Vibratom Sectioning für Enhanced Erhaltung der Zytoarchitektur der Säugetier-Corti-Organ

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, das Corti-Organ unter maximaler Erhaltung der zellulären Architektur abzubilden. Dies wird erreicht, indem die präparierten und fixierten Innenohren mit einem Vibroschneider in dicke Schnitte zerlegt werden, wodurch die Anzahl der Schnittflächen pro Cochlea minimiert wird. Die Vibromschnitte werden anschließend mittels Immunhistochemie gefärbt, was die Identifizierung verschiedener Zelltypen und zellulärer Strukturen im Corti-Organ ermöglicht.

Anschließend werden die Schnitte auf Objektträger aufgebracht und mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet, um hochauflösende Bilder zu erhalten, die die Z-Positionen in jeder dicken Vibram-Schnittstelle definieren. Die erhaltenen Ergebnisse ermöglichen die konfokale Mikroskopie der Zellen und Strukturen im Corti-Organ mit minimaler Störung durch den Schnittprozess. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Paraffin- und Kryoschnitten besteht darin, dass die mechanische Schädigung des Innenohrs minimiert wird, wodurch die zelluläre Architektur des Corti-Organs besser erhalten bleibt. Um das Innenohr zu isolieren, enthaupten Sie zunächst eine euthanasierte erwachsene Maus mit einer Rasierklinge.

Öffnen Sie den Schädel entlang der Mittellinie und entfernen Sie das Gehirn, um jedes Ohr vorsichtig mit einer Pinzette freizulegen, heben Sie beide Innenohren aus. Tauchen Sie die Innenohren in ein Kryoröhrchen mit frischem 4 % Paraformaldehyd und schwenken Sie es sanft über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag waschen Sie das Fixiermittel mit drei Wechseln von einmal Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung aus, entkalken Sie das erwachsene Gewebe durch Inkubation in 10 % EDTA bei vier Grad Celsius über fünf Tage.

Spülen Sie die Innenohren und lagern Sie sie in 1× PBS, bis sie zur Verarbeitung bereitstehen. Stellen Sie 4 % Niedrigschmelz-Agarose her, indem Sie die Agarose zu 1× PBS geben und im Mikrowellenherd erhitzen, bis die Agarose gelöst ist. Bewahren Sie die geschmolzene Agarose bis zur Verwendung in einem Wasserbad bei 55 °C auf.

Entfernen Sie das Innenohr mit einer Pinzette aus dem PBS und positionieren Sie es am Boden einer ablösbaren Einbettungsschale. Pipettieren Sie jegliche restliche Flüssigkeit ab und füllen Sie die Form anschließend mit vollständigem Überziehen des Innenohrs, um Querschnitte durch das Corti-Organs zu erzeugen. Positionieren Sie das Innenohr so, dass es lateral mit dem seitlichen Bogengang betrachtet wird.

Sichtbarer Winkel, das Innenohr derart, dass die Linie, die durch den hintersten Bereich der Cochlea gebildet wird, einen Winkel von 45 Grad gegenüber der beabsichtigten Schnittebene aufweist. Sobald das Agarose erstarrt ist, die Kunststoffform vorsichtig abziehen. Mit einer Rasierklinge überschüssige Agarose abschneiden und einen Würfel formen.

Stellen Sie sicher, dass genügend umgebendes Agar vorhanden ist, um das Gewebe gut zu stützen. Während des Schneidens befestigen Sie die Basis des Agarwürfels mit Sekundenkleber an der Schneidefläche des Vibroms, schneiden in einer Dicke von 40 bis 100 Mikrometer und sammeln die Schnitte in einer Schale mit 1× PBS, die 0,1 % Triton X-100 enthält, unter Verwendung einer Pinzette.

Lösen Sie die Aros von den Gewebeschnitten ab. Überführen Sie die Schnitte mit einer Pipettenspitze mit weiter Öffnung in eine Schale mit frischer 1× PBS, die 0,1 % Triton X-100 enthält, und führen Sie die Antikörperfärbung in einer Zellkulturplatte durch. Nach Abschluss der Antikörperfärbung werden die Gewebeschnitte auf einen Objektträger aufgebracht.

Um zu verhindern, dass die dicken Gewebeschnitte zerdrückt werden, bringen Sie eine Schicht Vakuumfett in einem Quadrat um den Schnitt herum an, um einen Abstand zwischen Deckglas und Objektträger zu schaffen. Überführen Sie den Gewebeschnitt auf einen Mikroskopobjektträger. Drücken Sie die Ränder des Deckglases fest nach unten, um eine Abdichtung zu erzeugen.

Alternativ pipettieren Sie einen Ein-Mikroliter-Tropfen der Aros-Chromatographie auf die Harzoberfläche mit bekannter Maschenweite in jede der vier Ecken, an denen die Deckplatte aufliegen wird, legen Sie die Deckplatte auf und versiegeln Sie die Ränder mit Nagellack, bevor Sie im ersten Bild eines konfokalen Zack durch einen Organschnitt des Cor T die angrenzenden inneren Haarzellen, äußeren Haarzellen und Dieter-Zellen abbilden. Bei nuklearer Färbung sind die Säulenzellen mittels S-100-Antikörper-Färbung sichtbar und erscheinen gelb. Während der Zack in 3-Mikrometer-Schritten durch den Schnitt verläuft, kann die Anzahl der Säulenzellen gezählt werden, indem das Erscheinen und Verschwinden ihrer Kerne beobachtet wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Innenohr mittels Vibrom säkzioniert, anschließend Immunhistochemie an diesen Schnitten durchführt und diese dann mittels konfokaler Mikroskopie bildet. Dieses einfache, auf jeden Antikörper übertragbare Verfahren gewährleistet eine maximale Erhaltung der zellulären Organisation des Corti-Organs.