Name: Chirurgische Transplantation von Maus Neural Stem Cells in den Rückenmark von Mäusen mit neurotropen Maus Hepatitis Virus infiziert (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-10T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Erfahren Sie die chirurgische Transplantation neuronaler Stammzellen in das Rückenmark von JHMV-infizierten Mäusen zur Förderung der Remyelinisierung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zellersatztherapien bei demyelinisierenden Erkrankungen.

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1. Vorbereitung <ol><li> Bereiten Xylazin-Ketamin-Lösung (Ketamin ist eine kontrollierte Substanz. Detaillierte Aufzeichnungen aufzubewahren und Lösungen in einem sicheren, verriegelten Position gespeichert). </li><li> Reinigen und zu sterilisieren Ausrüstung. </li><li> Bereiten OP-Bereich durch Abwischen mit aseptischen Agent und dann Abdecken mit sterilen Papiertuch, und richten Sie den Mikromanipulator. </li></ol> 2. Vorbereitung der Zellen für die Transplantation <ol><li> Cells zu einer Konzentration von 100.000 Zellen / É l sollte resuspendiert werden, und obwohl nur 250.000 Zellen pro Maus transplantiert werden, ist ein Überschuss von Zellen für die Spritze loading Zwecke (Vorbereitung mindestens 300.000 Zellen pro Maus empfängt Zellen) benötigt. </li><li> Wash Zellen transplantiert 3 mal in HBSS in einem 50 ml konischen Röhrchen. Zählen Sie die Zellen vor der endgültigen Spin. </li><li> Nach der letzten Spin-Down, dekantieren HBSS und lassen Fläschchen in umgekehrter Lage zu Tröpfchen vom Erreichen der Pellets zu verhindern. </li><li> Dry Innenwände mit einer UV-Bestrahlung, sterile Kimwipe. Lassen Sie die Pellets zu trocknen. </li><li> Halten Sie die Tube aufrecht, langsam und sehr zart die Zellen in die Hälfte der letzten gewünschte Volumen HBSS. </li><li> Messen Sie das Gesamtvolumen durch Pipettieren der Mehrheit der Suspension in einer Pipettenspitze und dann die Anpassung der Regler an der Pipette, bis die gesamte Suspension wird in der Pipettenspitze. Dies wird Ihnen sagen, wie viel mehr HBSS ist für die gewünschte Konzentration benötigt. </li><li> Bringen Sie Lautstärke auf den gewünschten Betrag, indem HBSS. </li><li> Legen Sie wieder auf dem Eis. Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit von Zellen, wenn sie auf dem Eis nicht länger als 2 Stunden sein müssen. </li></ol> 3. Vorbereitung der Mäuse für Chirurgie und Transplantation <ol><li> Anesthetize der Maus durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (100mg/kg) und Xylazin (10mg/kg) in ~ 100 ul Dosen oder eine gleichwertige Betäubung. Der gesamte Vorgang von der chirurgischen Vorbereitung auf Nähen dauert 30-40 Minuten. </li><li> (Optional: apply nummeriert, farbiges Klebeband um den Schwanz jeder Maus, um die Identifizierung zu gewährleisten) </li><li> Shave Bereich der Brustwirbelsäule der Maus aus dem unteren Rücken an den Hals, und sich 2 cm bilaterale von der Mittellinie, mit elektrischen Haarschneider. Das Haar sollte so nah wie möglich geschnitten werden (es kann notwendig sein, über den Bereich gehen mehrmals). </li><li> So entfernen Sie das restliche Haar, eine dünne Schicht von Enthaarungscreme (Nair) mit einem Gaze-Applikator. </li><li> Nach 1-2 Minuten, wischen Nair off mit Gaze leicht mit Seifenwasser benetzt. Die vorbereitete Fläche sollte sauber nackte Haut ohne jede streunende Stück Haar, das in die Wunde während der anschließenden Operation konnte. Sterilisieren Sie die vorbereitete Fläche mit Jodid-Lösung. </li></ol> 4. Laminektomie <ol><li> Häufig verändern und / oder sterilisieren Handschuhe während des gesamten Verfahrens. Bewegen Sie die Maus Rückenseite mit Kopf nach links (wenn Sie Rechtshänder sind). Drape Tier, um die Sterilität zu gewährleisten und dass nur die rasierte Fläche ausgesetzt ist. Machen Sie einen vertikalen Schnitt (~ 1.3cm) über die laminecomy site es mit rund Brustwirbel T8 bis T12. </li><li> Mit dem Graefe Zange in der linken Hand gehalten, fest Sicherung der Wirbelsäule bei T9 (Abbildung 1A) und heben Sie die Maus bis zur Krümmung der Wirbelsäule zu übertreiben. </li><li> Verwenden Sie das Skalpell an der Kreuzung zwischen T10 und T11, der Raum zwischen den beiden stacheligen Erhebungen des Gastes. Weitere Setzen Sie die Kreuzung durch eine sorgfältige Verschrottung der Muskelschicht weg bis auf die Knochen freizulegen (siehe Abbildung 1B, C). </li><li> Verwenden Sie die Schere, um klare Muskel vom Lamina und um den Stiel mit kleinen Scheren weiter. Dies eröffnet eine kleine Lücke zwischen den Wirbeln. Langsam und vorsichtig fügen Sie ein Blatt der Schere in diese Lücke und snip den Stiel. Achten Sie darauf, die Krümmung der Schere immer ist seitlich positioniert, weg von der Steckdose. Wiederholen Sie dies auf der anderen Seite. (Siehe Abbildung 1D, E) </li><li> Heben Sie die Lamina, um die Schnur zu entlarven und sorgfältig snip es ab. Achten Sie darauf, keine freie oder gezackte Knochenfragmente hinter sich zu lassen. (Siehe Abbildung 1F) </li><li> Vor der Injektion, sauber kein Blut entfernt mit einem sterilen Wattestäbchen. </li></ol> 5. Die Injektion von Zellen <ol><li> Befestigen Sie die Nadel mit Nadel Mutter, die Hamilton-Spritze und reinigen Sie diese durch Spülen mehrmals mit Wasser, dann 70% Ethanol und schließlich HBSS. Legen Sie nach jedem Kolben mit Wasser füllen, 70% Ethanol oder HBSS. </li><li> Bereiten Sie die Hamilton-Spritze für die Zell-Laden, indem Sie den Kolben und Lösen der Nadel Mutter und zieht die Nadel von der Spritze, um den Gegendruck zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass Ihnen der sorgfältige Umgang mit der Nadel und Mutter mit sterilen Handschuhen erfolgen. </li><li> Legen Sie 15μl der Zellen in Pipettenspitze und drücken Sie die Spitze fest in das hintere Ende der Spritze, um die Zellen in die Spritze zu laden. </li><li> Legen Sie den Kolben etwa 5 mm und ziehen Sie dann die Nadel Mutter. </li><li> Drücken Kolben until einige der Zellsuspension sieht ihn aus der Nadel. </li><li> Stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblasen in der Spritze und legen Sie die Spritze in die horizontale Position, um die Zellen aus, einen Gradienten durch die Schwerkraft zu verhindern. </li><li> Schnappen Sie der laminectomized Maus durch die spinalis dorsi verbindet die Stacheln von T8 und T9 (Abbildung 2B, C). </li><li> Klemmen Sie die hemostat nach links (vertikal) Mikromanipulator Arm, so dass die Maus Vorderpfoten in der Luft und an seinem hinteren Pfoten leicht berühren eine Plattform von sterilen Papiertüchern wie in den 2A und 2B. </li><li> Bringen Sie die Spritze mit dem rechten Arm Mikromanipulator (bei einer 70 °-Winkel) und schieben Sie die Spritze in die niedrigste Position möglich vor dem Spannen. </li><li> Stabilisieren Sie die Maus durch Pinning seinen Schwanz gegen die Papierhandtücher und langsam wieder in die Spritze (Abb. 2B). </li><li> Senken Sie die Nadel gegen die Schnur und die Nadel 1mm in der gegenüberliegenden Hemisphäre durch die dorsalen Mittellinie (Abbildung 2C). Die Spitze der Nadel in der grauen Substanz in der Nähe des zentralen Kanals werden. </li><li> Langsam injizieren 2.5μl von Zellen. Inject bei einer Rate von 1μl / 5 Sekunden. Nach der Injektion der Zellen, warten Sie 10 Sekunden und Einfahren der Nadel ein Zehntel wiederum zu einer Zeit, alle 10 Sekunden, bis die Nadel heraus ist der Schnur. Achten Sie auf mögliche Abfluss von Zellsuspension. </li><li> Schnell widerrufen die Spritze und entfernen Sie es aus dem Mikromanipulator Arm. Legen Sie die Spritze horizontal. </li><li> Lassen Sie die Maustaste und Transfer zum Nähen Tisch. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,7-5,14 für jede Maus, bis die Spritze geleert ist. Sterilisieren Instrumente (in den Sterilisator) und die Nadel (durch Abwischen mit Ethanol) zwischen den Tieren. Discard-Zellen und laden, wenn Verklumpung sichtbar ist. </li><li> Reinigen Sie die Spritze, wie in Schritt 5.1 zwischen den Lasten. </li></ol> 6. Nahtmaterial und post-op Pflege <ol><li> Suture den Einschnitt. Suture Nadel in die oberflächliche Faszie auf beiden Seiten des Einschnitts eingefügt. Der Faden wird durch aufgereiht, ziehen Oberflächenfaszie zusammen (Abbildung 3A) und deckt damit die freiliegende Rückenmark an der Stelle entfernt Lamina. Nicht Naht der Hautmuskel an der Haut oder der Skelettmuskulatur des Rückens. Ziehen Sie die gesamte Faden durch, so dass ca. 1 / 2 ". Mit dem Nadelhalter, drei Knoten gebildet und Faden ist so nah an den Knoten wie möglich beschnitten. </li><li> Schließen Sie den Schnitt, indem zwei vor drei Heftklammern (je nach Größe des Einschnitts) auf der Haut (Abbildung 3B). Ziehen Sie die Haut weg von der Maus zu vermeiden Heften die darunter liegende Muskulatur. </li><li> Mit einem 26G3 / 8 Nadel injiziert 0,5 ml Ringer-Laktat-subkutan in den unteren Rücken weg von den Einschnitt. </li><li> Bewegen Sie die Maus zurück in seinen Käfig. Um zu gewährleisten, ist es in der Lage, um bequem atmen, während der Narkose, sollte die Maus auf die Seite in den Käfig gelegt werden, die Vermeidung von Kontakt zwischen der Operationsstelle und Käfig Betten. Käfige sollten auf Heizkissen platziert werden. </li><li> Mäuse überwacht werden nach der Narkose nachlässt, um die Blutung nachlässt gewährleisten, bleiben Nähten verschlossen, und dass Mäuse Rückkehr zur vor der Operation Mobilität. </li><li> Gönnen Mäusen einmal mit der analgetischen Buprenorphin (0,05-0,1 mg / kg) nach der Operation. </li><li> Stellen Sie sicher, beeinträchtigt Mäuse haben einen ausreichenden Zugang zu Nahrung und Wasser: Wasser-Flaschen sind mit verlängerten 3,5-Zoll-Tüllen und Mäuse, die nicht in der Lage sind Hand gefüttert Wasser und / oder hochkalorische Nahrungsergänzungsmittel (Nutri-Cal, Tomlyn) zu Fuß angebracht sind. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Gewünschte Ergebnisse werden durch den Mangel an Efflux der Zellsuspension während der Injektion und durch die intakte Erscheinungsbild des Rückenmarks nach dem Verfahren identifizierbar. Zu diesem Zweck ist es unerlässlich, hell und direkte Beleuchtung der Maus über den Rücken bei der Laminektomie und während der Injektion zu haben. Optimale Beleuchtung wird durch Glasfaser-Beleuchtung (Abbildung 2A) erleichtert. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1 - Laminektomie (A) Nach Wirbel T9 ist fest mit dem Graefe Zange gehalten, (B, C) ​​Ergebnis der Wirbelsäule mit dem Skalpell zwischen T10 und T11 eine Aufnahme der Mikro-Schere zu erleichtern.. (D) Schieben Sie die Mikro-Schere durch den Raum zwischen T10 und T11 (Pfeile und Einschub, E) und schneiden Sie die Stiele auf jeder Seite (Striche, E) an der dorsalen Lamina frei. (F) Flip der Lamina bis rostral und hau sie ab. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Die Injektion von NSCs. (A) Die allgemeinen Aufbau der Mikromanipulator mit dem hemostat mit der Maus an den linken Arm und der Hamilton-Spritze auf dem rechten Arm in einem 70 Winkel. (B) Die hemostat halten spinalis dorsi verbindet die Stacheln von T8 und T9. (C) Die Nadel wird durch t gesenkter Mittellinie und in der grauen Substanz auf der gegenüberliegenden Hemisphäre, proximal an den zentralen Kanal. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Nahtmaterial und Wundverschluss. (A) Die Fäden werden auf die oberflächliche Faszie auf beiden Seiten des Einschnitts angewendet. (B) Der Schnitt wird mit 2-3 Klammern wie nötig (eine Klammer auf eine Wunde braucht 3 dargestellt) geschlossen.

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Eine gut durchgeführte Transplantation wird in erster Linie davon abhängen, die sorgfältige Laminektomie und Injektion der Zellen. Die primäre Gefahr, die während einer Laminektomie zu vermeiden, ist die Beschädigung des Rückenmarks. Dies kann während des Verfahrens selbst oder durch Schäden, die durch scharfe Knochensplitter hinter nach dem Verfahren nach links auftreten kann. Um diese zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die Punkte der gekrümmten Mikro Scheren sind immer abgewandten Schnur und sorgfältig zu prüfen, die laminectomized Wirbelsäule, um sicherzustellen, dass alle Knochenfragmente geräumt sind und dass die restlichen Wirbelkörper Struktur nicht offen hervorstehende oder gezackte Ränder. Wie bereits erwähnt, wird die Erkennung von Efflux möglich sein, wenn das Licht hell und Licht auf die freigelegte Rückenmark während der Injektion. Efflux ist am ehesten mit 30-Gauge-Nadeln (gegenüber 33 Gauge) und wenn die Injektion zu rasch erfolgt passieren. Obwohl dieses Protokoll hat uns gute Ergebnisse, andere haben längere Wartezeiten (bis zu 5 Minuten), bevor das Zurückziehen der Nadel nach der Injektion 8,9 berichtet. Außerdem sind kleinere Gauge-Nadeln vorzuziehen, aber wir haben beobachtet, dass einige Zellen zu leicht werden lysiert, wenn bis 33 Gauge-Nadeln weitergegeben. Um die Effizienz zu maximieren, ist eine Transplantation Team Besatzung der vier verschiedenen Stationen (Maus prep, Laminektomie, Einspritzung und Nähte) wünschenswert. Außerdem sollte der Zeitpunkt für jedes Verfahren optimiert, um die Zeit der Zellen auf Eis warten zu minimieren. Zum Beispiel haben wir unseren Mäusen Transplantation in Gruppen von vier (die Anzahl der Dosen in jedem Laden der Spritze), beginnt die Person die Injektion der Zellen beim Laden der Spritze nach der dritten Maus wurde laminectomized hat und die Person, die die Mäuse sollten die folgenden betäuben Gruppe nach dem zweiten Maus der vorherigen Gruppe wurde laminectomized. Auf diese Weise können wir Zellen (oder Kontrolle media) in 40 Mäuse in ca. 3 Stunden Transplantation, obwohl jeder Maus ca. 30-40 min dauern wird. Zellersatztherapien für die Behandlung einiger Erkrankungen des ZNS befinden sich derzeit in klinischen Studien 10. Es gibt keinen Ersatz für in vivo-Modellen der NSC-Transplantation und unser Protokoll für die Transplantation von NSCs in das Rückenmark von Mäusen, die mit viralen induzierten Demyelinisierung ermöglicht den Einsatz eines wichtigen Modells der MS und kann auch leicht auf andere Modelle angepasst werden.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes / Ausrüstung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Ketaject </td><td> Phoenix Parmaceuticals </td><td> NDC 57319-542-02 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazinhydrochlorid </td><td> MP Biomedicals </td><td> 158307 </td><td></td></tr><tr><td> Nair </td><td> Church &amp; Dwight Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10  ul Hamilton Spritze w / Abnehmbare Nadel </td><td> Hamilton Company </td><td> 7635-01 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton Needles, 30G oder 33 G, ½ Zoll, 30 °-Schliff </td><td> Hamilton Company </td><td> 7803-077803-05 </td><td> Testen Sie die Wirtschaftlichkeit Ihrer Zellen nach Passage durch Nadeln, die beste Spur zu bedienen identifizieren </td></tr><tr><td> Micro Scissors </td><td> World Precision Instruments </td><td> 555500S </td><td></td></tr><tr><td> Kleine Graefe Zange </td><td> FST </td><td> 11053-10 </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaktischen </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modell 1772 Universal Holder </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaktischen </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modell 1773 Elektrodenhalter </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaktischen </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modell 902 kleines Tier stereotaktischen </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaktischen </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modell 960 links Elektrodenträger </td><td></td></tr><tr><td> Nahtmaterial </td><td> Ethicon </td><td> 95057-064 </td><td></td></tr><tr><td> Ringer-Laktat- </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-7953-03 </td><td></td></tr><tr><td> Staples </td><td> Feine Wissenschaft </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Hemostat </td><td> FST </td><td> 13010-12 </td><td></td></tr><tr><td> Skalpelle, Größen 10,11 </td><td> Fischer </td><td> 268878, 268879 </td><td></td></tr><tr><td> Nahtmaterial </td><td> ETHICON </td><td> 1676G </td><td> Größe 5-0, 3 / 8 &quot;Kreis, 19mm Nadel, 45cm geflochtener Faden </td></tr><tr><td> Reflex 7 gewickelt Clip-Applikator </td><td> FST </td><td> 12031-07 </td><td></td></tr><tr><td> 7mm Reflex Wundklammern </td><td> FST </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Olsen-Hegar Nadelhalter </td><td> FST </td><td> 12502-12 </td><td></td></tr></tbody></table>

chirurgische transplantation von maus neural stem cells in den rückenmark von mäusen mit neurotropen maus hepatitis virus infiziert

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Mäuse mit dem neurotropen JHM Stamm Maus Hepatitis Virus (MHV) infiziert sind, entwickeln pathologische und klinische Ergebnisse ähnlich wie bei Patienten mit demyelinisierenden Erkrankung Multiple Sklerose (MS). Wir haben die Transplantation von NSCs in das Rückenmark von kranken Mäusen führt zu einer signifikanten Verbesserung sowohl Remyelinisierung und in klinischen Ergebnisse gezeigt. Zellersatztherapien für die Behandlung von chronischen neurologischen Erkrankungen sind heute Realität, und in-vivo-Modelle sind von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen den transplantierten Zellen und Wirtsgewebe Mikroumgebung. Diese Präsentation stellt eine angepasste Methode zur Transplantation von Zellen in das Rückenmark von JHMV-infizierten Mäusen. In Kürze stellen wir ein Verfahren für die i) Vorbereitung der NSCs vor der Transplantation, ii) pre-operative Betreuung von Mäusen, iii) Exposition des Rückenmarks über Laminektomie, iv) stereotaktische Injektion von NSCs und iv) die postoperative Versorgung .

Die Transplantation von Maus neurale Stammzellen (NSCs) in das Rückenmark von Mäusen mit etablierten Demyelinisierung ist detailliert. Die Vorbereitung der NSCs, die Laminektomie der Brustwirbel 9 (T9), und die Transplantation von NSCs zusammen mit dem Pre-und post-operative Betreuung der Mäuse dargestellt.

Chirurgische Transplantation von Maus Neural Stem Cells in den Rückenmark von Mäusen mit neurotropen Maus Hepatitis Virus infiziert

Mäuse, die mit dem neurotropen JHM-Stamm des Maus-Hepatitis-Virus (MHV) infiziert wurden, entwickeln pathologische und klinische Verläufe, die denen von Patienten mit der ... ähnlich sind.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, durch die Transplantation von neuralen Stammzellen in das Rückenmark von mit JHMV infizierten Mäusen die Remyelinisierung und eine klinische Verbesserung bei Tieren mit etablierter Demyelinisierung zu fördern. Dies wird erreicht, indem zunächst das Versuchstier präpariert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht in der Durchführung einer Laminektomie an den Brustwirbeln.10 Zellen werden anschließend in das freigelegte Rückenmark injiziert. Nach einer erfolgreichen Injektion wird die Wunde verschlossen. Letztendlich erfolgt der Nachweis von neuronalen Stammzellen der Maus im Rückenmark.Das Parenchym kann mithilfe von Methoden wie der Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden, ebenso wie die Transplantation von neurogenen Stammzellen in das Rückenmark von JHMB. Infizierte Mäuse können helfen, zentrale Fragen im Bereich der Zellersatztherapien zur Behandlung demyelinisierender Erkrankungen zu beantworten, beispielsweise wie sich die Zellen migrieren, proliferieren und differenzieren, sowie wie sie das zentrale Nervensystem beeinflussen. Und ob wir die Zellen oder die Umgebung des Rückenmarks, in die sie transplantiert werden, verändern können, um ihre therapeutischen Wirkungen zu verstärken.Obwohl diese Methode Einblicke in die Zellersatztherapie an einem viralen Modell der Demyelinisierung ermöglichen kann, ist sie ebenfalls auf andere Modelle der Demyelinisierung und von Verletzungen anwendbar, wie beispielsweise die experimentell-autoimmune Enzephalomyelitis, EAE, und die Rückenmarkverletzung. Bevor die Zellen für die Injektion vorbereitet werden, bereiten Sie alle notwendigen Lösungen vor. Reinigen und sterilisieren Sie anschließend sämtliche Geräte.Bereiten Sie den Operationsbereich vor und richten Sie den Mikromanipulator ein, um die Zellen für die Transplantation vorzubereiten. Lösen Sie die Augen mit Trypsin auf und resuspendieren Sie sie in einem 50-Milliliter-Konikalgefäß. Waschen Sie die zu transplantierenden Zellen dreimal in HBSS. Zählen Sie die Zellen vor dem letzten Zentrifugationsschritt.Nach dem letzten Schritt abzentrifugieren, abgießen Sie das HBSS ab und lassen Sie das Gefäß in umgekehrter Position stehen, um zu verhindern, dass Tropfen das Pellet erreichen. Trocknen Sie die inneren Wände mit einem UV-bestrahlten sterilen Kim-Tuch ab. Lassen Sie das Pellet nicht austrocknen.Halten Sie das Röhrchen aufrecht, langsam und sehr vorsichtig. Resuspendieren Sie die Zellen in der halben endgültigen gewünschten Menge an HBSS. Letztendlich sollten die Zellen eine Konzentration von 100.000 Zellen pro Mikroliter aufweisen.Messen Sie das Gesamtvolumen, indem Sie die Suspension in eine Pipettenspitze aufnehmen und anschließend den Drehregler der Pipette so justieren, dass die gesamte Suspension in der Pipettenspitze ist. Dadurch erfahren Sie, wie viel HBSS zusätzlich benötigt wird, um die gewünschte Konzentration zu erreichen. Ergänzen Sie die Zellen auf das gewünschte Endvolumen. Durch Zugabe von HBSS. Sie können die Zellen in ein Eppendorf-Röhrchen überführen. Stellen Sie sie anschließend wieder auf Eis.Überprüfen Sie die Zellviabilität, wenn die Zellen länger als zwei Stunden auf Eis gehalten werden müssen. Um die chirurgische Prozedur zu beginnen, bestätigen Sie die korrekte Anästhesietiefe mittels des Zehenquetschreflexes. Verwenden Sie elektrische Haarschneider, um den dorsalen Bereich der Maus vom unteren Rücken bis zum Nacken zu rasieren.Nachdem der Bereich rasiert wurde, eine dünne Schicht Enthaarungscreme auftragen, um eventuell verbliebene Haare zu entfernen. Nach ein bis zwei Minuten den Bereich zunächst mit trockenem Mull abwischen und anschließend mit einem leicht in Seifenwasser getränkten Tuch nachwischen. Der Operationsbereich sollte nun haarfrei sein.Zum Schluss desinfizieren Sie den präparierten Bereich mit Betadine-Lösung und tragen Sie Salbe auf die Augen auf. Um Austrocknung zu vermeiden, positionieren Sie die Maus in Rückenlage. Führen Sie einen Schnitt über die Laminektomiestelle durch, der sich etwa von den Brustwirbeln erstreckt.T8 bis T11. Überbetonen Sie die Krümmung der Wirbelsäule und lokalisieren Sie T10. Es ist der erste Wirbel mit einem flachen Fortsatz und liegt in der Regel zwei Wirbel kaudal zum Apex der Krümmung der Wirbelsäule.Mit der grauen Pinzette die Wirbelsäule festhalten. Bei T9 mit einem Skalpell die Stelle zwischen den beiden Dornfortsätzen von T10 und T11 einritzen. Anschließend die Muskelschicht abschaben, um den darunterliegenden Knochen freizulegen, wobei darauf zu achten ist, dass die Krümmung der Schere vom Rückenmark wegzeigt.Führen Sie langsam eine Scherenklinge zwischen T 10 und T 11 ein. Bewegen Sie die Klinge zwischen das Rückenmark und das Pedikel von T 10 und durchtrennen Sie das Pedikel. Wiederholen Sie den Vorgang auf der anderen Seite. Heben Sie das Laminabogen, um das darunterliegende Rückenmark freizulegen, und durchtrennen Sie es vorsichtig.Stellen Sie sicher, dass keine losen oder scharfen Knochenfragmente zurückbleiben. Sobald alle Knochenfragmente entfernt sind, wischen Sie das Blut mit sterilen Wattestäbchen ab. Bereiten Sie zunächst die Hamilton-Spritze vor, indem Sie die Nadel mit der Nadelmutter befestigen.Setzen Sie den Kolben ein und spülen Sie mehrmals mit Wasser durch. Einmal mit 70 % Ethanol und HBSS gereinigt. Entfernen Sie den Kolben und lösen Sie die Nadelmutter.Ziehen Sie die Nadel von der Spritze weg, um Gegendruck zu vermeiden. Beim Beladen der Zellen geben Sie 15 Mikroliter Zellen in die Spritze, indem Sie die Pipettenspitze fest in das hintere Ende der Spritze drücken. Führen Sie den Kolben etwa fünf Millimeter ein und ziehen Sie dann die Nadelmutter fest. Drücken Sie den Kolben so lange herunter, bis eine kleine Menge der Zellsuspension aus der Nadel austritt. Stellen Sie sicher, dass sich keine Bläschen in der Spritze befinden, und legen Sie die Spritze anschließend horizontal ab, um zu verhindern, dass die Zellen durch Schwerkraft eine Gradientenbildung erfahren. Gehen Sie zurück zum Tier und verwenden Sie eine Hämorrhagieklemme, um den S-Spinosus-Muskel zu greifen.Verbinden der Dornfortsätze von T acht und T neun. Befestigen Sie die Hämostaseklemme am linken Mikromanipulatorarm, sodass die Vorderpfoten der Maus in der Luft sind und die Hinterpfoten leicht eine Plattform aus sterilen Papiertüchern berühren.Befestigen Sie die Spritze im rechten Mikromanipulatorarm in einem Winkel von 70 Grad und schieben Sie die Spritze vor dem Festklemmen in die niedrigstmögliche Position. Stabilisieren Sie die Maus, indem Sie ihren Schwanz gegen die Papiertücher drücken. Senken Sie die Nadel langsam auf das Rückenmark zu.Führen Sie die Spitze um einen Millimeter durch die dorsale Mittellinie in die gegenüberliegende Hemisphäre ein. Die Nadelspitze sollte sich im grauen Mark oder in der Nähe, jedoch nicht im Zentralkanal befinden. Injizieren Sie langsam 2,5 µL Zellen mit einer Geschwindigkeit von einem µL pro fünf Sekunden.Nach der Injektion der Zellen 10 Sekunden warten und die Nadel zurückziehen. Ein Zehntel einer Umdrehung. Alle 10 Sekunden mit diesem Tempo zurückziehen, bis die Nadel aus dem Strang heraus ist.Wenn die Zellen zu schnell injiziert oder die Nadel zu schnell entfernt wird, kann es zu einem Rückfluss der Zellsuspension kommen. Tritt dies auf, schließen Sie die Maus von der Studie aus. Sobald die Nadel aus dem Strang entfernt wurde, ziehen Sie sie schnell zurück und lösen Sie die Spritze vom Mikromanipulatorarm. Erneut horizontal ablegen. Die Maus loslassen und auf einen Nähtisch übertragen. Dieses Verfahren für jede Maus wiederholen, bis die Spritze leer ist.Entfernen Sie die Zellen und laden Sie erneut auf, falls Klumpenbildung sichtbar ist, wobei die Spritze zwischen den Beladungen gespült und gereinigt wird. Nach der Injektion wird das Tier an einen separaten Ort gebracht, um genäht zu werden. Führen Sie die Nahtnadel durch die oberflächliche Faszie auf beiden Seiten des Einschnitts.Ziehen Sie die Naht durch, um die Fascia zusammenzuführen und das exponierte Rückenmark an der Stelle der entfernten Lamina zu bedecken. Verwenden Sie einen Nadelhalter in Pinzette, um drei Knoten zu binden, und schneiden Sie so viel Faden wie möglich ab. Normalerweise genügt eine Naht, während die Haut vom Mausgewebe weggezogen wird.Um zu verhindern, dass der darunterliegende Muskel geheftet wird, schließen Sie den Einschnitt mit zwei bis drei Heftklammern. Sobald die Wunde verschlossen ist, injizieren Sie 0,5 Milliliter Ringer-Laktatlösung subkutan in den unteren Rücken, jedoch abseits des Einschnitts. Legen Sie die Maus seitlich in ihren Käfig und stellen Sie sicher, dass die Operationsstelle nicht mit dem Käfigstreue in Kontakt kommt.Beobachten Sie die Tiere, bis sie sich vollständig erholt haben. Dieses Bild zeigt erfolgreich transplantierte, mit GFP markierte murine neurale Stammzellen in einem koronalen Schnitt des Rückenmarks. 21 Tage nach der Transplantation.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man neurogene Stammzellen in das Rückenmark von mit JHMV infizierten Mäusen transplantiert. Sobald die Technik beherrscht ist, ist es möglich, sie an 40 Mäusen innerhalb von etwa drei Stunden durchzuführen.

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Forschung

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Neurowissenschaften

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Dieses Video zeigt die intranasale Verabreichung von onkolytischen, mit Viren beladenen therapeutischen neuralen Stammzellen in ein Hirntumor-tragendes Mausmodell. Die nicht-invasive intranasale Verabreichung von Stammzellen umgeht die Blut-Hirn-Schranke und erleichtert so deren Abgabe an die Tumorstelle im Gehirn für therapeutische Anwendungen.

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Verletzungen des Rückenmarks ist eine traumatische Erkrankung, die schwere Morbidität und hoher Sterblichkeit führt. In dieser Arbeit beschreiben wir im Detail eine Quetschung Modell der Verletzung des Rückenmarks in Mäusen, gefolgt von einer Transplantation von neuralen Stammzellen.

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Transplantation von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Mikroglia im immunkompetenten Mäusegehirn über nicht-invasiven transnasalen Weg

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Chirurgische Transplantation von Maus Neural Stem Cells in den Rückenmark von Mäusen mit neurotropen Maus Hepatitis Virus infiziert (Video) | JoVE Journal

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