Lentivirale-vermittelte Knockdown Während Ex Vivo Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, humane hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen entlang der erythroiden Linie zu differenzieren und einen bestimmten Transkriptionsfaktor während der ex vivo Erythropoese auszuschalten. Dies wird erreicht, indem zunächst CD 34-positive humane Stamm- und Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut, Knochenmark oder peripherem Blut isoliert werden, das mit GCSF mobilisiert wurde. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, diese hämatopoetischen Stammzellen entlang der erythroiden Linie unter Verwendung eines vierstufigen Zellkulturverfahrens zu differenzieren, das spezifische Zytokine und Co-Kultur auf einer Stromazellschicht kombiniert, um die Mikroumgebung des Knochenmarks nachzuahmen.

Als nächstes bereiten Sie lentivirale Vektorpartikel vor, die ein HRNA-Molekül gegen den interessierenden Transkriptionsfaktor exprimieren, ein verschlüsseltes HRA-Molekül als Negativkontrolle und das GFP-Protein zur Kontrolle der Effizienz der Virusinfektion. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die primären menschlichen erythroiden Zellen in einem bestimmten Differenzierungsstadium mit lentiviralen Partikeln zu infizieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Zellproliferation und Erythroiddifferenzierung durch die Analyse der Zellmorphologie, der Koloniebildungsfähigkeit von Vorläuferzellen, der Produktion von Hämoglobin und der Expression erythroidspezifischer Marker durch Fakten zeigen.

Die Effizienz der Virusinfektion wird durch Messung der GFP-Expression anhand von Fakten analysiert und der Knockdown des interessierenden Transkriptionsfaktors wird durch R-T-Q-P-C-R analysiert. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Hämatopoese zu beantworten, wie z. B. den molekularen Mechanismus der einzelnen Transkriptionsfaktoren, der die Genexpression in einer nicht transformierten Umgebung reguliert, die von primären menschlichen Zellen bereitgestellt wird. Dies ist wichtig für das Verständnis grundlegender Prozesse der Hämatopoese wie der Sulfatbestimmung, der Selbsterneuerungsproliferation oder der Apoptose.

Obwohl diese Methode einen Einblick in normale ROIs und deren Regulation auf molekularer Ebene geben kann, kann sie auch als Modellsystem verwendet werden, um zielgerichtete Therapien für Krankheiten zu untersuchen, die aus Ungleichgewicht, Einwachsen und Differenzierung entstehen, einschließlich myeloproliferativer Erkrankungen wie Polycythaemia Vera Andro Leukämie. Das Protokoll für die ex vivo-Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen zu reifem Hämoglobin, das rote Blutkörperchen enthält, besteht aus zwei Schritten: der Isolierung von CD 34-positiven hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen und der serumfreien erythroiden Differenzierung in Zellkultur. In Schritt eins werden CD 34-positive Zellen aus Nabelschnurblut, Knochenmark oder humanem peripherem Blut isoliert, das mit GCSF mobilisiert wurde, und zwar unter Verwendung einer positiven Immunselektion.

Der zweite Schritt, die serumfreie erythroide Differenzierung, beinhaltet die Züchtung von CD 34-positiven Zellen in Flüssigkulturen. Nach einem vierstufigen Protokoll, das von der ursprünglich vom DU-Labor entwickelten Methode angepasst ist, werden hämatopoetische Zellen von Tag Null bis Tag 11 in supplementierten Eismanschetten, modifizierten ECCOs, einem Medium mit Hydrocortison-Stammzellfaktor Interleukin drei und Erythropoietin gezüchtet. Von Tag 11 bis Tag 15 werden dann erythroide Zellen an MS mit fünf mesenchymalen Zellen in einem supplementierten IMDM-Medium, das EPO enthält, in Schritt drei co-kultiviert.

Nach der Ernte von erythroiden Sommerzellen für die zukünftige Verwendung werden die verbleibenden Zellen auf MS fünf Zellen in supplementiertem IMD und Medium ohne Zytokine co-kultiviert. Schließlich werden die erythroiden Zellen von Tag 18 bis Tag 26 drei- bis vierfach konzentriert und auf einer fünften MS-Schicht gehalten, um die Reifung zu ermöglichen, und 10 % FBS werden in einem ergänzten IMDM-Medium zugesetzt, um die kultivierten roten Blutkörperchen besser zu erhalten. Für die Zwecke dieses Videoartikels werden wir nur den zweiten Schritt der erythroiden Differenzierung demonstrieren, die Co-Kultur von erythroiden Zellen auf mesenchymalen Zellen mit Erythropoietin.

Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, diese Schritte in großem Maßstab durchzuführen, das Medium des Kolbens, der AUS enthält, fünf Zellen für die Co-Kultur zu waschen und auszutauschen und anschließend Kunsthandelszellen in diesen Kolben zu überführen. Daher verarbeiten wir für den Kolben auf einmal und haben 2% Organ gleichzeitig. Um die Co-Kultur von erythroiden Zellen auf mesenchymalen Zellen mit EPO zu beginnen, zählen Sie die erythroiden Zellen mit Trianblau, um tote Zellen auszuschließen.

Am Tag 11 sollte die Zelldichte etwa 1,5 mal 10 der sechs Zellen pro Milliliter Reserve von etwa 80 Millilitern der erythroiden Zellkultur für die Co-Kultur auf MS fünf mesenchymale Zellen betragen. Das Vorwärmen von PBS ergänzte das IMDM-Medium und das IMDM-Medium, das EPO enthielt, bei 37 Grad Celsius. Als nächstes werden vier der zuvor vorbereiteten Kolben mit konfluenten MS-Zellen aus dem Inkubator entnommen.

Jeder Kolben wird mit 20 Millilitern eines XPBS gewaschen und sofort 80 Milliliter frisches, zugesetztes IM DM Medium, das EPO enthält, in jeden Kolben gegeben. Bewahren Sie die Zellen im Inkubator auf, während die erythroiden Zellen vorbereitet werden. Nun werden die reservierten erythroiden Zellen in zwei konische 50-Milliliter-Röhrchen umgefüllt und bei 1500 UVP M für 10 Minuten zentrifugiert.

Nach dem Verwerfen des Überstands waschen Sie jedes der beiden Zellpellets mit 20 Millilitern supplementiertem IMDM-Medium, suspendieren Sie jedes Zellpellet in 40 Millilitern supplementiertem IMDM-Medium, das EP enthält. Dann verteilen Sie 20 Milliliter dieser Zellsuspension auf jeden der vier Kolben, die MS, fünf Zellen und 80 Milliliter Medium enthalten. Zu diesem Zeitpunkt sollten Sie vier Kolben mit konfluenten MS fünf Zellen mit 100 Millilitern erythroiden Zellen bei 0,3 mal 10 haben, um die sechs Zellen pro Milliliter am folgenden Tag erythroiden Zellen mit Trianblau entgegenzusetzen, um tote Zellen auszuschließen. Die Zelldichte sollte etwa 0,6 mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter betragen.

Ernten Sie die erforderliche Anzahl von Zellen für Tests, um die ordnungsgemäße Zellproliferation und die erythroide Differenzierung zu überprüfen. Die Untersuchung der Erythropoese auf transkriptioneller Ebene erfordert auch die Fähigkeit, spezifische Faktoren in primären erythroiden Zellen zu überexprimieren oder auszuschalten. In diesem Beispiel wird ein Lentivirus-vermitteltes Genverabschiedungssystem verwendet, um den Transkriptionsfaktor in primären menschlichen erythroiden Zellen auf einen Faktor herunterzuschalten.

Das Protokoll zur Herstellung lentiviraler Vektorpartikel ist im Manuskript verfügbar. Dieses Video zeigt das Verfahren zur lentiviralen Infektion von primären erythroiden Zellen für den Gentransfer. Kernhaltige erythroide Zellen können in jedem Stadium der Differenzierung mit einer Infektionsvielfalt von 50 bis 100 effizient infiziert werden.

Hier wird Lentivirus, das ein T one oder Scramble S-H-R-N-A exprimiert, verwendet, um erythroide Zellen an den Tagen acht und neun der Differenzierung mit einem MOI von 52 Anwendungen pro Zelle zu infizieren. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie drei konische 15-Milliliter-Röhrchen vor, die ein mal 10tel der sechsten erythroiden Zellen enthalten, jeweils ein Röhrchen für TAL, einen Knockdown, ein Röhrchen für die Negativkontrolle und ein Röhrchen für die GFP-Expression. Kontrollieren Sie die Waschzellen mit fünf Millilitern supplementiertem IMDM-Medium, das EPO enthält, fünf Minuten lang bei 1000 U/min und entfernen Sie so viel Überstand wie möglich.

Die Infektion sollte in minimalen Mengen an Medien durchgeführt werden, um eine maximale Resorption des Lentivirus in den Zellen zu ermöglichen. Geben Sie Polyhirn in einer Endkonzentration von 40 Mikrogramm pro Milliliter in jedes Röhrchen mit konzentrierten Lentiviren. Geben Sie 100 Mikroliter eines vorbereiteten konzentrierten Virus, das Polyhirn enthält, zu jedem Zellröhrchen.

Inkubieren Sie eine Stunde lang im Inkubator bei 37 Grad Celsius, gemischt durch Fingerklopfen alle 10 Minuten. Dies ermöglicht die gleichmäßige Verteilung des Virus über die Zellen nach Abschluss der einstündigen Inkubation mit 1,9 Millilitern supplementiertem IMDM-Medium, das EPO enthält, auf jedes Röhrchen. Übertragen Sie jede Probe auf eine Sechs-Well-Platte und stellen Sie sie für 24 Stunden in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator.

Ernten Sie die Zellen nach 24 Stunden in separaten 15-Milliliter-Röhrchen. Drehen Sie sie fünf Minuten lang bei 1000 UVP M und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die Infektion, fügen Sie Virus und Polyhirn hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit Fingertippen.

Geben Sie dann ergänzendes IMDM-Medium, das EPO enthält, zu den Zellen. Jede Probe wird auf eine Sechs-Well-Platte umgefüllt und 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Am nächsten Tag werden die Zellen in drei konische 15-Milliliter-Röhrchen überführt und durch Zentrifugation, Entfernung des Überstands und Wiederbelebungssuspension der Zellen und Frischmediumzentrifugation gewaschen.

Auch hier wird der Überstand aspiriert und die Zellen in einer Konzentration von 0,2 mal 10 der sechs Zellen pro Milliliter in supplementiertes IMDM, das EPO enthält, resuspendiert. Danach fahren Sie mit dem Verfahren fort, bei dem ex vivo erythroide Differenzierungszellen jeden zweiten Tag während des ex vivo erythroiden Differenzierungsprotokolls gezählt werden. Ein repräsentatives Ergebnis auf logarithmischer Skala zeigt, dass Zellen stark proliferativ sind, wie die 10.000-fache Amplifikation zeigt.

Darüber hinaus kann Grunwald Edelstein, so dass die Morphologiefärbung jeden zweiten Tag mit 0,05 mal 10 der sechs Zellen für den Tag null bis acht und 0,2 mal 10 der sechs Zellen für die anderen Tage durchgeführt wird. Wie in dieser Abbildung dargestellt, weisen Zellen in bestimmten Stadien der Differenzierung erkennbare Größen und Morphologien auf. Beachten Sie den Prozess der Enukleation, der am Ende der Differenzierung ab Tag 20 stattfindet.

Am Tag 26 haben alle Zellen ihre Zellkerne verloren. Koloniebildende Assays werden verwendet, um frühe und späte hämatopoetische Vorläuferzellen in den ersten Tagen der Differenzierung zu detektieren, und die Ergebnisse werden hier am Tag Null gezeigt. Zusätzlich zu den erythroiden Vorläuferzellen sind Granulozyten und Makrophagen-Vorläuferzellen in den frühen CD 34-positiven Zellen signifikant vertreten.

Im Laufe der Differenzierung nahmen einige GM signifikant ab, und am sechsten Tag wurden sie vollständig durch erythroide Vorläufer, BAUE und CAUE, ersetzt. Es ist auch wichtig zu beachten, dass vom vierten bis zum sechsten Tag die frühen erythroiden Vorläufer, BAUE, nach und nach durch ihre differenzierteren Gegenstücke, CAUE, ersetzt werden. Am 10. Tag haben die erythroiden Zellen im Wesentlichen ihre Fähigkeit zur Koloniebildung verloren.

Hier sind typische Bilder von BFUE und CFUE zu sehen. Die rotbraune Farbe ist auf das Hämoglobin von BFUE und CFUE zurückzuführen. Die Erythropoese wird während der exvivo-Differenzierung überwacht, indem Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten entnommen und durch Fakten oder durch Mikroskopie auf Expression von Zelloberflächenmarkern analysiert werden.

Hier stellen die Balken den Prozentsatz der positiven Zellen dar. Zu den signifikanten Beobachtungen gehören der fortschreitende Verlust des hämatopoetischen Stammvorläufermarkers CD 34, der fortschreitende Erwerb und Verlust des Vorläufermarkers CD 36, der fortschreitende Erwerb und Verlust des Erythroid-, Vorläufer- und Retikulozytenmarkers CD 71 sowie der Anstieg des erythroiden Vorläufers und des Erythrozytenmarkers GPA. Weitere Marker für die erythroide Differenzierung sind die Hämoglobinsynthese ab dem achten Tag, gemessen durch Benadin-Färbung, und die Zellenukleation ab dem 20. Tag.

Gemessen am Verlust der DNA-Färbung LDS werden die Ergebnisse des lentiviralen Gentransfers in humanen primären Pro-Erythroblasten nach dem Knockdown des Transkriptionsfaktors gezeigt. T one wurde durch Lentivirus-verabreichtes Anti-T-eins-SHRA oder ein verschlüsseltes Kontroll-SHRA vermittelt, die Messung der Kinetik von T-eins-mRNA-Transkript mittels RT, qPCR R und die Expression von T-1-Transkript relativ zu 18. Srna zeigte, dass 75% der T-on-Transkripte in primären erythroiden Zellen erfolgreich abgeschaltet wurden.

Der Anstieg des T-1-Transkriptspiegels vom neunten bis zum 12. Tag und die verschlüsselte Kontrolle unterstreichen die Bedeutung dieses Transkriptionsfaktors während der erythroiden Differenzierung. In einem weiteren Experiment wurden schließlich erythroide Zellen mit Lentiviren infiziert, die das GFP-Protein exprimieren. Diese Abbildung zeigt, dass drei Tage nach der Infektion die meisten erythroiden Zellen GFP exprimieren, gemessen durch Fluoreszenz unter dem Mikroskop und anhand von Fakten.

Dies deutet auf eine Wirksamkeit der Infektion in primären erythroiden Zellen von nahezu 100% nach ihrer Entwicklung hin. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Hämatopoese die Möglichkeit, die Transkriptionsregulation in der menschlichen Erythropoese zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen in Kultur in Zyten unterscheidet und wie man die lentivirale vermittelte Genabgabe einsetzt, um in jeder Phase dieses Differenzierungsprozesses einen effizienten Gen-Knockout zu induzieren.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.