Name: Einem zellfreien Assay System Schätzung der neutralisierende Wirkung von GM-CSF Antikörper mit rekombinanten löslichen GM-CSF-Rezeptor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Erfahren Sie eine zellfreie Bindungsanalyse zur Quantifizierung der neutralisierenden Kapazität von GM-CSF-Autoantikörpern. Diese Methode nutzt rekombinanten SGMR-Alpha aus transgenen Seidenspinnern.

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Wir sind sehr dankbar, K. Nakagaki, Dr. H. Ishii, Dr. K. Suzuki, A. Yamagata, K. Oofusa für ihre wertvollen Beiträge.

1. Produktion und Aufreinigung von sGMRα <ol><li> Amplify cDNA von sGMRα aus menschlicher Plazenta-cDNA-Bank mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR). </li><li> Dann werden 50 Basis-5'-UTR-Sequenz von Baculovirus-Polyhedrin Ende und 27 Basis-Codierung RGS His-tag an das 3'-Ende der PCR Amplikon von einer anderen PCR. </li><li> Legen Sie die amplifizierte PCR-Produkt in ein Plasmid pMSG1.1MG. </li><li> Inject das Konstrukt psGMR/M1.1MG mit dem Helfer-Vektor pHA3PIG in Eier der Seidenraupe PND-w1 Belastung. </li><li> Hinten die geschlüpften Larven zu Motten G0 bei 25 ° C. Screen-G1 Embryonen, die durch Paarung unter Geschwistern oder mit PND-w1 erhalten für MGFP Ausdruck in den Augen zu erhalten transgenen Seidenraupen mit dem sGMRα Gen. </li><li> Auszug rekombinanten sGMRα aus den Kokons der Seidenraupen transgenen mit Phosphat-Puffer mit 500 mM NaCl und rühren bei 4 ° C für 24 Stunden. </li><li> Centrifuge Probe bei 20000 g für 15 Minuten zu entfernen ausfällt. </li><li> Wenden Sie den Überstand in ein Nickel-Affinitätssäule. </li><li> Die Säule wird mit 10 mM Imidazol, 500 mM NaCl und 20 mM Natriumphosphat, pH6.3, und eluieren mit einem linearen Gradienten von Imidazol von 10mm bis 250mm. Pool der Fraktionen, die das gereinigte sGMRα und dialysieren gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (pH 7,4) (PBS). </li></ol> 2. Biotinylierung von rekombinantem GM-CSF <ol><li> Entfernen Sorbit Vorbereitung durch Dialyse gegen PBS. </li><li> Add 1 ml 20 mM kalten Natrium-meta-Perjodat-Lösung bei 4 ° C, um die Lösung auf Eis. </li><li> Inkubieren Sie die Probe für 30min auf Eis im Dunkeln. </li><li> Add Glycerin, um die Lösung in einer Endkonzentration von 15 mm. </li><li> Dialysieren die Lösung gegen 100 mM Natriumacetat-Puffer (pH 5,5) </li><li> Add Biotinhydrazid die Lösung mit einer Endkonzentration von 5 mM und kontinuierlich rühren die Lösung für 2 h bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie das nicht umgesetzte Material durch Dialyse gegen PBS, pH 7,4. </li></ol> 3. Ein zellfreier GM-CSF-Rezeptor-Ligand-Bindungs-Assay <ol><li> Coat eine Mikrotiterplatte mit 50 ul monoklonalen anti-Polyhistidin Antikörper über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Wash fünfmal mit 500μl PBST. </li><li> Add 100 &amp;mgr; einer Blockierungslösung und Inkubation für 3h bei 4 ° C. </li><li> Wash fünfmal mit 500μl PBST. </li><li> Add 50 ul sGMRα in Blocking-Lösung und Inkubation über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Wash fünfmal mit 500μl PBST. </li><li> Add 25 &amp;mgr; l der Proben mit GM-CSF Autoantikörper und dann 25 &amp;mgr; l des biotinylierten GM-CSF. Inkubieren 1h bei 4 ° C zu bilden sGMRα-GM-CSF-Komplex. </li><li> Wash fünfmal mit 500μl PBST. </li><li> Add 50 ul 0,4 mM Streptavidin-alkalische Phosphatase für 1 Stunde bei 4 ° C an den biotinylierten GM-CSF gebunden sGMRα erkennen. </li><li> Wash fünfmal mit 500μl PBST. </li><li> Add 50 ul einer Chemilumineszenzsubstrat zur Lösung resuspendiert und für 1h bei Raumtemperatur. </li><li> Mit Hilfe eines Chemilumineszenz-Reader, erkennen die Chemilumineszenz-Aktivität. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Der erste Schritt in die GM-CSF-Rezeptor-Signalweg ist die Bindung von GM-CSF, GM-CSF-Rezeptor alpha auf der Zelloberfläche. Weil GM-CSF Autoantikörper bindet spezifisch an GM-CSF und blockieren die Bindung an den Rezeptor in vitro 16,17 stellten wir die Hypothese, dass die Autoantikörper dieser ersten Reaktion unmittelbar verbindlich GM-CSF zu hemmen. Wie zuvor beschrieben (Ref. 9-15), wandten wir transgene Seidenraupe Technologie, um eine große Menge an rekombinantem sGMRα mit hoher Reinheit zu erhalten. Wenn die Seidenraupe abgeleitete rekombinante sGMRα auf SDS-PAGE wurde unter nicht-reduzierenden Bedingungen geladen, zeigte die sGMRα sowohl monomere (45 kDa) und dimeren (90 kDa) bildet, während nur die monomere Form unter reduzierenden Bedingungen festgestellt wurde (Abbildung 1B) , was darauf hinweist, dass die rekombinanten sGMRα eine Mischung aus Monomeren und Disulfid-linked-Dimmer 18 Jahre alt war. Mit dem zellfreien System (Abb. 2A), wir die Hemmung der GM-CSF-Bindung an sGMRα von GM-CSF-Autoantikörpern (Abb. 2B und Abb.. 2C) ausgewertet. Diese Methoden wurden in Bezug 19 von Urano et al. Die Wachstumshemmung war eng mit dem Binding-Hemmung (r = 0,988, p = 0,002) bei verschiedenen Konzentrationen der GM-CSF Autoantikörper (Abb. 3A) 19 korreliert. Ebenso wurde die Bindung Hemmung signifikant mit der Wachstumshemmung korreliert. Die Binding-Hemmung in einer dosisabhängigen Weise durch GM-CSF-Autoantikörpern (Abb. 3B) 19 erhöht. Diese beiden Parameter für die Serum-IgG-Fraktionen von verschiedenen Patienten wurden miteinander korreliert (r = 0,589 p = 0,006, Abb.. 3C). Weder Bindungsinhibition noch Wachstumshemmung mit Kd-Werten korreliert, und somit waren beide Parameter unabhängig von Bindungsaffinität 19. Folglich Reproduzierbarkeit der Daten zwischen Bindung und gachstum Hemmung durch drei unabhängige Experimente an drei verschiedenen Proben erhalten wurde, ausgewertet. Der Variationskoeffizient angedeutet, dass die zellfreien System mehr gute als die von Biotest (Tabelle 1) wurde. <img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Flussdiagramm des Verfahrens zur Herstellung von sGMRα mit transgenen Seidenraupen. A) Strukturen der Transformationsvektoren 9-11. B) SDS-PAGE und Coomassie Brilliant Blue-Färbung des gereinigten sGMRα unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen. sGMRα, lösliches GM-CSF-Rezeptor alpha; MGFP, Monster grün fluoreszierendes Protein; BmNPVpol5'-UTR, 5'-untranslatierten Region Abfolge von Bombyx mori nuklearen polyhedrosis Virus Polyhedrin; SV40 polyA, SV40 polyA-Signal-Sequenz; P 3xP3, 3xP3 Promotor; P SER1, SER1 Promotor; FibL polyA, Fibroin L-Kette polyA-Signal-Sequenz, hr3, Bombyx mori nuklearen polyhedrosis Virus hr3-Enhancer. <img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Schema der zellfreien Assay-System. A) Ein wettbewerbsfähiger Bindungsassay mit sGMRα von Seidenraupen produziert. B) Wirkung zu neutralisieren und nicht-neutralisierende Antikörper auf die Bindung der Hemmung durch zellfreien System. C) Die Differenz von Bindungsinhibition zwischen verschiedenen Konzentrationen von neutralisierenden Antikörpern und nicht-neutralisierenden Antikörpern. GM-CSF, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor; sGMRα, lösliches GM-CSF-Rezeptor alpha, His, RGS-His-tag, AP, alkalische Phosphatase. <img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. GM-CSF Bindungsinhibition zu sGMRα durch Wirkung von GM-CSF polyklonale Antikörper oder das Serum IgG-Fraktionen von Patienten mit Autoimmun-PAP. A) Beziehung zwischen verbindlichen Hemmung und Wachstumshemmung von GM-CSF Autoantikörper. B) Binding-Hemmung bei verschiedenen Konzentrationen von GM-CSF Autoantikörper. C) Beziehung zwischen IC 50 für Prozent Bindungsinhibition und Prozent Wachstumshemmung durch das Serum IgG-Fraktionen 19. IC 50, 50% ige Hemmkonzentration; GM-CSF, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor. <table border="1"><tbody><tr><td> Probe </td><td> A </td><td> B </td><td> C </td></tr><tr><td colspan="4"> Inter-Assay- </td></tr><tr><td> Anzahl der Bestimmungen </td><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Mittelwert (% Bindung Hemmung) </td><td> 61,6 </td><td> 63,8 </td><td> 69,7 </td></tr><tr><td> Mittelwert (% Wachstumshemmung) </td><td> 21,0 </td><td> 73,4 </td><td> 82,8 </td></tr><tr><td> Variationskoeffizient (%) (% Bindung Hemmung) </td><td> 6,0 </td><td> 5,6 </td><td> 8,3 </td></tr><tr><td> Variationskoeffizient (%) (% Wachstumshemmung) </td><td> 64,4 </td><td> 18,3 </td><td> 10,4 </td></tr></tbody></table> Beide Assays wurden bei 5 ng / ml GM-CSF und einer Konzentration von GM-CSF Autoantikörper durchgeführt. Tabelle 1. Vergleich der Koeffizienten von Variationen zwischen Prozent verbindlich und Wachstum Hemmungen durch drei unabhängigen Experimenten.

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Die zellfreien Assay schätzte die neutralisierende Wirkung des GM-CSF-Autoantikörpern mit ausgezeichneter Reproduzierbarkeit und Schnelligkeit. Die Bindung der Hemmung durch GM-CSF Autoantikörper oder Serum des Patienten IgG-Fraktionen wurde durch diesen Test ausgewertet. Die Daten zeigten eine Korrelation zwischen der Bindung Hemmung der zellfreien Assay und die Wachstumshemmung von einem Bioassay mit TF-1 Zellen. Der Bioassay wurde vielfach genutzt, sondern beherbergt Schwierigkeiten beim Vergleich der Daten zwischen ...

einem zellfreien assay system schätzung der neutralisierende wirkung von gm-csf antikörper mit rekombinanten löslichen gm-csf-rezeptor

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

Hintergrund: Bisher haben wir gezeigt, dass neutralisierende Wirkung, nicht aber die Konzentration von GM-CSF Autoantikörper wurde mit dem Schweregrad der Erkrankung bei Patienten mit Autoimmun-pulmonale Alveolarproteinose (PAP) 1-3 korreliert. Als Aufhebung der GM-CSF-Bioaktivität in der Lunge ist die wahrscheinliche Ursache für Autoimmunerkrankungen PAP 4,5, ist es das Versprechen, die neutralisierende Wirkung des GM-CSF Autoantikörper für die Beurteilung der Schwere der Erkrankung bei jedem Patienten mit PAP zu messen. Bis jetzt hat neutralisierende Wirkung von GM-CSF-Autoantikörpern durch die Auswertung der Wachstumshemmung von menschlichen Knochenmarkzellen oder TF-1-Zellen mit GM-CSF stimuliert 6-8 bewertet. Im Tierversuch System, jedoch ist es oft problematisch, verlässliche Daten sowie die Daten aus verschiedenen Laboratorien zu vergleichen, aufgrund der technischen Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung der Zellen in einem konstanten Zustand zu erhalten. ZIEL: GM-CSF imitieren Bindung an GM-CSF-Rezeptor auf der Zelloberfläche mit zellfreien Rezeptor-Bindungs-Assays. Methoden: Transgene Seidenraupen-Technologie wurde für den Erhalt einer großen Menge für rekombinante, lösliche GM-CSF-Rezeptor alpha (sGMRα) mit hoher Reinheit 9-13 aufgetragen. Das rekombinante sGMRα war in der hydrophilen Sericin Schichten von Seidenfäden, ohne auf die Seidenproteine ​​verschmolzen enthalten, und somit können wir leicht aus den Kokons in guter Reinheit Extrakt mit neutralen wässrigen Lösungen 14,15. Glücklicherweise sind die Oligosaccharid-Strukturen, die entscheidend für die Bindung mit GM-CSF sind, mehr Ähnlichkeit mit den Strukturen des menschlichen sGMRα als die von anderen Insekten oder Hefen hergestellt. ERGEBNISSE: Die zellfreien Testsystem mit sGMRα ergaben die Daten mit hoher Plastizität und Zuverlässigkeit. GM-CSF-Bindung an sGMRα war dosisabhängig gehemmt durch polyklonale GM-CSF Autoantikörper in ähnlicher Weise wie die Biotest mit TF-1-Zellen, was darauf hinweist, dass unser neues zellfreien Testsystem mit sGMRα mehr nützlich für die Messung von neutralisierenden Aktivität ist von GM-CSF-Autoantikörpern als der Bioassay-System mit TF-1 Zelle oder menschliche Knochenmarkszellen. FAZIT: Wir haben einen zellfreien Assay quantifiziert die neutralisierende Kapazität von GM-CSF Autoantikörper.

Wir haben eine zellfreie Rezeptorbindungstest, um die Bindung von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) an die Rezeptoren zu schätzen. Es ermöglicht uns, kompetitive Hemmung des biotinylierten GM-CSF-Bindung an löslichen GM-CSF-Rezeptor alpha von GM-CSF Autoantikörper mit ausgezeichneter Reproduzierbarkeit zu bewerten.

Einem zellfreien Assay System Schätzung der neutralisierende Wirkung von GM-CSF Antikörper mit rekombinanten löslichen GM-CSF-Rezeptor

HINTERGRUND: Zuvor haben wir gezeigt, dass die neutralisierende Kapazität, jedoch nicht die Konzentration von GM-CSF-Autoantikörpern, mit der Erkrankung korrelierte ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, einen zellfreien Assay zu etablieren, der die neutralisierende Kapazität von G-M-C-S-F-Autoantikörpern quantifiziert. Wir beginnen mit dem Erhalt transgener Seidenraupen. Die humane SGMR-alpha-Gen wird eingebracht, um rekombinantes SGMR-alpha herzustellen, und anschließend wird das rekombinante humane G-M-C-S-F mittels bioTE markiert.Anschließend bewerten wir die Korrelation zwischen dem zellfreien System und einem herkömmlichen Bioassay anhand einer Untersuchung der Hemmung der Bindung von G-M-C-S-F an SGMR-alpha durch G-M-C-S-F-Autoantikörper. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen eine signifikante Korrelation zwischen der Wachstumshemmung im Bioassay und der Bindungshemmung im zellfreien System durch Serum-IgG-Fraktionen sowie gereinigte G-M-C-S-F-Autoantikörper. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem TF-1-Bioassay besteht darin, dass dieses System eine hohe Analyseempfindlichkeit mit guter Reproduzierbarkeit zur Bestimmung der neutralisierenden Kapazität von GM-CSF-Autoantikörpern bietet.Da Autoantikörper gegen GM-CSF eine autoimmune primäre Gesamtprognose verursachen, reichen die Implikationen

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt die in vitro Differenzierung von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor oder GM-CSF-produzierenden T-Helferzellen (THGM). Isolierte naive T-Zellen werden für die Differenzierung in THGM stimuliert, was durch den Nachweis einer hohen intrazellulären GM-CSF-Produktion und einer geringen Expression anderer T-Helferzell-spezifischer Zytokine bestätigt wird.

Eine in vitro Technik zur Unterscheidung von GM-CSF-produzierenden T-Helferzellen von naiven T-Zellen

Dieses Video zeigt Mikroneutralisationsassays zur Messung neutralisierender Antikörper mit Hilfe von Madin-Darby Canine Kidney Zellen, die α2,6-verknüpfte Sialinsäure in menschlichen Seren überexprimieren. Dieser Assay wird häufig in der Influenza-Humanserologie...

Ein Mikroneutralisationsassay zur Messung neutralisierender Antikörpertiter im Humanserum

In den letzten Jahren wurden mit lebenden Zellen basierende Tests erfolgreich verwendet worden, um Antikörper gegen Oberflächenantigene erkennen und Konformationsänderungen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie ermöglicht die Analyse von großen Kohorten von Patienten. Detektion von neuen Antikörper Diagnose und Behandlung von Autoimmunerkrankungen zu verbessern.

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Wir beschreiben eine Methode, um der Aktivierung des Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Antikörper dieses Ziel der Influenza Virus Hämagglutinin messen. Dieser Test kann auch angepasst werden, um die Fähigkeit der monoklonale Antikörper oder polyklonalen Seren gezielt andere virale Oberfläche Glykoproteine induzieren Fc-vermittelten Immunität zu beurteilen.

Eine Methode zur Bewertung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Influenza Hämagglutinin spezifische Antikörper induziert

Wir drückten ectopically NR1 Untereinheit der NMDA-Rezeptor mit dem Stichwort grünen fluoreszierenden Proteins in den menschlichen embryonalen Zellen (HEK293) als Antigen Autoantikörper gegen NMDA-Rezeptor im Blut von Patienten mit Verdacht mit autoimmune Enzephalitis zu erkennen. Diese einfache Methode möglicherweise zu screening-Zwecken in klinischen Umgebungen geeignet.

Eine einfache zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay, Autoantikörper gegen das N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren im Blut zu erkennen

Hier präsentieren wir eine zellbasierte Flow-zytometrie-Methode zur Erkennung neutralisierende Antikörper oder andere Faktoren, die die zelluläre Aufnahme von Enzym-Ersatz-Therapien in einer menschlichen Matrix wie zerebralen spinalen Flüssigkeit (CSF) oder Humanserum stören.

Nachweis von Antikörpern, die die zelluläre Aufnahme von Enzym-Ersatz-Therapien mit einem zellbasierte Assays neutralisieren

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur murine granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T (THGM)-Helferzellen von naiven CD4 + T-Zellen, einschließlich Isolierung von naiven CD4 + T-Zellen, Differenzierung von THGM, zu differenzieren und Analyse von differenzierten Zellen THGM. Diese Methode kann auf Studien der Verordnung und Funktion von THGM Zellen angewendet werden.

In-vitro- Differenzierung von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) Maus-Herstellung von T-Helferzellen (THGM)

Diese Studie beschreibt eine Methode zur Isolierung von exosomenangereicherten extrazellulären Vesikeln, die immunstimulierende Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktoren aus embryonalen Stammzellen tragen.

Isolierung von exosomenangereicherten extrazellulären Vesikeln, die Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor aus embryonalen Stammzellen tragen

Wir stellen eine gentechnisch veränderte (GV-freie) Methode vor, um Zellen mit einem neuronalen Phänotyp aus reprogrammierten peripheren Blutzellen zu gewinnen. Die Aktivierung eines Signalwegs, der mit einem neuartigen menschlichen GPI-verknüpften Protein verbunden ist, zeigt eine effiziente GENV-freie Methode zur Gewinnung menschlicher pluripotenter Stammzellen.

GEN-freie Erzeugung von blutabgeleiteten neuronalen Zellen

Die Verwendung von Referenzreagenzien für Zytokinfreisetzungsassays ermöglicht reproduzierbarere und standardisierte In-vitro-Sicherheitsprofile von immuntherapeutischen monoklonalen Antikörpern. Im Folgenden wird beschrieben, wie Zytokin-Freisetzungsassays zusammen mit einem Referenzreagenzienpanel verwendet werden können, um die Sicherheit einiger therapeutischer monoklonaler Antikörper vorherzusagen.

Verwendung von Referenzreagenzien zur Bestätigung der Robustheit von Zytokin-Freisetzungsassays für die Vorhersage der Sicherheit monoklonaler Antikörper

Wir beschreiben eine kürzlich entwickelte Immunoassay-Plattform, die auf den Prinzipien der zellfreien synthetischen Biologie und der Dot-Blot-Technik zum individualisierbaren Nachweis der Antikörperantwort in menschlichen und tierischen Seren basiert.

Zellfreier Dot-Blot als praktische und anpassungsfähige Immunoassay-Plattform zum Nachweis der Antikörperantwort in humanen und tierischen Seren

Erfahren Sie eine zellfreie Bindungsanalyse zur Quantifizierung der neutralisierenden Kapazität von GM-CSF-Autoantikörpern. Diese Methode nutzt rekombinanten SGMR-Alpha aus transgenen Seidenspinnern.

Einem zellfreien Assay System Schätzung der neutralisierende Wirkung von GM-CSF Antikörper mit rekombinanten löslichen GM-CSF-Rezeptor (Video) | JoVE Journal

Einem zellfreien Assay System Schätzung der neutralisierende Wirkung von GM-CSF Antikörper mit rekombinanten löslichen GM-CSF-Rezeptor

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