Nachweis von Stickstoffmonoxid und Superoxid-Radikalanion von paramagnetischer Resonanzspektroskopie von Zellen mit Spinfallen

Ich bin Frederick Dina und ich bin außerordentlicher Professor für Pharmakologie hier an der Ohio State University. In dieser Demonstration zeigen wir den Nachweis von Stickstoffmonoxid und Superoxid aus Zellen mittels EPR. Spin-Trapping.

Reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies wurden mit der Entstehung verschiedener Krankheiten in Verbindung gebracht, weshalb ihr Nachweis in biologischen Systemen von größter Bedeutung ist. In biologischen Systemen wurden bisher nur wenige zuverlässige Methoden zum Nachweis reaktiver Spezies eingesetzt, die jedoch durch Spezifität und Sensitivität begrenzt sind. Spin-Dropping wird jedoch häufig zur Identifizierung von Eros verwendet und beinhaltet die Additionsreaktion von Radikalen an eine Nitro-Spin-Falle oder Metallkomplexe, die eine persistente Spin-Add-Operation bilden, die durch Elektronen-Paramagnetische Resonanzspektroskopie oder EPR nachgewiesen werden kann. Die verschiedenen Radikal-Add-Kanäle weisen das charakteristische Spektrum auf, das zur Identifizierung der erzeugten Radikale verwendet werden kann und eine Fülle von Informationen über die Natur und Kinetik von Radikalen liefern kann Produktion.

Stickstoffmonoxid Syntase katalysiert die Umwandlung von L-Arginin in L-Citrulin unter Verwendung von N-A-D-P-H zur Herstellung von Stickstoffmonoxid. Unter oxidativen Stressbedingungen kann ENA von der Produktion von Stickstoffmonoxid auf Superoxid umsteigen, und zwar in einem Prozess, der als Entkopplung bezeichnet wird und von dem angenommen wird, dass er durch die Oxidation von Häm oder dem Hustenfaktor verursacht wird, dass die Hydroterin-Stickstoffmonoxid-Regulation im biologischen System wichtig ist, da sie eine entscheidende Rolle bei der Zellsignalisierung spielt, was zu vorteilhaften physiologischen Funktionen wie Vasodilatation führt. Aber seine Überproduktion wird oft mit entzündlichen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Daher ist der Nachweis von Stickstoffmonoxid im biologischen System wichtig.

Eine weitere wichtige Klasse von Signalmolekülen in biologischen Systemen sind reaktive Sauerstoffspezies wie Stickstoffmonoxid, reaktive Sauerstoffspezies spielen in niedrigen Konzentrationen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Zellfunktion, der Signalübertragung und der Immunantwort, können aber in unregulierten Konzentrationen zu zellulären oxidativen Schäden führen, die zu oxidativem Stress führen. Das S-Peroxid-Radikal-Anion ist eine der wichtigsten reaktiven Sauerstoffspezies und der Hauptvorläufer einiger der am stärksten oxidierenden Spezies, von denen bekannt ist, dass sie in biologischen Systemen vorkommen, wie z. B. S-Peroxid, Nitrit und Hydroxystäbchen. Der Nachweis und/oder die Sequestrierung von S-Peroxid im biologischen System ist daher wichtig, da seine Erzeugung das erste Anzeichen eines oxidierten Bursts vor dem Start signalisiert.

Mit diesem Protokoll werden Trypsin-Endothelzellen von Rindern, wie im schriftlichen Verfahren beschrieben, kultiviert. Übertragen Sie die Zellen auf eine markierte Sechs. Nach der Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 über Nacht gut ausfüllen.

Nehmen Sie die Sechs-Well-Platte aus dem Inkubator und saugen Sie das Medium aus dem ersten an. Nun, waschen Sie die Zellen zweimal mit einem Milliliter Delcos, Phosphatpuffer, Kochsalzlösung oder DPBS. Bereiten Sie eine 1,9 Millimolare Eisensulfat-Hep-Dehydratlösung vor, indem Sie 0,8 Milligramm Eisensulfat zu einem Milliliter DPBS mit Calciumchlorid und Magnesiumchlorid hinzufügen.

Und bereiten Sie die MGD-Lösung vor, indem Sie 2,7 Milligramm Ammonium MGD zu 500 Mikrolitern DPBS mit Calciumchlorid und Magnesiumchlorid hinzufügen. Fügen Sie 210 Mikroliter frisch zubereitetes 1,9 Millimolar Eisensulfat Hep Dehydrat und 210 Mikroliter frisch zubereitetes MGD mit einem Molaritätsverhältnis von eins zu sieben hinzu und mischen Sie die resultierende Suspension. Fügen Sie 4,6 Mikroliter Calciumion vier hinzu und mischen Sie die Lösung erneut, indem Sie auf und ab pipettieren.

Dann inkubieren Sie die Probe 36 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Sammle das Supernat, das sich in einer Einorröhre absetzt. Geben Sie die EPR-Erfassungsparameter ein: Mittelfeld von 34 27 Goss-Modulation, Amplitude von sechs Goss und Frequenz von 9,8 Gigahertz.

Da die Parameter von Gerät zu Gerät und von Versuchsbedingungen zu Gerät variieren können, lesen Sie bitte den Text für andere Parameter, die in diesem Gerät verwendet werden. Übertragen Sie das Super-Natin mit Paraffin auf eine EPR-Flachzelldichtung und legen Sie es in den EPR-Hohlraum. Nehmen Sie die Spektren ca. 21 Minuten lang bei 121 Scans und 10,4 Sekunden pro Scan nach dem Experiment auf.

Verwenden Sie die brucker WIN EPR-Verarbeitung, um die Grundlinie zu korrigieren und die 2D-Spektren zu integrieren, wodurch das Hintergrundrauschen reduziert wird. Es ist zu beachten, dass die Scanzeit und die Anzahl der Scans von Experiment zu Experiment variieren können. Auch die Methoden zur Korrektur der Baseline können von Software zu Software variieren.

Um mit der Entkopplung von Enos zu beginnen, entfernen Sie das Medium aus der zweiten Vertiefung der sechs. Die Zellen gut plattieren und zweimal mit einem Milliliter DPBS waschen. Fügen Sie dann 100 Mikroliter der vorbereiteten 0,5 Millimolar Syn one Lösung hinzu und erhöhen Sie das Volumen auf zwei Milliliter mit DPBS, das 10 % FBS enthält. Inkubieren Sie die Zellen nach der Inkubation zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.

Waschen Sie die Zellen zweimal mit DPBS. Fügen Sie dann 210 Mikroliter frisch zubereitetes, 2,8 millimolares Eisensulfat-Heta-Hydrat und 210 Mikroliter 19,6 millimolare MGD hinzu, die nach dem vorherigen Verfahren frisch zubereitet wurden. Fügen Sie als nächstes 4,6 Mikroliter 1,9 millimolare Calciumion vier hinzu und mischen Sie die Lösung erneut.

Inkubieren Sie die Zellen wie zuvor bei 37 Grad Celsius für 36 Minuten. Nach 36 Minuten wird das Super-Natin, das sich in einem Einor-Röhrchen absetzt, aufgefangen und in eine EPR-Flachzelle überführt. Nehmen Sie die EPR-Spektren mit den gleichen Erfassungsparametern auf wie vor der Erfassung.

Verarbeiten Sie die Daten auf die gleiche Weise vor dem Start dieses Protokolls. Bereiten Sie eine Stammlösung aus einem molaren DMPO und PBS vor, die 0,1 millimolare DTPA enthält. Stellen Sie dann eine Lösung von einem Milligramm pro Milliliter von vier mal 12 her.

Myra State 13-Acetat oder PMA in DMSO aliquote von einem Milliliter der PMA-Stammlösung, indem es in einem Einor-Röhrchen, das ein Milligramm pro Milliliter D-Glucose und ein Milligramm pro Milliliter enthält, auf 10 Mikrogramm pro Milliliter PBS verdünnt wird. Albumin stellt fünf bis 6 Millionen PMN-Zellen pro Milliliter her, indem es in einem 1,5-Milliliter-Einor-Röhrchen auf und ab pipettiert. Bereiten Sie eine Mischung mit einem Endvolumen von 60 Mikrolitern vor, die etwa 1,6 mal 10 to die sechs Zellen PMN, 10 Millimolar DMPO und 0,2 Mikrogramm pro Milliliter PMA enthält.

In diesem Experiment werden wir ein Bruker ESP 300 X Band-Spektrometer verwenden. Übertragen Sie die Lösung in eine EPR-Flachzelle und platzieren Sie die flache Zelle dann in den EPR-Hohlraum. Geben Sie die EPR-Erfassungsparameter ein: Mittelfeld von 3, 486 Goss, Modulationsamplitude von 0,5 Goss und Frequenz von 9,8 Gigahertz.

Da die Parameter von Instrument zu Gerät und die experimentellen Bedingungen von Instrument zu Gerät variieren, lesen Sie bitte den Text für die anderen Parameter, die in diesem Experiment verwendet werden. In dieser Demonstration zeigen wir die Detektion von Stickstoffmonoxid- und SU-Peroxid-Radikalen mit Hilfe von zwei verschiedenen Spin-Fallen. Das Eisen MGD und DNPO.

Wir zeigen, dass die Stimulation von Endothelzellen mit Calciumion vier Stickstoffmonoxid erzeugt und die Behandlung mit gesehenem Ion. Ein periner Nitritdonor kann die Stickoxidproduktion verringern, eine Stimulation von Neutrophilen mit PMA in Gegenwart einer Nitro-Spin-Falle ergibt jedoch aufgrund der Instabilität des initial gebildeten Superoxid-Adda ein Hydroxylradikal ADDA anstelle des S-Oxids. Während die Mechanismen des Spin-Fangs durch Eisen-MGD-Nitros im Grunde die gleichen sind, beinhaltet die Stickstoffmonoxid-Zugabe zu Eisen-MGD eine Durchlaufgeschwindigkeit der Reaktion und dass die Eisen-MGD-Stickstoffmonoxid-Zusatzform sehr stabil ist.

Dass man die Lösung tatsächlich bei minus 80 Grad Celsius einfrieren kann, um später das EPR-Spektrum zu erfassen, ohne dass die EPR-Signalintensität signifikant abnimmt. Auf der anderen Seite ist die Detektion von Oxid mit der Nitro-Spin-Falle langsam. Dies erfordert höhere Konzentrationen der Spin-Falle im Vergleich zum Gegenstück Eisen-MGD-4-Stickoxid-Nachweis.

Um die Superoxid-Adduktform erfolgreich zu detektieren, wurden mehrere Ansätze verwendet, die wir in diesem Video nicht mehr demonstriert haben. Die Verwendung von flachen Zellen kann beispielsweise aufgrund der höheren Zelldichte zu einer besseren Signalintensität für Su-Peroxid führen. Ich fordere Sie auf, sich auf den Text zu diesem Thema zu beziehen.

Anstelle von DMPO kann man auch eine zertifizierte Spin-Falle wie BMPO und VMP oder das phosphorylierte Nitro DAP MPO verwenden, das ein persistenteres SU-Peroxid-Addax liefern kann. Die Verwendung von Cyclodextrin wurde auch zur Stabilisierung von SU-Peroxid und Add Adapt eingesetzt, wenn Spin-Trapping für die US-Detektion eingesetzt wird. Die sofortige Erfassung des EP-Spektrums nach der SU-Superoxid-Erzeugung wird dringend empfohlen.

Daher ist der Nachweis von Stickstoffmonoxid mit Eisen-MGD viel effizienter und die größte Herausforderung bei einem PR-Spin-Trapping von Superoxid besteht nun darin, die Eigenschaften zu erreichen, die für die Bildung von Eisen-MGD-Stickstoffmonoxid-Addoch beobachtet wurden. Das heißt, schnelle, superoxidische Reaktivität und stabile zusätzliche Anstrengungen bei der Entwicklung von Spinfallen mit schneller Reaktivität auf Superoxid und Bildung eines stabilen Spins. Die ADS wird jetzt in unserem Labor und auch von anderen Gruppen durchgeführt.