Name: Visualisierung der interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) Netzwerk in Mäuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Lernen Sie die Visualisierung von Cajal-Zell-Netzwerken im Magen-Darm-Trakt von Mäusen mittels Immunfluoreszenz. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der ICC-Architektur in Ganzpräparaten und Querschnitten.

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Diese Arbeit wurde von der National Cancer Institute (K08CA140946, um YC), (5F32CA130372 zu PC), (R01CA102774 und R01HL055748 zu PB), das Department of Defense (PC094302 zu YC), die Shuman Family Fund für GIST-Forschung (unterstützt PC), und die Starr Cancer Consortium (auf PC, YC, CLS-und PB). Wir möchten Katia Manova, Ning Fan und Mesurh Turkekul der MSKCC Molekulare Zytologie Core Facility für die Hilfe bei Kryoschneiden und Immunfärbung danken.

1. Dissection der Maus GI-Trakt <ol><li> Eingeschläfert Mäusen durch lokale IUCAC Richtlinien </li><li> Pin jedes Glied auf Styropor Oberfläche und spülen Bauchdecke mit 70% Ethanol. Öffnen Bauchhöhle mit langen Mittellinienschnitt von der Membran bis zum Schambein. Machen Sie einen am distalen Speiseröhre und einen zweiten Schnitt am distalen Dickdarm schneiden und entfernen Sie die GI-Trakt vom Magen bis zum Anus en bloc, sorgfältig schneiden Bänder in den Zwölffingerdarm und Blinddarm mit einer kleinen Schere. Legen GI-Trakt in einer Petrischale mit PBS. Dissect weg Mesenterium mit einer Pinzette (Abbildung 1). Um Magen, Dünndarm und Dickdarm, Schnitt am Pylorus und Bauhin Kreuzung zu trennen. Spülen Sie das Lumen der einzelnen Teile des GI-Trakts mit PBS mit einer 5ml-Spritze an einer Fütterung Nadel (ältere Mäuse) oder stumpfen Nadel (jüngere Mäuse). </li><li> Offene Magen, Dünndarm und Dickdarm entlang der mesenterialen Grenze. Schneiden Sie zwei Stücke für jeden Teil des Magen-Darm-Trakt, eine für ganze Berg Visualisierung und eine für Gefrier. </li></ol> 2. Whole mount Probenvorbereitung und Immunfärbung <ol><li> Legen Sie das gesamte Stück von jedem Teil des GI-Trakt in ein 1,5 cm Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,0 ml eiskaltem Aceton und fix Proben für mindestens 1 Stunde gefüllt bei 4 ° C. Die Proben können bis zu 1 Woche bei -20 ° C gelagert werden Wir typischerweise Lagerung von Proben in Aceton und fahren Sie mit cyrosections vorzubereiten. </li><li> Wash Probe 2X mit PBS. Wägegut in Petrischale mit PBS. Unter Sezieren miscroscope vorsichtig abkratzen Schleimhautschicht mit einem Skalpell, indem das eine Ende mit einer Pinzette, so dass die Muscularis. </li><li> Muscle können in 5mm Stücke für Färbung mit verschiedenen Antikörpern geschnitten werden. Nicht mehr als 2 Tage in PBS vor der Färbung. </li><li> Block-und Inkubationsschritte können in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte oder in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen durchgeführt werden. Block mit 0,5 ml Blocking-Puffer (5% Ziegenserum, 0,1% Triton X-100 in PBS für 1 Stunde bei 4 ° C). </li><li> Inkubieren mit dem primären Antikörper in Blocking-Puffer verdünnt und drehen über Nacht bei 4 ° C. Wir haben erfolgreich ACK-2 Ratte anti-Kit, Kaninchen-Anti-Ano1 und Kaninchen-Anti-Pgp9.5 Antikörper für ganze Berg Immunfärbung verwendet. </li><li> Wash für 5 min 2X mit PBS auf Rotator bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubieren mit sekundärem Antikörper in Blocking-Puffer für 2 Stunden bei Raumtemperatur auf Rotator verdünnt. Wir verwenden in der Regel Alexa Fluor 488 Anti-Kaninchen-und Alexa Fluor 594 Anti-Ratte-Antikörper. </li><li> Wash für 15 min 3X mit PBS auf Rotator bei Raumtemperatur. </li><li> Berg auf dem Objektträger, serösen Seite nach oben, um die Orientierung des Gewebes während der Mikroskopie zu gewährleisten. Diese Ausrichtung wird sichergestellt, der serösen Seite des Deckglases Gesicht und erste angetroffen werden als in die Folie auf einem Mikroskop fokussiert. Wir tun dies auf einem Binokular. Manchmal gehen wir kurz untersuchen das Gewebe unter der Fluoreszenzmikroskopie richtig orientieren. Unter Fluoreszenzmikroskopie Kit oder Ano1 visualisieren, sollte man die ICC-MY-Netzwerk der ersten Begegnung von der Seite des Deckglases. Als nächstes absaugen PBS so viel wie möglich, ohne sie komplett trocknen. Add 50 ul hart eingestellt Eindeckmittel (wir verwenden Verlängern Gold) und sanft Ort Deckglas auf Gewebe. Erlaubt das Setzen der Montage über Nacht bei Raumtemperatur und Objektträger bei -80 ° C. </li><li> Für die mikroskopische Untersuchung verwendeten wir eine Weitfeld-Mikroskop mit einem Z-Antrieb. Wir haben entweder einen 20X Luft Objektiv (NA 0,75, Plan-Apochromat) oder 60X Öl-Objektiv (NA 1.4, Plan-Apochromat) und nahm 2 um oder 1 mu m Z-Profile, die sich über die gesamte muscularis. Die Bilder wurden anschließend zerlegt mit Autoquant Dekonvolution Software. Alternativ haben viele andere konfokale Mikroskopie, anstatt mit ähnlichen Ergebnissen verwendet. </li></ol> 3. Gefrier Vorbereitung und Immunfärbung <ol><li> Legen Sie jeden Teil des GI-Trakts, serösen Seite nach unten flach auf Filterpapier. Cut-Filter Papier um das Gewebe. Legen Gewebe auf Filterpapier in 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS (wir verdünnte 32% Paraformaldehyd in verschlossenen Fläschchen in PBS kurz vor Gebrauch) für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Oder 12-Well-Platte je nach Größe des Gewebes, oder in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen - Fixation kann in einem 6 durchgeführt werden. Wenn in der Platte getan, um Parafilm minimieren PFA Exposition. Längere Fixierung Zeiten können in Antigen Maskierung führen, insbesondere für die ACK-2 anti-Kit-Antikörper. </li><li> Entfernen Gewebe aus PFA und in 30% Saccharose in PBS. Lassen Gewebe über Nacht versinken in 4 ° C. </li><li> Äquilibrieren Gewebe mit 1:1-Verhältnis von 30% Saccharose und OCT für 1 Stunde. Dann montieren Gewebe vertikal in cryomold mit OCT gefüllte Die Längsachse des GI-Trakts sollte parallel zu den cyrosections werden. Bei der Prüfung Mäuse mit unterschiedlichen Genotypen oder mit verschiedenen Behandlungen, kann es nützlich sein, um Gewebe aus verschiedenen Mäusen auf gleiche cryomold montieren, um parallele Verarbeitung zu gewährleisten. Freeze auf Trockeneis und in -80 ° C Tiefkühltruhe für die Lagerung. </li><li> Cut 10 pm Kryoschnittenauf Rutsche und bei -80 ° C Gefrierschrank. Wir in der Regel schneiden Sie zwei Abschnitte pro Folie. Wir übernehmen in der Regel H &amp; E Färbung eines Gefrier gleiten. </li><li> Für Immunfluoreszenz zunächst ausgleichen slide bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Dann ziehen Kreis um Gewebe mittels PAP Stift. </li><li> Block mit 150 ul Blocking-Puffer (wie bei Whole Mount Immunfärbung) für 1 Stunde. </li><li> Saugen Sie Blockierungspuffer und fügen 150 pl primärer Antikörper in Blocking-Puffer verdünnt und inkubieren Nacht bei 4 ° C in einer feuchten Kammer. </li><li> Wash 5 min 2X mit PBS. </li><li> Inkubieren mit sekundärem Antikörper in Blocking-Puffer für 2 Stunden bei Raumtemperatur verdünnt. Wir verwenden in der Regel Alexa 488 Anti-Kaninchen-und Alexa 594-anti-Ratte Antikörper. </li><li> Wash für 15 min 3X mit PBS. </li><li> Saugen Sie gleiten, ohne vollständig trocknen Gewebe. Fügen Sie einen Tropfen hart eingestellt Eindeckmittel mit DAPI (wir verwenden Verlängern Gold) und Platz # 1.5 Deckglas. Legen Sie gleiten über Nacht bei Raumtemperatur zu setzen und in -80 ° C Gefrierschrank lagern. </li><li> Erwerben Sie dreifach Fluoreszenzbilder mit DAPI, FITC und Texas Red-Filter-Sets. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Hier verwenden wir den Dickdarm als Beispiel. H &amp; E eines Saccharose Flecken geschützt festen gefrorenen Abschnitt Immunfluoreszenz verwendet zeigt einige Artefakte, um einen Verweis Paraffinschnitt (Abbildung 2), verglichen, wo die gelbe Linie renzeichen der Plexus myentericus zwischen der Kreis-und Längs-Muskelschichten und die grüne Linie renzeichen der Grenze zwischen den Schleimhaut und muscularlis. Die Untersuchung der Gefrier, von der Serosa zu Schleimhaut Sie die erste Begegnung der dünneren Längsmuskulatur (LM)-Schicht durch die dickeren Ringmuskel (CM) Schicht. Der Abschnitt sollte parallel zu den Längs-Muskel, so dass die Kerne der LM etwas länglich sein sollte, während die Kerne der CM sollte klein und rund. Zwischen den LM und CM sind myentericus plexi von Neuronen, die mit Pgp9.5 Fleck gemacht. Pgp9.5 auch Flecken neuronale Prozesse in der gesamten CM. Die myentericus ICC-Netzwerk (ICC-MY) umgeben den Plexus myentericus und der multipolaren Zellen. Innerhalb der Längs-Muskelschicht, gibt es seltene intramuskuläre ICCs (ICC-IMs), die bipolare Zellen laufen parallel zu den Muskeln. Innerhalb der Ringmuskelschicht, gibt es reichlich ICC-IMs, die auch bipolare Zellen, die parallel mit der kreisförmigen Muskeln und sind im Querschnitt mit diesem Schnitt. An der Kreuzung der Muscularis und Submucosa, ist die submuköse ICC-Netzwerk, bestehend aus ICC-SMP einem flachen Netz von multipolaren ICCs. Die Untersuchung der ganze Berg Kit Immunfärbung des Dickdarms, sollte man erwarten, dass die ICC-MY-Netzwerk der ersten Begegnung, und dann das ICC-IM des CM und ICC-SMP-Netzwerke, wie man aus dem Deckglas konzentriert (Figure. 3) . Volumetrische Messung der ICC-Netzwerke mit 3D-Rekonstruktion von ganzen-mount Bilder wurden 10 beschrieben. Mit Weitwinkel-Mikroskop, gibt es signifikante out-of-plane-Fluoreszenz in den RAW-Bildern, die nach Entfaltung entfernt werden (Abbildung 3) kann. Unvollständige Abisolieren der Schleimhaut wird in hoher Hintergrundfluoreszenz führen. ANO1 ist ein weiterer Marker für ICC und Co-Immunfärbung von KIT und ANO1 zeigt die vollständige Überlappung von ICC-Färbung (Abbildung 4). <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Representative seziert Maus Gastrointestinaltrakt, mit Genehmigung 13. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. A) Repräsentative H &amp; E Färbung der Maus Dickdarm Kryoschnitten wie beschrieben hergestellt und Referenz in Paraffin eingebetteten Abschnitt zeigt eine gewisse Schrumpfung Artefakte Kryoschnitten. Die gelbe Linie renzeichen der Plexus myentericus und die blaue Linie trennt die Schleimhaut von der muscularis. B) Vertreter Kit (rot, ACK-2) und Pgp9.5 (grün) Doppel-Immunfluoreszenz mit DAPI (blau) Gegenfärbung der Maus Dickdarm. LM: Längsmuskel CM: Ringmuskel. Maßstabsleiste 20 um. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Representative Kit (rot, ACK-2) ganz-mount Immunfluoreszenz von dem gleichen Feld in drei Fokusebenen, die ICC-MY-Ebene an der LM / CM Grenze, die ICC-IM Flugzeug in der CM und die ICC- SMP-Ebene an der CM / Submukosa Grenze. Raw-Bilder und entfalteten Bilder angezeigt werden. Maßstabsleiste 20 um. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Representative Doppel-Immunfluoreszenz Ano1 (grün) und Kit (rot, ACK-2) im Dickdarm. Maßstabsleiste 20 um.

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</ol>

Interstitiellen Zellen von Cajal wurden zunächst von Santiago Ramóón y Cajal genau ein Jahrhundert zuvor mit Methylenblau und Silberchromat Flecken von Magen-Darm-muscularis aus. Cajal ursprünglich angenommen ICC wurden Neuronen auf ihre Prozesse zugrunde, dass die an der Axone und Dendriten sind. Über viele darauf folgenden Jahren hat Studium der Biologie ICC durch einen Mangel an spezifischen Markern bis zur Entdeckung des KIT ist nicht nur in ICC ausgedrückt beschränkt, sondern ist auch für ihre Entwicklung 6 erforderlich. Seitdem hat sich KIT Immunfluoreszenz weithin in das Studium der ICC Biologie verwendet und hat auch auf die Aufwertung des ICC in anderen kontraktilen Organe wie die Harnblase geleitet. Vor kurzem hat ANO1 als zweite zuverlässiger ICC-Marker identifiziert worden. Es hat zahlreiche Publikationen über die vergangenen 15 Jahre mittels Immunfluoreszenz auf ICC identifizieren anhand verschiedener Fixierung und Montage-Techniken wurden. In unseren Händen &quot;fixed-frozen&quot; Gefrierschnitte, die mit Paraformaldehyd und Saccharose geschützt wurden vorangestellt funktioniert am besten in Aceton oder Paraformaldehyd Postfixierung nach Kryoschneiden verglichen. Für ganze Reittiere, haben wir festgestellt, dass Aceton-Fixierung durch Schleimhaut-Dissektion folgte der robustesten Ergebnisse liefert. Historisch gesehen hat die ACK-2 die Kit-Antikörper der Wahl für die Maus ICC Identifizierung. Es ist eine Ratte monoklonale dass die extrazelluläre Domäne erkennt und es ist auch eine blockierende Antikörper, Ileus verursacht, wenn gegeben, um Mäuse zu leben. Allerdings ist die ACK-2 Epitop langsam durch Paraformaldehyd Fixierung zerstört und wird nicht von Standard-Antigen-Retrieval-Methoden gerettet. Wir haben festgestellt, dass die ACK-4-Epitop widerstandsfähiger gegen Paraformaldehyd Fixierung ist. Im Vergleich zu festen gefrorenen Blöcke und Sektionen, in Paraffin eingebettete Blöcke und Sektionen bewahrt Morphologie besser aus und ist eher für die langfristige Archivierung (Abbildung 4). Weder ACK-2 noch ACK-4 wurden erfolgreich in Paraffinschnitten verwendet. Wir haben dadurch gekennzeichnet, dass D13A2, ein neues Kaninchen monoklonaler Antikörper, außergewöhnlich gut funktioniert in beide Fest-gefroren und Paraffinschnitten des GI-Trakts. Kit wird in verschiedenen anderen Zelltypen, einschließlich Melanozyten, hämatopoetischen Zellen, Keimzellen, insbesondere Mastzellen, die auch in der GI-Trakt finden ihren Ausdruck. Glücklicherweise sind die meisten Mastzellen gefunden wird die Schleimhaut und nicht in der Muscularis. Doppelfärbung mit Kaninchen-Anti-Ano1 und Ratte anti-Kit beseitigen können nicht-spezifische Färbung jedes Antikörpers (Abbildung 4). Es ist auch erwähnenswert, dass die relative Expression von Kit und Ano1 zwischen Unterklassen von ICC verschiedenen scheint. Zum Beispiel in den Dünndarm, ist Kit Färbung viel intensiver in myentericus ICC im Vergleich zum ICC der tiefen Muskulatur Plexus während Ano1 Färbung ist vergleichbar.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Ratte anti-Kit-Antikörper (Klon ACK-2) </td><td> eBioscience </td><td> 14-1172 </td><td> Verwenden Sie bei 2μg/ml. Epitope ist mit overfixation verloren. </td></tr><tr><td> Ratte anti-Kit-Antikörper (Klon ACK-4) </td><td> Cedarlane </td><td> CL8936AP </td><td> Verwenden Sie bei 2μg/ml. </td></tr><tr><td> Kaninchen-Anti-KIT-Antikörper (Klon D13A2) </td><td> Cell Signaling </td><td> 3074 </td><td> Verwenden Sie bei 1:100 Verdünnung. Nur Antikörper hier, das funktioniert auch in Paraffinschnitten aufgeführt. </td></tr><tr><td> Kaninchen-Anti-Pgp9.5 Antikörper </td><td> Abcam </td><td> ab10404 </td><td> Labels neuronalen Zytoplasma. Nützlich für Kennzeichnung Neuronen des Plexus myentericus. Verwenden Sie bei 1:1000 Verdünnung. </td></tr><tr><td> Kaninchen-Anti-Ano1 Antikörper </td><td> Abcam </td><td> ab53212 </td><td> Verwenden Sie bei 2μg/ml </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 Ziege anti-Ratte-IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11007 </td><td> Verwenden Sie bei 2μg/ml </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Ziege anti-Kaninchen IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11008 </td><td> Verwenden Sie bei 2μg/ml </td></tr><tr><td> Tierfütterung Needle </td><td> Fischer </td><td> 01-208-87 </td><td> Silicon gekippt Nadel nützlich für die Spülung GI-Trakt von erwachsenen Mäusen </td></tr><tr><td> Stumpfen Nadel </td><td> Becton Dickison </td><td> 305180 </td><td> Stumpfe Nadel nützlich für die Spülung GI-Trakt von pre-entwöhnt Welpen </td></tr><tr><td> ProLong Gold-Antifade Reagenz mit DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P-36931 </td><td> Mai alternative Hard-Einstellung Eindeckmittel mit DAPI verwenden </td></tr><tr><td> Tissue-Tek Cryomold </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4557 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek OCT </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 32% Paraformaldehyd (10ml versiegelten Ampulle) </td><td> EM Sciences </td><td> 15714 </td><td> Öffnet versiegelte Ampulle und verdünnt auf 4% unmittelbar vor dem Gebrauch </td></tr><tr><td> Blocking-Puffer </td><td></td><td></td><td> 5% Ziegenserum, 0,1% Triton X-100 in PBS </td></tr></tbody></table>

visualisierung der interstitiellen zellen von cajal (icc) netzwerk in mäuse

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

Die interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) sind mesenchymale abgeleitet &quot;Schrittmacher-Zellen&quot; des Magen-Darm (GI-Trakt), die eine spontane langsame Wellen für Peristaltik erforderlich generieren und vermitteln neuronalen Input aus der enterischen Nervensystems system1. Verschiedene Subtypen des ICC Form unterschiedliche Netze in der Muscularis des GI-Trakts 2,3. Verluste oder Verletzungen zu diesen Netzen ist mit einer Reihe von Motilitätsstörungen 4 zugeordnet. ICC-Zellen exprimieren den KIT-Rezeptor-Tyrosin-Kinase an der Plasmamembran und KIT Immunfärbung für die letzten 15 Jahre verwendet wurde, um die ICC-Netz 5,6 Etikett. Wichtig ist, dass normale KIT Aktivität für ICC Entwicklung 5,6 erforderlich. Neoplastischen Transformation von ICC-Zellen führt zu gastrointestinalen Stromatumoren (GIST), die häufig Hafen gain-of-function Mutationen KIT 7,8. Wir haben kürzlich gezeigt, dass ETV1 einer Linie-spezifische Überleben Faktor in der ICC / GIST Linie zum Ausdruck kommt und ist ein Meister Transkriptionsregulator sowohl für normale ICC-Netzwerk Bildung und des GIST Tumorgenese 9 benötigt. Wir zeigen ferner, dass es mit aktivierenden KIT-Mutationen in der Tumorgenese kooperiert. Hier beschreiben wir Methoden zur Visualisierung von ICC-Netzwerke in Mäusen, die weitgehend auf bereits veröffentlichten Protokollen 10,11 basieren. In jüngerer Zeit hat die Chlorid-Kanal anoctamin 1 (ANO1) auch als Membran-Marker der ICC 11,12 charakterisiert worden. Aufgrund ihrer Plasmamembran-Lokalisierung, können Immunfluoreszenz beider Proteine ​​verwendet werden, um die ICC-Netzwerke zu visualisieren. Hier beschreiben wir die Visualisierung der ICC-Netzwerke durch feste gefrorene cyrosections und whole mount Präparaten.

Die interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) sind die Schrittmacher-Zellen des Magen-Darm (GI-Trakt). Sie bilden komplexe Netzwerke zwischen glatten Muskelzellen und postganglionären Neuronen Fasern GI Kontraktilität zu regulieren. Hier präsentieren wir Immunfluoreszenzverfahren Querschnitts-und Ganzkörper-Mount-Visualisierung von Maus-ICC-Netzwerke.

Visualisierung der interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) Netzwerk in Mäuse

Die interstitiellen Cajal-Zellen (ICC) sind mesenchymale „Schrittmacherzellen“ des Gastrointestinaltraktus (GI-Trakt), die spontane Slow Waves erzeugen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ICC-Netzwerke des Maus-Gastrointestinaltrakts sichtbar zu machen. Dazu wird zunächst der gesamte Gastrointestinaltrakt disseziert und isoliert, anschließend in Magen, Dünndarm, Z盲ndel und Dickdarm getrennt. Danach wird jeder Teil des Gastrointestinaltrakts entweder mit Aceton fixiert, gefolgt von der Entfernung der Mukosa f眉r die Ganzpr盲parat-Auflichtung, oder mit w盲ssriger Formaldehydl枚sung fixiert, gefolgt von Einbettung und Kryoschnitte f眉r die Querschnittsbildgebung.Anschließend werden die Proben immunhistochemisch mit Antikörpern gegen Kit und andere Epitope gefärbt, um ICC und andere relevante Strukturen zu markieren. Abschließend werden Bilder mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops aufgenommen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Auswirkungen genetischer oder umweltbedingter Manipulationen an Mäusen auf die Architektur der ICC mittels Immunfluoreszenzmikroskopie zeigen.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der ICC-Forschung beantworten, beispielsweise wie spezifische Signalnetzwerke und Transkriptionsfaktoren die Architektur von ICC-Netzwerken beeinflussen. Personen, die neu in dieser Methode sind, werden in der Regel Schwierigkeiten haben, da eine unsachgemäße Entfernung der Mukosaschicht und eine falsche Orientierung des Präparats erhebliche Hintergrundanfärbungen und einen Verlust des spezifischen Signals verursachen können. Um die Dissektion des gastrointestinalen Trakts der Maus zu beginnen, befestigen Sie die Gliedmaßen einer euthanasierten Maus auf einer Styroporoberfläche und spülen die Bauchdecke mit 70 %igem Ethanol ab. Öffnen Sie die Bauchhöhle mit einem langen medianen Schnitt von dem Zwerchfell bis zum Schambein.Führen Sie einen Schnitt am distalen Ösophagus und einen zweiten Schnitt am distalen Colon durch und entfernen Sie den gesamten Gastrointestinaltrakt vom Magen bis zum Anus en bloc. Durchtrennen Sie vorsichtig die Ligamente am Duodenum und Ileum mit einer kleinen Schere. Legen Sie den Gastrointestinaltrakt in eine Petrischale mit PBS.Lösen Sie das Mesenterium mit einer Pinzette ab, um Magen, Dünndarm und Dickdarm zu trennen. Durchtrennen Sie den Pylorus und den Ileozäkalkanal mit einer 5-mL-Spritze, an die eine Fütterungsnadel oder stumpfe Nadel angebracht ist. Spülen Sie das Lumen jedes Abschnitts des Magen-Darm-Trakts mit PBS aus.Öffnen Sie den Magen, das Kleine und das Große Darm entlang der mesenterialen Grenze. Schneiden Sie von jedem GI-Organ zwei Stücke ab, eines für die Ganzpräparat-Darstellung und eines für Kryoschnitte. Fixieren Sie die Ganzpräparat-Probe vor der Kryosektionierung in Aceton, um die Probe für die Immunfärbung vorzubereiten.Zunächst die Probe zweimal in PBS waschen. Anschließend die Probe in eine Petrischale mit PBS unter einem Stereomikroskop geben. Vorsichtig mit einem Skalpell die Mukosaschicht abschaben, wobei man ein Ende mit einer Pinzette festhält, entfernt die Muscularis und schneidet den Muskel in fünf Millimeter große Stücke zur Färbung mit verschiedenen Antikörpern. Speichern Sie die Probe nicht länger als zwei Tage vor der Färbung in einem 1,5-Milliliter-Mikroabfallröhrchen. Inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang bei vier Grad Celsius in Blockierpuffer. Anschließend inkubieren Sie die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius unter Rotation in primären Antikörpern, die im Blockierpuffer verdünnt wurden.Wir haben erfolgreich einen CK zwei-Ratten-anti-Kitt-Kaninchen-anti-a-O-eins- und einen Kaninchen-anti-PGP-9.5-Antikörper für die Ganzpräparat-Färbung verwendet. Am nächsten Morgen die Proben zwei Mal je fünf Minuten in PBS mit sanftem Rotieren waschen.Anschließend die Proben zwei Stunden lang mit sekundären Antikörpern, die in Blockierpuffer verdünnt wurden, inkubieren. Üblicherweise verwenden wir bei Raumtemperatur Alexa Fluor 488 Anti-Kaninchen- und Alexa 594 Anti-Ratte-Antikörper. Die Proben dreimal für jeweils 15 Minuten in PBS waschen.Unter Verwendung eines Stereomikroskops die Proben auf Objektträgern mit der serösen Seite nach oben montieren, indem so viel PBS wie möglich entfernt wird. Etwa 50 Mikroliter hart werdendes Montagemedium auftragen und ein Deckglas darauf platzieren. Das Montagemedium über Nacht aushärten lassen und die Objektträger bei minus 80 Grad Celsius lagern.Verwenden Sie zum Betrachten und Aufnehmen ein Mikroskop mit großem Bildfeld. Mit einem Z-Antrieb verwenden wir entweder ein 20-mal Luftobjektiv oder ein 60-mal Öl-Objektiv und nehmen Z-Schnitte von ein oder zwei µm auf, die die gesamte Muscularis umfassen. Die Bilder werden anschließend mit Auto-Quant-Entfaltungssoftware entfaltet.Alternativ kann die konfokale Mikroskopie verwendet werden, um Kryoschnitte für die Immunfärbung vorzubereiten. Legen Sie jeden Teil der Speiseröhre lumenseitig flach auf Filterpapier. Schneiden Sie das Filterpapier um das Gewebe herum zurecht.Legen Sie das Gewebe auf das Filterpapier in 4 % Paraldehyd in PBS und lassen Sie es zwei Stunden bei Raumtemperatur einwirken. Längere Fixierungszeiten können zu einer Antigenmaskierung führen, insbesondere bei dem a K zwei anti kit Antikörper. Überführen Sie das Gewebe in 30 % Saccharose in PBS und lassen Sie das Gewebe über Nacht bei vier Grad Celsius absinken.Das Gewebe eine Stunde lang mit einem Verhältnis von eins zu eins aus 30 % Saccharose und OCT äquilibrieren. Anschließend das Gewebe vertikal in einer mit OCT gefüllten Kryoschablone montieren. Die Längsachse des Magen-Darm-Trakts sollte parallel zu den Kryoschnitten verlaufen.Bei der Untersuchung von Mäusen mit unterschiedlichen Genotypen oder aus unterschiedlichen Behandlungsgruppen kann es sinnvoll sein, das Gewebe verschiedener Mäuse auf dieselbe Kryoschneideform zu montieren. Um eine parallele Verarbeitung sicherzustellen, frieren Sie die Formen auf Trockeneis ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Schneiden Sie 10 µm dicke Kryoschnitte auf Objektträger, wobei zwei Schnitte pro Objektträger platziert werden, und lagern Sie diese bei minus 80 Grad Celsius.Wir führen typischerweise die H- und D-Färbung für die Immunfluoreszenz auf einem Objektträger durch. Zunächst die Objektträger 15 Minuten bei Raumtemperatur äquilibrieren. Anschließend mit einem Pap-Pen einen Kreis um das Gewebe zeichnen.Inkubieren Sie die Schnitte in 150 Mikrolitern Blockpuffer für eine Stunde. Aspirieren Sie den Blockpuffer und geben Sie 150 Mikroliter primären Antikörper, der in Blockpuffer verdünnt wurde, hinzu; inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer. Waschen Sie zweimal mit PBS je fünf Minuten lang und inkubieren Sie die Proben anschließend zwei Stunden mit sekundären Antikörpern, die in Blockpuffer verdünnt wurden.Bei Raumtemperatur verwenden wir in der Regel Alexa 488-markierte Antikörper gegen Kaninchen und Alexa 594-markierte Antikörper gegen Ratte. Waschen Sie die Schnitte dreimal für jeweils 15 Minuten in PBS, sprühen Sie die Objektträger ab, ohne das Gewebe vollständig austrocknen zu lassen. Geben Sie einen Tropfen hart werdendes Eindeckmedium mit DAPI hinzu und legen Sie einen Deckgläser Typ 1,5 darauf.Die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur platzieren, um die Proben mit dpi-, fite- und Texas-rot-Filter-Sätzen abzubilden. Untersuchung des Dickdarms vom Zäkum bis zur Mukosa. Zunächst stößt man auf die dünnere Schicht der Längsmuskulatur oder LM, gefolgt von der dickeren Ringmuskulatur oder cm.Der Schnitt sollte parallel zur Längsmuskulatur und senkrecht zur Ringmuskulatur verlaufen, sodass die Kerne der Längsmuskulatur (LM) etwas gestreckt erscheinen, während die Kerne der Ringmuskulatur (CM) klein und rund sind. Zwischen der LM und der CM befinden sich die aus Neuronen bestehenden myenterischen Plexus, die mit PGP 9.5 angefärbt werden. PGP 9.5 färbt außerdem neuronale Fortsätze im gesamten Verlauf der CM an. Bei der Betrachtung des Präparats vom Deckglas aus, werden Sie auf die Struktur I-C-C-M-Y-I-C-C-I-M der CM und I-C-C-S-M-P treffen.Das myenterische ICC-Netzwerk umgibt das myenterische Plexus und besteht aus multipolaren Zellen innerhalb der Schicht der Längsmuskulatur. Es gibt seltene intramuskuläre ICC, die bipolar sind und parallel zur Muskulatur in der Schicht der Ringmuskulatur verlaufen. Häufig vorhanden sind die ICC-ims, die ebenfalls bipolar sind und parallel zur Ringmuskulatur verlaufen; sie werden in diesem Schnittabschnitt an der Grenze zwischen Muscularis und Submukosa quer durchgeschnitten.Das submuköse ICC-Netzwerk ist ein flaches Netzwerk multipolarer Zellen. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in drei Tagen durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Sie sollten ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den gastrointestinalen Trakt der Maus präpariert und immunohistochemisch färbt, um die ICC-Architektur zu beobachten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier entwickeln wir die notwendigen Werkzeuge...

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