Alginat Hydrogele für Three-Dimensional Organ Culture der Eierstöcke und Eileitern

Dieses Verfahren beschreibt die Vermehrung normaler ovarieller und duktiler Epithelzellen als dreidimensionale Organkultur. Präparieren Sie zunächst das UCT-Fettpolster des Eierstocks und einen Teil der Gebärmutter von einer Maus. Entfernen Sie dann den Schleimbeutel und präparieren Sie die duktilen Membranen mit einer Pinzette auseinander und schneiden Sie jeden Eierstock oder UCT in zwei bis vier Stücke, die als Organoide bezeichnet werden.

Zum Schluss verkapseln Sie das Organoid in einem Alginattröpfchen auf einem Stück Netzfaser. Da OSC und TEC in definierten Medien kultiviert werden, behalten sie die normalen Zelleigenschaften in ihrer nativen dreidimensionalen Architektur bei. Immunhistochemie an Gewebeschnitten, RNA-Analysen und Proteinanalysen können Aufschluss über die Auswirkungen von OSC und TEC bei Eierstockkrebs geben.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu herkömmlichen zweidimensionalen immortalisierten Zellkulturen besteht darin, dass die Zellen in Kontakt mit der darunter liegenden extrazellulären Matrix und Stromazellen gezüchtet werden können, ohne dass genetische Unsterbliche die zellulären Signalwege verändern könnten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des Eierstockkrebses zu beantworten, wie z.B. die Definition früher Ereignisse in der Krebsentstehung und die Bestimmung, aus welchem Zelltyp seröse Eierstockkrebsarten entstehen. Obwohl diese Methode Einblicke in das Thema Eierstockkrebs geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie die Eierstockfollikelkultur und die Beta-Ösenkultur der Bauchspeicheldrüse angewendet werden.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die Entfernung der Schleimbeutel und der UC-Membranen ohne Schädigung der Eierstöcke und der UCT eine Herausforderung darstellt. Bereiten Sie zunächst eine 0,5%ige Alginatlösung in sterilem PBS vor und erhitzen Sie sie auf 37 Grad Celsius, gemischt durch Inversion oder Schaukeln. Ziehen Sie dann das Alginat mit einer 25-Gauge-Nadel in eine Ein-Milliliter-Spritze und halten Sie eine Temperatur von 37 Grad Celsius aufrecht.

Bereiten Sie anschließend eine 10 millimolare Calciumchloridlösung zum Vernetzung des Alginats nach der Gewebeverkapselung vor und erwärmen Sie sie auf 37 Grad Celsius. Bereiten Sie außerdem einen Milliliter Kulturmedium pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte für jedes Experiment vor, das verschiedene Medikamente, Peptide oder Viren in das Kulturmedium enthält. Wenn Sie die Organe des Tieres präparieren, entfernen Sie jegliches Fett oder Restgewebe.

Ziehen Sie vorsichtig die Bohrermembran ab, die den Eierstock umgibt, und schneiden Sie den Eierstock oder UCT in vier Stücke, indem Sie das Organ halbieren, um das Eileitergewebe vorsichtig abzuwickeln. Ziehen Sie die Verbindungsmembranen auseinander und verlängern Sie die Enden des Rohrs in entgegengesetzte Richtungen. Mit einer Pinzette.

Geben Sie vor dem Schneiden ein einzelnes Alginattröpfchen etwa zwei Mikroliter auf eine sterilisierte Netzfaser. Bewegen Sie mit einer sterilen Pinzette ein Organstück in das Alginattröpfchen und zentrieren Sie das Tröpfchen, um das Tröpfchen mit dem Organoid umzukehren. Drehen Sie die Netzfaser um und lassen Sie die Schwerkraft das Alginat in einen hängenden Tropfen am Rand einer 10 Zentimeter großen Petrischale drücken, die 10 millimolare Calciumchloridlösung enthält.

Klopfen Sie mit der Pinzette so, dass der Tropfen in Lösung fällt. Zwei Minuten inkubieren. Mit einem sterilen Löffel mit Poren entfernen, um zusätzliche 10 millimolare Calciumchloride freizusetzen, und für einen definierten Zeitraum in die Kulturmedium überführen.

Für die Solubilisierung des Alginatgels inkubieren Sie die Kulturen in 3,4 Milligramm pro Milliliter. Alginat-Lyase, die in Ovitz gelöst ist, ist L 15. Medien bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten oder bis sich das Gel vollständig aufgelöst hat.

Entfernen Sie dann das Gewebe von der Alginat-Lyase. Um nun das OSE zu sammeln, inkubieren Sie das Organoid mit 500 Einheiten Kollagenase in der Ovitz-ISS. L 15 Medium für eine Stunde Wirbel in zwei Sekunden Impulse bei mittlerer Leistung für eine Minute, gefolgt von einer Sekunde.

Pulsiert eine Minute lang. Lassen Sie die Organstücke auf den Boden des Mikrozentrifugenröhrchens fallen und pipettieren Sie das Supernat drei Minuten lang bei 3000 U/min in eine frische sterile Mikrozentrifugenröhrchenzentrifuge, um das Oberflächenepithel der Eierstöcke zu pelletieren. Um schließlich das Eileiterepithel zu sammeln, schneiden Sie das Röhrchen der Länge nach ab und legen Sie es über drei bis fünf Tage auf Gewebekulturplastik.

Die Zellen kriechen aus dem Stroma der Eileiter und wachsen auf dem Kunststoff der Gewebekultur. Entnehmen Sie die Alginat-verkapselte Kügelchen aus dem Nährmedium zum ausgewählten Zeitpunkt. Verbinden Sie das Alginat, um das Gel zu versteifen, indem Sie die Kultur zwei Minuten lang in sterile 10 millimolare Calciumchloridlösung geben.

Fixieren Sie nun das mit Alginat verkapselte Organ und stellen Sie sicher, dass das Gel während der Fixierung fest bleibt und das Gewebe vollständig einkapselt. Zelltypen wie das OSC, die auf Kunststoffoberflächen nicht gut wachsen, können kultiviert werden. Mit dieser Methode können Sie die Untersuchung der normalen zellulären Prozesse oder der frühesten Ereignisse bei der Krebsentstehung erleichtern.

Unter dem Mikroskop wurden der Schleimbeutel und das umgebende Fettpolster entfernt und zu alginierten verkapselten Organoiden verarbeitet, die inkubiert wurden. Im Nährmedium. Das OSC reparierte die Oberfläche, die durch den Schnitt verletzt wurde, mit dem Skalpell in Abhängigkeit von Zeit und Entfernung.

Die immunhistochemische Analyse mit einem Cytokeratin-Acht-Antikörper zeigt, dass halbierte Eierstöcke den Eierstock vollständiger einkapseln als Eierstöcke, die in Viertel oder Achtel geschnitten sind. Die Gewebearchitektur, die zelluläre Morphologie und die spezifischen zellulären Wachstumsraten lassen sich mit Hilfe von Paraffinschnitten leicht überwachen. Zum Beispiel wird eine einzelne Schicht des Oberflächenepithels der Eierstöcke nach der Kultivierung in serumfreiem MEM für sieben Tage beobachtet.

Während die Zugabe von fünf Mikrogramm pro Milliliter Insulin für sieben Tage eine Hyperproliferation des Oberflächenepithels der Eierstöcke und die Bildung mehrerer Zellschichten induziert. Hier wird die Immunfluoreszenz des grün fluoreszierenden Proteins durch das Alginat-Gel mit einer Standardmikroskopie nach CDNA-Transfektion sichtbar gemacht. Während die Alginat-Organkultur das Wachstum und die Analyse des Oberflächenepithels der Eierstöcke und der Primärfollikel ermöglicht, sollte beachtet werden, dass die reifen Sekundärfollikel in diesem Kultursystem nicht überleben.

Veränderungen in Proteinen oder RNA können aus dem gesamten Organ oder aus bestimmten Zelltypen mittels enzymatischem Abbau analysiert werden. Die Behandlung von kultivierten Ovarialorganoiden mit Kollagenase lässt das darunterliegende Stroma intakt und ermöglicht gleichzeitig eine Anreicherung des Oberflächenepithels der Eierstöcke in dem nach der Behandlung erhaltenen Zellpellet. Diese Technik kann bei richtiger Ausführung in ein bis zwei Stunden durchgeführt werden.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Sterilität jederzeit aufrechtzuerhalten. Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche Methoden wie Immunhistochemie, Western Blot und Transkriptionsarrays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie Zellmorphologie und Gewebearchitektur zu frühen transformativen Ereignissen beitragen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine dreidimensionale Alginatkultur an Eierstöcken und Eileitern durchführt.