGMR Alpha aus einer menschlichen Plazenta-cDNA-Bibliothek mittels Polymerase-Kettenreaktion mit dem resultierenden PCR-Amplicon zu amplifizieren. Führen Sie eine zweite PCR durch, um eine 50 Basen lange 5'-UTR-Sequenz des ULA-Virus-Polyhedrons am 5'-Ende hinzuzufügen.

Und um ein R RRGs-Tag an das drei-prime-Ende anzubringen, klonen Sie das amplifizierte PCR-R-Produkt in das Plasmid P MSG eins eins mg. Ko-injizieren Sie den Konstrukt PS GMR/Schlange M1 eins mg zusammen mit dem Helfervektor PHA drei pig in Eier der Seidenraupe der PNDW-eins-Stammes. Züchten Sie die geschlüpften G-null-Larven bei 25 Grad Celsius zu Motten heran. Anschließend screenen Sie die G-eins-Embryonen entweder durch Paarung unter Geschwistern oder mit PNDW eins mittels MG FP-Expression in den Augen, die auf transgene Seidenraupen hinweist.

Das SGMR-Alpha-Gen dient der Extraktion von rekombinantem SGMR-Alpha aus den Kokons transgener Seidenraupen mithilfe von Phosphatpuffer, der 500 Millimolar Natriumchlorid enthält, und wird 24 Stunden bei vier Grad Celsius unter Rühren inkubiert. Zentrifugieren Sie die Proben bei 20.000 ×g für 15 Minuten. Um die Präzipitate zu entfernen, geben Sie die Überstandflüssigkeit auf eine Nickelaffinitäts-Säule.

Waschen Sie die Säule und verdünnen Sie die Proteine mit einem linearen Gradienten von Ole von 10 Millimolar auf 250 Millimolar. Sammeln Sie die Fraktionen, die das gereinigte SGMR-alpha enthalten, und dialysieren Sie gegen phosphatgepufferte Salzlösung. Dialysieren Sie die Proben zuerst mit PBS.

Um Sorbitol aus der G-M-C-S-F-Zubereitung zu entfernen, fügen Sie ein Milliliter 20 Millimolar kalte Natriummetadat-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang im Dunkeln auf Eis. Geben Sie nun Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 15 Millimolar hinzu und dialysieren Sie gegen 100 Millimolar Natriumacetatpuffer. Fügen Sie anschließend Biotinazid in einer Endkonzentration von fünf Millimolar zur Lösung hinzu und mischen Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie abschließend das nichtreaktive Material durch Dialyse gegen PBS, beschichten Sie eine Mikrotiterplatte über Nacht bei vier Grad Celsius mit 50 Mikrolitern monoklonalem Anti-Polyhis-Antikörper. Waschen Sie fünfmal mit PBST. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter einer Blockierungslösung hinzu und inkubieren Sie drei Stunden bei vier Grad Celsius.

Erneut fünfmal mit PBST waschen. 50 Mikroliter SGMR-alpha in der Blockierungslösung zugeben und nach fünf Waschungen mit PBST über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. 25 Mikroliter der Proben, die G-M-C-S-F-Autoantikörper enthalten, zugeben und anschließend 25 Mikroliter biotinyliertes G-M-C-S-F, eine Stunde bei vier Grad Celsius inkubieren.

Um den SGMR alpha G-M-C-S-F-Komplex zu bilden. Weitere fünfmal mit PBST waschen und dann 50 µL alkalische Phosphatase-Streptavidin für eine Stunde bei vier Grad Celsius hinzufügen, um das biotinylierte, an SGMR alpha gebundene G-M-C-S-F nachzuweisen; fünfmal mit PBST waschen und 50 µL eines Chemilumineszenz-Substrats zur Lösung geben, eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren und die Chemilumineszenzaktivität mittels eines Plattenlesegeräts bestimmen. In der SDS-Page-Analyse liegt das aus Seidenraupen gewonnene rekombinante SDMR alpha unter nicht reduzierenden Bedingungen sowohl in monomerer als auch in DME-Form vor, unter reduzierenden Bedingungen dagegen ausschließlich in monomerer Form.

Dieses rekombinante Gemisch aus Monomeren und über Disulfidbrücken verbundenen Dimeren von SGMR alpha ist in einem kompetitiven Bindungsassay funktional. Der Komplex aus biotinyliertem G-M-C-S-F mit SGMR alpha zeigt Spezifität, da er durch Zugabe verschiedener Konzentrationen neutralisierender Antikörper, jedoch nicht durch nicht-neutralisierende Antikörper, dissoziiert werden kann. Darüber hinaus korrelieren steigende Konzentrationen von G-M-C-S-F-neutralisierenden Antikörpern positiv mit einem erhöhten prozentualen Bindungshemmungsgrad in dosisabhängiger Weise.

Wie erwartet war die Bindungshemmung durch G-M-C-S-F-antikörper, die nicht neutralisieren, nicht dosisabhängig. Dieses zellfreie System zeigt eine enge Korrelation zwischen der Hemmung der G-M-C-S-F-Bindung an SGMR alpha durch G-M-C-S-F-Autoantikörper und den berechneten Werten von r gleich 0,988 sowie einem P-Wert von 0,002. Die Bindungshemmung stieg dosisabhängig durch G-M-C-S-F-Autoantikörper an.

Ebenso korrelierte die Bindungshemmung signifikant mit der Wachstumshemmung des Imports. Dieser Test besitzt eine nützliche Anwendung bei der Analyse der Serum-IgG-Fraktionen von Patienten mit autoimmuner PAP, wie hier durch die Beziehung zwischen der IC50 für die prozentuale Bindungshemmung und der prozentualen Wachstumshemmung durch die Serum-IgG-Fraktionen gezeigt wird. Darüber hinaus weist der Variationskoeffizient zwischen den Experimenten einen Vorteil des zellfreien Systems gegenüber dem Wachstumshemmungs-Bioassay auf.

Nach der Vorbereitung kann dieser zellfreie GM-GSF-Rezeptor-Liganden-Bindungsassay erfolgreich innerhalb von 38 Stunden durchgeführt werden. Es ist wichtig, die Reaktionsbedingungen, die Temperatur und die Inkubationszeit einzuhalten. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Untersuchung der biologischen Aktivitäten neuartiger Antikörperarzneimittel im Vergleich zu herkömmlichen Bioassays.