Name: Screening Assay für oxidativen Stress in einem Feline Astrocyte Cell Line, G355-5 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie oxidativen Stress in Astrozyten mit CM-H2DCFDA und Durchflusszytometrie quantitativ messen. Diese Methode nutzt Wasserstoffperoxid und fluoreszierende Indikatoren zur Analyse reaktiver Sauerstoffspezies in Zellkulturen.

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1. Zellkultur von feline Astrozyten und die Behandlung mit H 2 O 2 <ol><li> Kultur-Zelllinie G355-5 in eine 75 cm 2-Kolben mit DMEM-Medium plus Nährstoffe bei 37 ° C und 5% CO 2 bis zu 60% konfluent (~ 5 Tage). Ersetzen Sie die Medien alle 1-2 Tage oder bei Bedarf auf eine gesunde Kultur aufrecht zu erhalten. </li><li> Entfernen Sie das Medium und 2 ml 0,25% Trypsin. Heben Sie die Zellen durch Pipettieren für 45 s - 1 min bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Schnelle Übertragung der Suspension auf eine 15 ml konische Röhrchen mit 10 ml Medium. Vorsichtig mischen. </li><li> Bei 300 g zentrifugiert, 23 ° C für 3 min zu einem Pellet zu erhalten. Überstand verwerfen, ohne das Pellet. </li><li> Fügen Sie 6-7 ml frisches Medium und Zellen. </li><li> Add ~ 1 ml der Zellen in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Fügen Sie 2-3 ml Medium in jede Vertiefung und inkubieren, bis 80-90% konfluent. </li><li> Bereiten Sie eine 100 &amp;mgr; Lösung von Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) in den Medien. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus jeder Vertiefung und ersetzen entweder mit 2 ml frisches Medium (Kontrolle), 2 ml H 2 O 2 (Behandlung) oder 2ml DPBS. Bei 37 ° C, 5% CO 2 für 3 h. </li><li> Remove-Lösungen und 1 ml Trypsin auf die Zellen zu heben. Transfer-Zellen zu einem 1,7 ml Eppendorf-Röhrchen mit 0,5 ml DPBS. Dieser Schritt sollte auf jedes Well einzeln durchgeführt werden, um den Zelltod bei längerer Trypsin Inkubation zu verhindern. </li><li> Spin bei 300 xg für 3 min, den Überstand verwerfen und Zellen in 1 ml DPBS. </li></ol> 2. Färbung für ROS <ol><li> Alle Schritte zur Färbung sollte mit minimalen Belichtung zu verhindern Bleichen durchgeführt werden. </li><li> Add 1 ul 50 mM CCCP mit der positiven Kontrolle. Bei 37 ° C, 5% CO 2 für 5 min. </li><li> Add 5 ul einer 10 mM CM-H 2 DCFDA Lösung des H 2 O 2-Gruppe. Bei 37 ° C, 5% CO 2 für 15-30 min. Kein Fleck ist an der Saline Probe zugegeben. </li><li> Wash Proben mit 2 ml DPBS um restliche Fleck zu entfernen. </li><li> Spin bei 300 xg für 3 min zu einem Pellet zu erhalten. </li><li> Die Zellen in 0,5 ml DPBS. Fügen Sie 1 ul PI zu jeder Probe, mit Ausnahme der Kochsalzlösung. </li><li> Transfer-Proben auf eine 5ml Durchflusszytometer Röhre. </li><li> Run am Durchflusszytometer. </li></ol> 3. Durchflusszytometrie <ol><li> Run Proben auf einem Beckman Coulter FC500 (oder gleichwertig) mit einem 488 nm Argon-Laser und die folgenden Bandpässe ausgestattet: 525, 775 und 620 nm, alle ± 20 nm auf. </li><li> Bereiten Sie die entsprechenden Steuerelemente: ungefärbte Zellen, angefärbt CM-H 2 DCFDA nur, PI nur, doppelt gefärbt (Negativ-Kontrolle). </li><li> Machen Sie ein Protokoll, das die folgenden histoplots hat: FS vs SS, PI vs CM-H 2 DCFDA. Es sollte auch die folgenden Histogramme: Zellzahl vs FL1, FL2 und FL3, die die Flecken entspricht. </li><li> Bevor Sie die Proben, überprüfen Ausrüstung, Flüssigkeiten und Abfallbehälter. Warm up die Ausrüstung für mindestens 20 min. </li><li> Reinigen Sie die Ausrüstung und eine Kalibrierung mit den entsprechenden Perlen nach Herstellerangaben Standards. </li><li> Wählen Sie Ihr Protokoll und laufen die Proben. </li><li> Reinigen Sie das Gerät als gemacht vorher. </li><li> Reinigen Sie die Saugleitung nach dem Hersteller-Standards. </li><li> Schalten Sie den Strom und reinigen Sie den Kopf / Vakuum-Leitung. </li><li> Schalten Sie die Software und den Computer neu. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Durchflusszytometrie Ergebnisse wurden mit FlowJo 7,6 und der Fleck Kontrollen wurden verwendet, um objektiv stellen Sie die Gating. Auf dieser Basis erscheinen gesunde Zellen auf der linken Seite des Histogramms und ROS (oxidativer Stress) wurde als eine Verlagerung von Zellen auf der rechten Seite festgestellt. Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse der Wirkung von Wasserstoffperoxid auf gesunde Katzen Astrozyten. Daten von FL1 wurde verwendet, um die Intensität der CM-H 2 DCFDA, die die Anwesenheit von ROS zeigt messen. Wie erwartet, wurde eine größere Menge an ROS in der Probe mit H 2 O 2 behandelt wurden. Dies ist auf das Histogramm als eine Verschiebung in der Fluoreszenzintensität von links nach rechts angezeigt. Beim Vergleich von gesunden Zellen mit DMEM gegenüber DPBS behandelt, es gab keine signifikante Änderung in der Höhe von ROS (Abb. 2). <img src="/files/ftp_upload/2841/2841fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Durchflusszytometrie Ergebnisse der Ebenen von oxidativem Stress bei gesunden Katzen Astrozyten und die Wirkung von H 2 O 2 auf gesunde Zellen. Die Ergebnisse zeigen, dass H 2 O 2 Ebenen der ROS in gesunden Zellen erhöht sich um Zellen, die mit keiner Behandlung (DMEM) verglichen. <img src="/files/ftp_upload/2841/2841fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Durchflusszytometrie Ergebnisse Niveau von ROS in gesunden Zellen für 3h mit DPBS inkubiert erkannt.

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Ein häufig vorgeschlagene Mechanismus der Virus-induzierten neuronalen Schädigung ist oxidativer Stress 1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31. Grundsätzlich wird vorgeschlagen, dass durch virale Belastung der Glia (Astrozyten und Mikroglia) Freisetzung reaktiver Sauerstoff-Radikale, wie Hydroxid, Superoxidanion, Stickstoffmonoxid und / oder Wasserstoffperoxid, die giftig für Nervenzellen sind. Ebenso hat oxidativer Stress auch als ein wichtiger Pathomechanismus in Methamphetamin-induzierte Neurotoxizität <sup...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> CellGro </td><td> 15 bis 013-CV </td><td></td></tr><tr><td> MEM Vitamine </td><td> CellGro </td><td> 25 bis 020-cl </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Hyclone </td><td> 17-605E </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Nicht-essentiellen Aminosäuren </td><td> Hyclone </td><td> 25 bis 025-cl </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td> 20% (v / v) </td></tr><tr><td> Essentielle Aminosäuren </td><td> CellGro </td><td> 25 bis 030-cl </td><td> 0,2% (v / v) </td></tr><tr><td> 500ml Vakuumfiltration System </td><td> VWR </td><td> 87006-076 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml konische Röhrchen </td><td> Falke </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 75 cm 2 Zellkulturflaschen </td><td> Falke </td><td> 353136 </td><td></td></tr><tr><td> 6 gut Gewebekulturplatte </td><td> Falke </td><td> 353224 </td><td></td></tr><tr><td> CM-H 2 DCFDA </td><td> Invitrogen </td><td> C6827 </td><td></td></tr><tr><td> Propidiumiodid (PI) </td><td> Sigma </td><td> P4170-10mg </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Lonza </td><td> 17-160F </td><td></td></tr><tr><td> H 2 O 2 </td><td> Sigma </td><td> H6520 </td><td></td></tr><tr><td> HyQ Antibiotika </td><td> Hyclone </td><td> SV30079.01 </td><td> 0,1% (v / v) </td></tr><tr><td> G355-5-Zellen </td><td> ATCC </td><td> CRL-2033 </td><td> Normale Katzen Gehirn </td></tr></tbody></table>

screening assay für oxidativen stress in einem feline astrocyte cell line, g355-5

Screening Assay for Oxidative Stress in a Feline Astrocyte Cell Line, G355-5

Eine häufig vorgeschlagene Mechanismus der Virus-induzierten neuronalen Schädigung ist oxidativer Stress. Astrozyten spielen eine wichtige Rolle bei der Kontrolle von oxidativem Stress des Zentralen Nervensystems (ZNS). Astrozyten zur Aufrechterhaltung eines homöostatischen Umgebung für Neuronen sowie Schutz der Neuronen von Reactive Oxygen Species (ROS). CM-H2DCFDA ist ein zellpermeablen Indikator für die Anwesenheit von ROS. CM-H 2 DCFDA in die Zelle als nicht-fluoreszierende Verbindung, und wird fluoreszierende nach zelluläre Esterasen entfernen Sie die Acetat-Gruppen, und die Verbindung wird oxidiert. Die Anzahl der Zellen, mittels Durchflusszytometrie gemessen, dass gefunden zu grün fluoreszierenden sind ein Indiz für die Anzahl der Zellen, die in einer oxidativen Zustand sind. CM-H 2 DCFDA ist anfällig für eine Oxidation durch eine große Anzahl verschiedener ROS. Dieser Mangel an Spezifität in Bezug auf die ROS können CM-H 2 DCFDA oxidieren, macht diese Verbindung eine wertvolle Regenten für den Einsatz in den frühen Phasen eines Pathogenese Untersuchung, da dieser Test kann auf dem Bildschirm für eine oxidative zellulären Umgebung, unabhängig von der Sauerstoff verwendet werden Radikal oder Kombination von ROS sind verantwortlich für die zelluläre Bedingungen. Nachdem festgestellt wurde, dass ROS Gegenwart durch Oxidation von CM-H 2 DCFDA, dann weitere Experimente durchgeführt werden, um festzustellen, welche ROS oder eine Kombination von Ross in der jeweiligen Pathogenese beteiligt sind, sind. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass mit der Zugabe von Wasserstoffperoxid eine Erhöhung der CM-H 2 DCFDA fluoreszieren wurde gegenüber dem Kochsalzkontrollen, entdeckt darauf hinweist, dass dieser Test ein wertvolles Test zum Nachweis einer oxidativen Umgebung innerhalb G355-5-Zellen, einer ist feline Astrozyten-Zelllinie.

Ein Screening-Verfahren zur oxidativen zellulären Umgebungen erkennen ist, um die Oxidation von CM-H2DCFDA messen. Sobald in einer Zelle, CM-H2DCFDA Änderungen von nicht-fluoreszierenden in einen fluoreszierenden Verbindung oxidiert. Diese Änderung in der Fluoreszenz wird mittels Durchflusszytometrie gemessen und gibt die Anzahl der Zellen in einer oxidativen Umgebung.

Screening Assay für oxidativen Stress in einem Feline Astrocyte Cell Line, G355-5

Ein häufig vorgeschlagener Mechanismus für virusinduzierte neuronale Schäden ist oxidativer Stress. Astrozyten spielen eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des oxidativen Stresses von ...

Astrozyten spielen eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des oxidativen Stresses im zentralen Nervensystem, tragen zur Aufrechterhaltung eines homöostatischen Milieus für Neuronen bei und schützen Neuronen vor reaktiven Sauerstoffspezies. Hier wird eine Methode zur Bestimmung des oxidativen Stresses in Astrozyten vorgestellt. Um zu veranschaulichen, wie dieser Test funktioniert, wird Wasserstoffperoxid und ROS, die typischerweise während des zellulären Stoffwechsels gebildet werden, neben dem Test auf feline Astrozyten appliziert.Für reaktive Sauerstoffspezies wird der zellgängige Indikator CMH 2D CFDA den Zellen zugesetzt. CMH 2D CFDA gelangt als nicht fluoreszente Verbindung in die Zelle, wo zelluläre Esterasen die Acetatgruppen entfernen. Bei Anwesenheit reaktiver Sauerstoffspezies wird die Verbindung oxidiert und fluoresziert anschließend.Die Zellen werden anschließend geerntet und die Fluoreszenz mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Die Anzahl der fluoreszierenden Zellen zeigt die Anzahl der Zellen in einem oxidativen Zustand an. Ziel ist es dann natürlich, mithilfe verschiedener Zugänge nachzuweisen, welche spezifischen Sauerstoffradikale in den Zellen vorhanden sind.Dies i

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Dieses Video beschreibt die Technik zur Visualisierung von oxidativem Stress in kultivierten Organoiden. Diese Arbeit hilft dabei, das Ausmaß des oxidativen Stresses aufgrund der ROS-Akkumulation in den verschiedenen Zelltypen zu verstehen, die in einem Organoid nach der Behandlung mit verschiedenen ROS-Modulatoren vorhanden sind.

Fluoreszenzsonden-Imaging-Assay: Eine Technik zur Visualisierung von oxidativem Stress in kultivierten Darmorganoidzellen von reaktiven Sauerstoffspezies, die mit Induktoren behandelt wurden

Dieses Video zeigt die Bewertung der mitochondrialen Gesundheit in genetisch veränderten Astrozyten, die ein fluoreszierendes Protein in ihren Mitochondrien exprimieren. Das Protein hilft dabei, Veränderungen der mitochondrialen Gesundheit zu verfolgen, da seine Fluoreszenz von grün zu rot wechselt, was auf Stress oder Schäden hinweist. Die Bilder werden anhand verschiedener Parameter erfasst und analysiert.

Fluoreszenzbasiertes Monitoring von mitochondrialem Stress in Astrozyten

Ischämischen Schlaganfall ist schwer zu lernen ist ein komplexer Vorgang, in dem der spezifische Beitrag der Astrozyten, die betroffene Hirnregion Glukose Sauerstoffmangel (OGD) ausgesetzt. Dieser Artikel stellt eine Methode zur isolierte Astrozyten zu erhalten und ihre Reaktivität und Verbreitung unter OGD Bedingungen zu studieren.

Überwachung der Astrozyten Reaktivität und Proliferation in Vitro unter ischämischen-ähnlichen Bedingungen

Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung von genetisch codierte Fluorogenic Reporter in einer live Cell Imaging-Anwendung für die Prüfung der Harnblase-induzierten oxidativen Stress. Diese experimentelle Ansatz bietet unvergleichliche räumlich-zeitliche Auflösung, Sensitivität und Spezifität vieler die Unzulänglichkeiten der konventionellen Methoden zur Erkennung von toxikologischen oxidativen Stress zu vermeiden.

Imaging-Ansätze zur Bewertung der toxikologischen oxidativen Stress mit genetisch codierte Fluorogenic Sensoren

Wir stellen ein Protokoll für die Entwicklung und Verwendung eines oxidativen Stressmodells vor, indemwir retinale Pigmentepithelzellen mit H2O2behandeln und Zellmorphologie, Lebensfähigkeit, Dichte, Glutathion und UCP-2-Spiegel analysieren. Es ist ein nützliches Modell, um die antioxidative Wirkung von Proteinen zu untersuchen, die von Transposon-transfizierten Zellen sezerniert werden, um neuroretinale Degeneration zu behandeln.

Induktion und Analyse von oxidativem Stress in Dornröschen-Transposon-transfizierten menschlichen retinalen Pigmentepithelzellen

Basierend auf in vitro Experimenten enthüllte diese Studie den Mechanismus von Crocetin bei der Reparatur von oxidativen Stressschäden von Kardiomyozyten durch Beeinflussung der Mitophagie, bei der der PINK1/Parkin-Signalweg eine wichtige Rolle spielt.

Schutz von H9c2-Myokardzellen vor oxidativem Stress durch Crocetin über den PINK1/Parkin-Signalweg vermittelte Mitophagie

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode zur Quantifizierung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung von Dihydroethidium (DHE) als Fluoreszenzfarbstoffsonde unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Screening-Ansatzes. Das Protokoll beschreibt die Methoden zur quantitativen Beurteilung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in den drei verschiedenen hepatozellulären Karzinomzelllinien.

Hochdurchsatz-Screening-Bewertung der Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) mit Dihydroethidium (DHE)-Fluoreszenzfarbstoff

Die Quantifizierung sowohl oxidierter als auch reduzierter Formen von Glutathion (GSSG bzw. GSH) wurde durch die Verwendung von Ortho-Phthalaldehyd (OPA) erreicht. OPA wird stark fluoreszierend, sobald es an GSH konjugiert wird, ist aber nicht in der Lage, GSSG zu konjugieren, bis es reduziert wird. Hier beschreiben wir einen multiparametrischen Assay, um beides mittels Proteinquantifizierung zur Normalisierung zu quantifizieren.

Schnelle Quantifizierung von oxidierten und reduzierten Formen von Glutathion unter Verwendung von ortho-Phthalaldehyd in kultivierten Säugetierzellen in vitro

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen in funktionelle Vorderhirn-spezifische Astrozyten erleichtert. Dies ermöglicht die Untersuchung der Rolle von Gliazellen bei der Pathogenese von neurologischen Entwicklungsstörungen, wie dem Fragile-X-Syndrom, und die Modellierung anderer Hirnerkrankungen.

Generierung und Charakterisierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Astrozyten, denen das fragile X-Boten-Ribonukleoprotein fehlt

Diese Video-Protokoll zeigt ein neues Verfahren zur Erzeugung und anschließender Reinigung von neuronalen Vorläuferzellen aus einer erneuerbaren Quelle von neuralen Stammzellen (NSC) an körperlicher (Größe und Granularität internen) und fluoreszierenden Eigenschaften unter Verwendung von Durchflusszytometrie-Technologie.

Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie

Erfahren Sie, wie Sie oxidativen Stress in Astrozyten mit CM-H2DCFDA und Durchflusszytometrie quantitativ messen. Diese Methode nutzt Wasserstoffperoxid und fluoreszierende Indikatoren zur Analyse reaktiver Sauerstoffspezies in Zellkulturen.

Screening Assay für oxidativen Stress in einem Feline Astrocyte Cell Line, G355-5

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