Name: Ex-vivo-Infektion von lebendem Gewebe mit onkolytischen Viren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Erfahren Sie die ex-vivo-Infektion frischer Gewebeproben mit onkolytischem Vaccinia-Virus zur Bewertung der Infizierbarkeit. Diese Methode ermöglicht die Überwachung viralen Replikation durch Fluoreszenz- und Biolumineszenzbildgebung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir möchten Dr. Hesham Abdelbary für die Bereitstellung von menschlichen chirurgischen Proben für die Daten in Abb. 2 dargestellt danken.

1. Tissue Verarbeitung <ol><li> Für beste Ergebnisse sollte dieses Protokoll unter Verwendung von frisch isolierten Gewebe in DMEM-Medium hinterlegt, welches 10% FBS, 1% Pennicilin / Streptomycin-Lösung und 0,1% Amphotericin B-Lösung unmittelbar nach der Operation vor der Verarbeitung sein. Ist dies nicht möglich ist, können Gewebe über Nacht in diesem Medium belassen werden bei 4 Grad vor der Verarbeitung. </li><li> Vor der Verarbeitung der Probe, sterilisieren Metall Pinzette und Einweg-Klingen durch Hinterlegung sie in einem 70% igem Ethanol-Lösung für mindestens 5 Minuten. Ferner einen 24-Well-Platte mit 2 ml DMEM Medium mit 10% FBS, 1% Pennicilin / Streptomycin-Lösung und 0,1% Amphotericin B. </li><li> Sammeln Sie die Gewebeprobe in einer laminaren Strömung Zellkultur Kapuze mit sterilisierten Pinzetten und Hinterlegung des Gewebes in einen leeren 15 cm Petrischale, halten den Deckel auf der Seite, sterile Seite nach oben. </li><li> In der Zellkultur Kapuze, mit einem 2 mm Biopsiestanze auf verschiedenen Kernen aus einer Vielzahl von Regionen innerhalb des Gewebes, wie in Abbildung 1 zu erhalten. Kaution die Kerne in den Deckel der 15 cm Petrischale mit Hilfe der Pinzette, so dass genügend Platz zwischen den einzelnen Kern, so dass sie leicht entlang der horizontalen Achse geschnitten werden. </li><li> Split jeder Kern in 4 sogar Quartale mit einem sterilisierten Rasierklinge wie in Abbildung 1. </li><li> Mit einer Pipettenspitze, legte jeder Kern Quartal von einem bestimmten Kern in ein anderes auch von A1 bis A4, wie in Abbildung 1, die bereits mit 1,5 ml DMEM mit 10% FBS, 1% Pennicilin / Streptomycin-Lösung und 0,1% Amphotericin B-Lösung . Wiederholen Sie für jeden Kern. Dies sollte repräsentative Probenahme des Tumors, bei gleichzeitiger Minimierung der Verzerrungen in einem bestimmten und / Zustand. Zur besseren Darstellung, erhöhen Sie die Anzahl der Kerne. </li></ol> 2. Beurteilung der Lebensfähigkeit des Gewebes <ol><li> Nach Gewebe Verarbeitung, fügen Sie 25 &amp;mgr; l Alamar blue gut # A1 und A2 # wie in Abbildung 1 dargestellt und Inkubation für 1 Stunde bei 37 Grad in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. </li><li> Nach der Inkubation mit Alamar-Blau, entfernen Sie 3 mal 100 ul von jedem A1 und A2 gut und Transfer zu 6 verschiedenen Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Lesen Sie das Signal mit Hilfe eines Fluoreszenz-Reader (530 Anregung, 590 Emission) und halten die Daten für Ihre Unterlagen. </li><li> Nach Alamar blue-Signal gelesen worden ist, übertragen Sie alle Stücke von Gewebe mit Hilfe einer Pipettenspitze aus gut A1 bis C1, die enthält DMEM, 10% FBS + PS + AmphoB. Achten Sie darauf, eine übermäßige Menge an Medien und A1 übertragen. </li><li> Infect Brunnen A3 und A4 mit jeweils 10 6 PFU der GFP-exprimierenden und Luciferase-exprimierenden Vaccinia-Virus in 25 ul Medium verdünnt. Nun A2 kann mit einem Virus, das drückt jedem Transgen auch gar keine infiziert werden. </li><li> 72 Stunden später, fügen Sie 25 ul Alamar blue in die Vertiefungen C1 und D1 und wiederholen Sie Schritt 2.2 </li></ol> 3. Visualisierung von GFP Transgenexpression durch Fluoreszenz-Mikroskopie <ol><li> Entfernen Sie alle Zellkulturmedien für die Gewebestücke, um eine gute Fluoreszenz Bilder zu machen. </li><li> Mit Hilfe eines Fluoreszenz-fähigen Dissektionsmikroskop, zunächst einen Phasenkontrast Bild an eine geeignete Auflösung </li><li> Wechseln Sie zur Fluoreszenz-Modus und nehmen Sie ein Bild mit der entsprechenden Filter auf das Transgen von Interesse zu visualisieren, in diesem Fall GFP. </li><li> Verwenden Sie ein Fluoreszenz-Filter für eine andere Wellenlänge als bisher eine mögliche aus, dass das Transgen von Interesse (wie RFP), um ein Bild der Hintergrundfluoreszenz zu </li></ol> 4. Visualisierung von Luciferaseexpression mit einem In-vivo-Bildgebung System (IVIS) <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die IVIS initialisiert wird, bevor Sie beginnen. </li><li> In Brunnen A4 und B4, mit 5 ul der Luciferin-Substrat 10 mg / ml, gut mischen und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Stellen Sie die IVIS Exposition wurde auf 5 Sekunden und nehmen Sie ein Bild von Ihrem Brunnen. Wenn das Bild gesättigt ist, mit geringeren Belichtungszeit zu wiederholen. Wenn es kein Signal, erhöhen Sie die Belichtungszeit. </li><li> Mit dem IVIS Imaging-Software, können Sie entfernen Hintergrund mit dem Signal von gut B4 und wählen Sie die Region von Interesse für die Lumineszenz-Signal zu quantifizieren. </li></ol> 5. Die Beurteilung Virustiter durch Plaque-Assay <ol><li> Vor der Quantifizierung virale Titer, muss Gewebe zunächst homogenisiert, um Viruspartikel freisetzen. Dies kann einige Monate später in den infizierten Gewebeproben durchgeführt werden bei -80 </li><li> Wiegen der Probe, die homogenisiert mit Hilfe eines analytischen Maßstab werden muss. In diesem Fall werden wir die Probe aus und A2 gesammelt. </li><li> Legen Sie das Gewebe in einem 5 ml Polystyrol Rundboden-Falcon-Röhrchen und 1 ml PBS. Homogenisieren des Gewebes mit einem Gewebe-Homogenisator. Falls nötig, speichern das Homogenat bei -80 für die Bewertung der viralen Titer zu einem späteren Zeitpunkt. </li><li> Um Titer Vaccinia-Virus, erste Platte 1 Million U2OS Zellen in einer 6-Well-Platte und inkubieren bei 37 Grad über Nacht, 5% CO 2 feuchtenified Inkubator, so dass sie ca. 95% erreicht Konfluenz des folgenden Tages. </li><li> Verwenden Sie serumfreien Medien serielle Verdünnungen von Virus zu tun, achten Sie darauf, Spitzen zwischen jeder Verdünnung Schritt zu ändern. Typischerweise wir 1 in 10 Verdünnungen und verwenden 100 ul in 900 ul zu übertragen. Wie viele Verdünnungen gemacht werden, hängt von den zu erwartenden Virusausbeute. </li><li> Nach Herstellung der Verdünnungen, entfernen Sie die Medien über die plattierten U20-Zellen fügen Sie dann 500 ul der verdünnten Virus Lager (für jede Verdünnung), um die U2OS Zellen zu infizieren. Inkubieren Sie die Zellen für 1 Stunde Minuten bei 37 Grad Celsius in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator. </li><li> Während dieser Zeit aufwärmen 2 X konzentriert DMEM mit 20% FBS und die 3% CMC-Lösung in einem 37 Grad Wasserbad. </li><li> Nach dem 1 Stunde Inkubation, entfernen Sie die Medien über infizierte U2OS Zellen. 1:1 mischen Volumen von 3% CMC: 2X DMEM, 20% FBS zusammen und verwenden 2 ml dieser Mischung in jede Vertiefung der infizierten Zellen U2OS decken. </li><li> Put-Zellen wieder in eine 37 Grad 5% CO 2 befeuchteten Inkubator für weitere 48 Stunden. </li><li> Nach 48 Stunden, 2 ml Methanol-Essigsäure Fixativ auf dem CMC-Overlay in jede Vertiefung und inkubieren bei Raumtemperatur für 10 Minuten in einer Zellkultur Kapuze. </li><li> Entsorgen Sie die feste Auflage und waschen Rest aus der Brunnen mit Leitungswasser. </li><li> Stain der festen U2OS Zellen mit 2ml einer Coomassie-Blau-Lösung pro Well und Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur bei geringer Geschwindigkeit auf einem Schüttler. </li><li> Entfernen Sie die Coomassie aus den Vertiefungen Fleck und waschen Sie die Teller mit Leitungswasser. Lassen Sie sich mit Deckel für etwa eine Stunde trocknen lassen. </li><li> Die resultierende virale Plaques können leicht sichtbar in Abbildung 2c. Die Platten können auf unbestimmte Zeit in diesem Stadium gespeichert werden. </li><li> Count-Plaques bei der Verdünnung, wo zwischen 10 und 100 Plaques sichtbar sind. </li><li> Multiplizieren Sie die Anzahl der Plaques durch die Verdünnung verwendet gezählt und multiplizieren Sie die resultierende Zahl durch 2 zu einem Titer in PFU / ml zu erhalten. Zum Beispiel, wenn 25-Plaques in den Brunnen, wo ein Millionen-fachen Verdünnung verwendet wurde gezählt werden, ist der Titer der ersten unverdünnten Probe 25 von 1 Million von 2 oder 50 Millionen PFU / ml multipliziert. Weitere teilen diese Zahl durch das Gewicht zunächst für die Probe-Titer in PFU / g Bericht zu messen </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Um genau zu bestimmen, ob ein chirurgisch gewonnenen normal / Tumorgewebe Probe ist oder nicht infizierbaren mit dem Virus, muss man zuerst sicherstellen, dass die Gewebeprobe mindestens lebensfähig ist. Abb. 1A zeigt, dass die Rentabilität beurteilt werden kann mit einem metabolischen Farbstoff (Alamar blue) und dass sowohl Normal-und Tumorgewebe bleiben können metabolisch aktive über einen Zeitraum von mindestens 72 Stunden sein. Dies deutet darauf hin, dass Gewebe kultiviert ex vivo kann die virale Replikation zu unterstützen. Ein wesentlicher Vorteil von onkolytischen Viren ist, dass sie konstruiert werden können, um therapeutische oder Imaging Transgene exprimieren. Abb. 2D-E zeigt, dass GFP oder Luciferase aus dem Gewebe infiziert ex vivo nachgewiesen werden können, weiter unterstützen, dass diese Gewebe lebensfähig und auch infizierbaren sind. Obwohl erhöhte Transgenexpression ist in der Regel mit viralen Replikation assoziiert, bedeutet dies nicht zwangsläufig zu einer produktiven viralen Lebenszyklus, die Selbst-Verstärkung und Verbreitung, die vermutlich für therapeutische Aktivität wichtig ist, führt gleichzusetzen. Aus diesem Grund ist es notwendig, festzustellen, ob mehr Viren als das, was verwendet wurde, um zunächst zu infizieren das Gewebe hergestellt wird. Abb. 2B zeigt, dass auf virale Quantifizierung durch Plaque-Assay, mehr Viren nach 72 Stunden Infektion erhalten dann Gewebe unmittelbar nach der Infektion gesammelt. Insgesamt zeigen diese Daten, die chirurgisch exzidiert Tumorgewebe bleiben können in der Zellkultur lebensfähig für einen Zeitraum von mindestens 72 Stunden, während welcher Zeit die virale Replikation unterstützt werden kann. <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Übersicht über die Gewebeentnahme / Schneiden Protokoll. Gewebeprobe wird durch das Entfernen mehrerer 2 mm-Kerne, die anschließend in vier Viertel, die zufällig in die Vertiefungen A1-A4 verteilt sind unterteilt verarbeitet. Die Farbcodes zeigen die Reagenzien in jedem gut genutzt. Die grau unterlegten Felder in den Brunnen stellen jedes Quartal seit 6 einzelne Kerne dargestellt. Das Gewebe in gut A1 ist es, einen neuen Brunnen (C1) mit den Medien nach dem ersten Alamar-Blau Lesen übertragen. Eine zweite Lesung ist am Ende der 72 Stunden Inkubation mit Viren durchgeführt. Wells A4 und B4 werden mit Luciferin nach dem 72 Stunden Inkubationszeit nach der Infektion ergänzt <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Die Lebensfähigkeit und infectability der Patienten Gewebeproben. A) Tissue Lebensfähigkeit von Alamar-Blau-Signal bei 2 Stunden und 72 Stunden nach der Sammlung gemessen. Y-Achse repräsentiert die leere korrigiert Alamar-Blau-Signal. B) Titer von Vaccinia-Virusgesammelt pro Gramm Gewebe-Proben 2 und 72 Stunden nach der Infektion. C) Beispiel von Vaccinia-Virus-Plaques auf U2OS Zellen nach Coomassie-Färbung. D) Lumineszenz-Signal von Patienten VV-Luciferase-infiziertem Gewebe erhalten aufgenommen mit IVIS. E) Fluoreszenzmikroskopie Bilder der Patient Gewebeprobe mit VV-GFP infiziert.

<ol><li>Parato, K. A., Senger, D., Forsyth, P. A., Bell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+battle+between+oncolytic+viruses+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the battle between oncolytic viruses and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 5, 965-976 (2005).</li>
<li>Renouf, L. C., Thway, K., Sibtain, A., McNeish, I. A., Newbold, K. L., Goldsweig, H., Coffin, R., Nutting, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I%2FII+study+of+oncolytic+HSV+GM-CSF+in+combination+with+radiotherapy+and+cisplatin+in+untreated+stage+III%2FIV+squamous+cell+cancer+of+the+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Phase I/II study of oncolytic HSV GM-CSF in combination with radiotherapy and cisplatin in untreated stage III/IV squamous cell cancer of the head and neck.</a> Clin Cancer Res. 16, 4005-4015 (2010).</li>
<li>Lal, R., Harris, D., Postel-Vinay, S., de Bono, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reovirus%3A+Rationale+and+clinical+trial+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Reovirus: Rationale and clinical trial update.</a> Curr Opin Mol Ther. 11, 532-539 (2009).</li>
<li>Park, B. H., Hwang, T., Liu, T. C., Sze, D. Y., Kim, J. S., Kwon, H. C., Oh, S. Y., Han, S. Y., Yoon, J. H., Hong, S. H., Moon, A., Speth, K., Park, C., Ahn, Y. J., Daneshmand, M., Rhee, B. G., Pinedo, H. M., Bell, J. C., Kirn, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+targeted+oncolytic+poxvirus%2C+JX-594%2C+in+patients+with+refractory+primary+or+metastatic+liver+cancer%3A+a+phase+I+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial.</a> Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).</li>
<li>Breitbach, C. J., Reid, T., Burke, J., Bell, J. C., Kirn, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+the+clinical+development+landscape+for+oncolytic+viruses+and+other+cancer+therapeutics%3A+no+shortcuts+on+the+road+to+approval.+Cytokine+Growth+Factor+Rev%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Navigating the clinical development landscape for oncolytic viruses and other cancer therapeutics: no shortcuts on the road to approval. Cytokine Growth Factor Rev.</a> 21, 85-89 (2010).</li>
<li>Boeuf, F. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+interaction+between+oncolytic+viruses+augments+tumor+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Synergistic interaction between oncolytic viruses augments tumor killing.</a> Mol Ther. 18, 888-895 (2010).</li>
<li>Silva, N. D. e, Atkins, H., Kirn, D. H., Bell, J. C., Breitbach, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+trouble+for+tumours%3A+exploiting+the+tumour+microenvironment+to+enhance+anticancer+effect+of+oncolytic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Double trouble for tumours: exploiting the tumour microenvironment to enhance anticancer effect of oncolytic viruses.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21, 135-141 (2010).</li>
<li>Diallo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+pharmacoviral+approach+identifies+novel+oncolytic+virus+sensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers.</a> Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).</li>
<li>Cooke, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-tumour+genetic+heterogeneity+and+poor+chemoradiotherapy+response+in+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intra-tumour genetic heterogeneity and poor chemoradiotherapy response in cervical cancer.</a> Br J Cancer. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Pennington, K., Chu, Q. D., Curiel, D. T., Li, B. D. L., Mathis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Utility+of+a+Tissue+Slice+Model+System+to+Determine+Breast+Cancer+Infectivity+by+Oncolytic+Adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">The Utility of a Tissue Slice Model System to Determine Breast Cancer Infectivity by Oncolytic Adenoviruses.</a> J Surg Res. , 1-6 (2010).</li>
<li>Hochberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropism+of+herpes+simplex+virus+type+1+to+non-melanoma+skin+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Tropism of herpes simplex virus type 1 to non-melanoma skin cancers.</a> Br J Dermatol. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Kuip, H. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> BMC Cancer. 6, 86-86 (2006).</li>
</ol>

Einer der wichtigsten Schritte in diesem Protokoll ist die Beschaffung frischen Gewebeprobe. Wenn die Probe in der Zellkultur nach einer langen Wartezeit am OP-Saal in einem ungeeigneten Medien (zB PBS) gestellt, kann dieser Kompromiss Gewebeviabilität und verhindern infectability. Zu beachten ist, normales Gewebe naturgemäß anfälliger für diese Effekte als Tumorgewebe. Ein weiterer kritischer Punkt ist, wie viele Kerne werden verwendet, um das Gewebe und die Konsistenz ihrer Größe Probe. Inkonsistenzen in der Größe wird die Variabilität in Patientenproben führen, da Faktoren wie Hypoxie und infectectable Oberfläche schwanken abhängig von der Größe der Kerne und Kern-Viertel. Während dies teilweise durch Verwendung von Gewebe Aufschnittmaschinen gelöst werden kann, ist ein Vorteil der hier vorgestellten Verfahren, dass es relativ einfach ist, weniger anfällig für Verschmutzung und breit anwendbar auf eine Vielzahl von Gewebearten, darunter weich oder zähflüssig Geweben, die nicht leicht zugänglich sind das Gewebe schneiden. Bemerkenswert ist, kann die Anzahl der Kerne erhöht werden, um bessere Gewebe-Darstellung zu erhalten. Auch die Kerne in mehrere Teile (zB 5-8) geschnitten werden, um andere potenzielle Assays unterzubringen parallel wie DNA, RNA oder Protein-Extraktion durchgeführt werden. Allerdings wird die Anzahl der Stücke, in denen die Kerne, um reproduzierbare Größen geschnitten werden kann, auf die tatsächliche Größe der Kerne, die durch die Verwendung unterschiedlicher Größe Entkernern geändert werden können, hängen. Optional ist ein Weg, um Hilfe zu erhalten reproduzierbar große Gewebestücke auch die Länge der Kerne mit einem Lineal vor einer weiteren Unterteilung in kleinere Stücke. Das Protokoll kann natürlich geändert werden, um andere Viren beherbergen, und wir haben festgestellt, dass Gewebe können lebensfähig sein und unterstützt die Replikation für bis zu 6 Tage. Das Protokoll kann weiter auf Messungen von anderen viral-Ausdruck Transgene einschließlich cytrokines erweitert werden. Nach der Infektion kann Gewebe auch in Paraffin für weitere Schnitte und Färben von immunhistochemischen Methoden, die zur weiteren Verfeinerung des Gewebes Histologie ermöglicht und wie sie sich auf virale Infektion 10-12 eingebettet werden.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Hohe Glukose DMEM </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> NorthBio Inc. </td><td> NBSF-701 </td><td></td></tr><tr><td> Amphotericin B-Lösung </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A2942 </td><td> Verwenden Sie bei 0,1% </td></tr><tr><td> Pennicilin-Streptomycin </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P4333 </td><td> Verwenden Sie bei 1% </td></tr><tr><td> Alamar Blue </td><td> Invitrogen </td><td> DAL1025 </td><td></td></tr><tr><td> D-Luciferin Kaliumsalz </td><td> Molecular Imaging Products </td><td> D-Luciferin Kaliumsalz 1g </td><td> Resuspendieren in PBS bei 10 mg / ml und Filter auf 0,22 um Filter </td></tr><tr><td> MEM Pulver </td><td> Gibco </td><td> # 41500018 </td><td> Machen Sie in der Hälfte der vorgeschlagenen Volumen von 2X MEM und Filter auf 0,22 um Filter vor der Verwendung der </td></tr><tr><td> Carboxymethylcellulose (CMC) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C9481 </td><td> Machen Sie eine 3% ige Lösung in VE-Wasser und Autoklaven. Beachten Sie, dass Pulver kann einige Zeit dauern resuspendieren </td></tr><tr><td> Coomassie Brilliant Blue R </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B7920 </td><td></td></tr><tr><td> 2 mm Biopsiestanze </td><td> Miltex </td><td> MX-33 bis 31 </td><td></td></tr><tr><td> Double Edge Prep Blades </td><td> Personna Medical Care </td><td> 74-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszenz-Mikroskop disection </td><td> Leica </td><td> Modell M205 FA </td><td></td></tr><tr><td> In-vivo-Imaging-System (IVIS) </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> IVIS ® 200 Serie </td><td></td></tr><tr><td> Tissue Tearor </td><td> Biospec Produkte </td><td> Modell 985370-395 </td><td></td></tr></tbody></table>

ex-vivo-infektion von lebendem gewebe mit onkolytischen viren

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Onkolytischer Viren (OVS) sind neuartige Therapeutika, die selektiv in replizieren und zu töten Tumorzellen 1. Mehrere klinische Studien zur Beurteilung der Wirksamkeit einer Vielzahl von Plattformen, darunter onkolytischen HSV, Reovirus, und Vaccinia OVS als Behandlung für Krebs sind derzeit im Gange 2-5. Ein wesentliches Merkmal von onkolytischen Viren ist, dass sie genetisch verändert werden kann, um Reporter Transgene, die es möglich, die Infektion von Gewebe durch Mikroskopie oder Bio-Lumineszenz-Imaging 6,7 visualisieren macht auszudrücken. Dies bietet einen einzigartigen Vorteil, da es möglich ist, Geweben von Patienten ex vivo vor der Therapie zu infizieren, um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen onkolytischer Virotherapie 8 zu ermitteln. Zu diesem Zweck ist es wichtig, angemessen Gewebeprobe für Gewebe Heterogenität zu kompensieren und zu bewerten Gewebeviabilität, insbesondere vor der Infektion 9. Es ist auch wichtig, um die virale Replikation mit Reporter Transgene, wenn sie von den onkolytischen Plattform sowie durch direkte Titration von Geweben nach der Homogenisierung, um zwischen abortive und produktive Infektion zu unterscheiden zu folgen. Das Ziel dieses Protokolls ist es, diese Probleme anzugehen und hierin beschrieben 1. Die Probenahme und der Vorbereitung von Tumorgewebe für die Zellkultur 2. Die Beurteilung der Lebensfähigkeit des Gewebes mit dem metabolischen Farbstoff Alamar blue 3. Ex-vivo-Infektion von kultivierten Gewebe mit Vaccinia-Virus, die entweder GFP oder Luciferase 4. Nachweis der Transgenexpression durch Fluoreszenzmikroskopie oder mit einem In-vivo-Imaging System (IVIS) 5. Die Quantifizierung der Virus durch Plaque-Assay. Diese umfassende Methode hat mehrere Vorteile wie etwa eine einfachere Gewebe Verarbeitung, Entschädigung für die Gewebe-Heterogenität, die Kontrolle der Lebensfähigkeit des Gewebes und Diskriminierung zwischen abortive Infektion und Knochen fide Virusreplikation.

Onkolytischen Viren sind für Krebstherapeutika vielversprechend. Die Fähigkeit, die infectability von Live-Gewebeproben von Patienten vor der Behandlung erhalten zu ermitteln ist ein einzigartiger Vorteil dieses therapeutischen Ansatzes. Dieses Protokoll beschreibt, wie das Gewebe für die Prozess-<em&gt; Ex vivo</em&gt; Infektion mit onkolytischen Virus und nachfolgende virale Quantifizierung.

Ex-vivo-Infektion von lebendem Gewebe mit onkolytischen Viren

Onkolytische Viren (OVs) sind neuartige Therapeutika, die sich selektiv in Tumorzellen replizieren und diese abtöten1. Mehrere klinische Studien zur Bewertung der Wirksamkeit ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Replikation des onkolytischen Vaccinia-Virus in frischem, nach einer Operation gewonnenen Gewebe zu beobachten. Dies wird durch die Entnahme von Gewebeproben für die Zellkultur erreicht, um Verzerrungen aufgrund der Gewebeheterogenität zu minimieren. Im zweiten Schritt wird die Gewebeviabilität bewertet, um die Qualität des Ausgangsmaterials vor der Infektion mit dem Virus sicherzustellen.Als nächster viraler Trend wird die Genexpression überwacht und die Virustiter werden bestimmt. Um zu beurteilen, ob das lebende chirurgische Präparat eine produktive Vaccinia-Infektion unterstützen kann, werden Ergebnisse erhalten, die auf der Beobachtung der Expression von fluoreszierenden Proteinen oder biolumineszenten Reportern sowie auf einem Anstieg des viralen Titer im Zeitverlauf die Vaccinia-Replikation in Geweben belegen.Hallo, ich bin Jean Simone Diallo. Die Implikationen dieser Technik reichen bis hin zur Krebstherapie, da sie zur Identifizierung von Patienten führen können, die besonders gut für eine Behandlung mit onkolytischen Viren geeignet sind. Hallo, ich bin allerdings Naomi.Diese Methode kann Einblicke in die Infektionsfähigkeit von Tumorgeweben mithilfe des onkolytischen Vaccinia-Virus geben. Sie kann auch auf andere onkolytische Viren wie das vesikuläre Stomatitis-Virus sowie vermutlich auf andere Viren wie das Herpes-simplex-Virus, Adenovirus und Rio-Virus mit geringfügigen Modifikationen angewendet werden. Hallo, ich bin Dominic.Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die Gewebe nur schwer reproduzierbar entnommen werden können und das Zerschneiden der Gewebeproben in kleine und gleichmäßige Stücke eine Herausforderung darstellen kann. Hallo, ich bin John Bell, und die heutige Prozedur wird von zwei sehr talentierten Doktoranden in meinem Labor demonstriert, Naomi DeSilva und Dominic Wa. Unterstützt werden sie von Derek Butterwick, einem chirurgischen Assistenzarzt vom Ottawa Hospital, der im laminaren Flusswerkzelle.Kulturhaube arbeitet. Verwenden Sie eine 2-mm-Biopsiepunch, um Gewebeproben aus verschiedenen Regionen der Gewebeprobe zu entnehmen.Platzieren Sie jeden Kern mit Hilfe einer Pipette in den Deckel einer umgedrehten Petrischale, die PBS enthält, und justieren Sie die Probe bei Bedarf mit einer Pinzette. Achten Sie darauf, ausreichend Abstand zwischen den einzelnen Kernen zu lassen, damit sie problemlos entlang der horizontalen Achse geteilt werden können. Teilen Sie jeden Gewebekern mit einer sterilisierten Rasierklinge in vier gleich große Viertel. Verwenden Sie dann eine Pipettenspitze, um jedes Viertel in vier separate Vertiefungen einer 24-Loch-Platte zu geben, die jeweils zwei Milliliter Medium enthalten. Wiederholen Sie dies mit jedem Viertel eines zweiten Gewebekerns und geben Sie diese Viertel in dieselben vier Vertiefungen der 24-Loch-Platte. Setzen Sie dies fort, bis alle Gewebekerne ausplattiert wurden.Nachdem alle Gewebeprobenkerne in die Vertiefungen eingefügt wurden, 25 Mikroliter Alamar Blue in eine der Vertiefungen mit Gewebe sowie in eine Kontrollvertiefung geben und mindestens eine Stunde bei 37 Grad in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Nach Ablauf der Inkubationszeit drei Aliquots à 100 Mikroliter aus jeder mit Alamar Blue behandelten Vertiefung entnehmen und in separate Vertiefungen einer 96-Loch-Platte überführen. Wiederholen Sie dies mit zwei weiteren Aliquots à 100 Mikroliter aus denselben Vertiefungen.Lesen Sie das Alamar-Blue-Signal mit einem fluoreszenten Plattenreader aus und nehmen Sie die Daten auf. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um jedes Gewebestück aus den mit Alamar Blue behandelten Vertiefungen in eine saubere Vertiefung der 24-Loch-Platte mit frischem Medium zu überführen. Vermeiden Sie es, große Mengen Medium zusammen mit der Probe zu übertragen.Als Nächstes infizieren Sie eine der Vertiefungen mit Gewebeprobe mit sechs Plaque-bildenden Einheiten des GFP-exprimierenden Vaccinia-Virus, verdünnt in 25 Mikroliter Medium. Infizieren Sie anschließend eine weitere Vertiefung mit sechs Plaque-bildenden Einheiten des Luciferase-exprimierenden Vaccinia-Virus. Inkubieren Sie die Platte 72 Stunden nach der Infektion 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid.Fügen Sie 25 Mikroliter Alamar Blue zur zuvor analysierten Probe hinzu. Inkubieren Sie eine Stunde bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Entnehmen Sie anschließend drei Proben zu je 100 Mikrolitern und analysieren Sie sie wie zuvor in einem fluoreszenzbasierten Plattenreader.Aspirieren Sie zuerst das Medium aus der mit dem GFP-exprimierenden Vaccinia-Virus behandelten Vertiefung und waschen Sie diese zweimal direkt in der Vertiefung mit PBS. Verwenden Sie dann ein fluoreszenzfähiges Stereomikroskop. Nehmen Sie ein Phasenkontrastbild des Gewebestücks mit einer geeigneten Auflösung von 40-facher Vergrößerung auf.Wechseln Sie anschließend in den Fluoreszenzmodus und verwenden Sie einen Filter, der GFP-Emissionen detektieren kann. Visualisieren Sie die GFP-Expression im GFP-transduzierten Gewebe. Schließlich verwenden Sie einen Fluoreszenzfilter für eine andere Wellenlänge, die so weit wie möglich von der des Transgens von Interesse entfernt liegt.Und machen Sie ein Bild der Hintergrundfluoreszenz. Sammeln Sie als Nächstes die Gewebestücke mit Pipettenspitzen ein. Wiegen Sie das Gewebe.Diese Messung wird verwendet, um die Titrierung des Virus in Bildungseinheiten pro Gramm am Ende des Verfahrens zu berechnen. Lagern Sie das Gewebe bei minus 80 Grad Celsius für eine spätere Titrierung. Pipettieren Sie fünf Mikroliter eines 10 Milligramm pro Milliliter Lucifer-Substrats in die Vertiefung, die mit luciferaseexprimierendem Vaccinia-Virus transduziert wurde, sowie in eine Vertiefung, die nur Zellkultur enthielt. Inkubieren Sie das Medium fünf Minuten bei Raumtemperatur.Laden Sie die Platte in das In-vivo-Bildgebungssystem ein und stellen Sie die Belichtungszeit auf fünf Sekunden ein. Nehmen Sie ein Bild der mit dem Luciferase-exprimierenden Vaccinia-Virus transduzierten Vertiefungen auf. Wiederholen Sie den Vorgang mit einer kürzeren Belichtungszeit, falls das Bild überbelichtet erscheint, oder verwenden Sie eine längere Belichtungszeit, falls kein Signal beobachtet wird.Richten Sie eine 6-Loch-Platte mit jeweils einer Million lebenden U2-OS-Zellen pro Loch in vollständigem Medium ein und inkubieren Sie sie über Nacht in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, sodass die Löcher am nächsten Tag eine Konfluenz von 95 % erreichen. Entnehmen Sie die zuvor gewogenen infizierten Gewebeproben. Überführen Sie die Proben in ein 5-Milliliter-Polystyrol-Rundboden-Zentrifugenröhrchen und geben Sie 1 Milliliter PBS hinzu.Verwenden Sie einen Gewebehomogenisator, um das Gewebe zu homogenisieren und die viralen Partikel freizusetzen. Stellen Sie anschließend serielle Verdünnungen im Verhältnis 1:10 der Gewebehomogenat-Virussuspension in serumfreiem Medium her, indem Sie 100 Mikroliter der Gewebehomogenat-Virussuspension zu 900 Mikroliter serumfreiem Medium überführen und diesen Schritt bei Bedarf wiederholen. Danach saugen Sie das Medium aus der 6-Loch-Platte, die die U2 OS-Zellen enthält. Pipettieren Sie 500 Mikroliter jeder seriellen Verdünnung in eine Vertiefung der Platte. Stellen Sie die Platte für eine Stunde in den Zellkultur-Inkubator und schwenken Sie die Platten vorsichtig alle 15 Minuten, um Austrocknung der Zellen zu verhindern, während die Zellen inkubieren. Erwärmen Sie eine größere Flasche mit zweifach konzentriertem DMEM, das 20 % FBS enthält, sowie eine Aliquot einer 3 %igen CMC-Lösung in einem 37-Grad-Wasserbad. Nach dem Aufwärmen stellen Sie eine 1:1-Mischung aus 3 % CMC und zweifach konzentriertem DMEM mit 20 % FBS her, um eine Endkonzentration von 1,5 % CMC und 10 % FBS zu erreichen.Nach der Inkubation. Entfernen Sie das Medium von den U2-OS-Zellen und ersetzen Sie es durch zwei Milliliter der 1,5 % CMC 10 % FBS DMEM-Mischung pro Vertiefung. Stellen Sie die Platte für weitere 48 Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück. Nach 48 Stunden geben Sie zwei Milliliter Methanol-Essigsäure-Fixansatz zu der CMC-Medienmischung in jeder Vertiefung hinzu und inkubieren die Platte 10 Minuten bei Raumtemperatur in der Zellkulturwerkbank.Nach Ablauf der Inkubationszeit saugt man die Lösung aus jedem ab. Spülen Sie jedes Gefäß mit Leitungswasser, um verbleibenden Fixator zu entfernen. Danach pipettieren Sie zwei Milliliter Kumasi-Blau-Lösung in jedes hinein.Danach die Platte auf ein Schüttelbett stellen und 30 Minuten bei Raumtemperatur bei langsamer Schüttelgeschwindigkeit inkubieren. Die Kumasisierblau-Lösung von dem Brunnen abpipettieren und mit Leitungswasser spülen. Die unbedeckte Platte etwa eine Stunde im Abzug trocknen lassen. Die viralen Plaques bei der Verdünnungsstufe zählen, bei der zwischen 10 und 100 Plaques sichtbar sind.Multiplizieren Sie die Anzahl der gezählten Plaques mit der verwendeten Verdünnung und anschließend das Ergebnis mit zwei, um die Titerangabe in Plaque-bildenden Einheiten pro Milliliter zu erhalten. Teilen Sie diese Zahl außerdem durch das ursprünglich bestimmte Probengewicht, um die Angabe in Plaque-bildenden Einheiten pro Gramm anzugeben. Dieses Diagramm veranschaulicht die Gewebeviabilität, gemessen anhand der Signalintensität von Alamar Blue nach zwei Stunden und 72 Stunden nach der Probennahme, und zeigt, dass sowohl normales als auch Tumorgewebe über einen Zeitraum von mindestens 72 Stunden metabolisch aktiv bleiben können.Diese repräsentativen Daten zeigen die Menge an Vaccinia-Virus, die pro Gramm Gewebeprobe zwei und 72 Stunden nach der Infektion gesammelt wurde. Dies deutet darauf hin, dass das Virus einen produktiven viralen Lebenszyklus durchläuft, der zu einer Selbstvermehrung und Ausbreitung führt. Diese Abbildung zeigt ein typisches Lumineszenzsignal, das von einem mit Vaccinia-Virus infizierten Patienten stammt.Gewebeproben mit Luciferase-Infektion, abgebildet mittels In-vivo-Bildgebungssystem. Bereiche intensiver Lumineszenz erscheinen rot gemäß der Lumineszenz-Skalenleiste rechts. Der Vergleich der Phasenkontrast- und GFP-Kanal-Fluoreszenzmikroskopiebilder zeigt den Anteil des durch Vaccinia-Virus-GFP transduzierten Gewebes. Das Fehlen eines Signals im roten Kanal weist auf die Spezifität des Fluoreszenzsignals hin.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets frisches Gewebe zu verwenden und so weit wie möglich repräsentative Bereiche davon zu beproben. Nach diesem Verfahren können alternative Methoden wie Gewebefixierung, Immunhistochemie oder DNA- bzw. RNA-Extraktionen anstelle der Titrierung durchgeführt werden, um weitere Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise: Welche spezifischen Gewebestrukturen werden vom Virus infiziert, und welchen Einfluss hat das Virus auf die Genexpression? Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie wir Proben für ex vivo-Infektionen mit dem Vaccinia-Virus aufbereiten, und wie wir die Ausbreitung des Virus über die Expression von GFP- oder Luciferase-Transgenen verfolgen.Und schließlich, wie man einen Virus aus Probenmaterial impft. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit lebenden Viren je nach Stamm und Vorsichtsmaßnahmen gefährlich sein kann; es sollten stets Schutzhandschuhe getragen und die Arbeiten in einer geeigneten laminaren Flusswerkbank durchgeführt werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

ex-vivo-infection-of-live-tissue-with-oncolytic-viruses

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieser Artikel beschreibt die Kultur der Patientensicherheit Gewebeschnitten für den Gentransfer-Studien und die anschließende Analyse der Genexpression mittels IVIS Biolumineszenz-Bildgebung.

Ex vivo-Kultur der Patient Tissue &amp; Prüfung von Gentransfer

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the propagation and harvesting of oncolytic herpes simplex virus in mammalian cell cultures, highlighting viral entry, replication, and the recovery of virus-loaded cells. It further shows methods for preserving infected cells for downstream processing.

Propagation and Harvesting of Oncolytic Herpes Simplex Virus in Mammalian Cells

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the purification of an oncolytic virus from infected mammalian cell cultures using nuclease treatment, sequential centrifugation, membrane filtration, and sucrose cushion centrifugation.

 Oncolytic Virus Purification from Infected Mammalian Cells 

Gegründet Krebszelllinien und Heterotransplantate waren die Hauptstütze der Krebsforschung in den letzten Jahrzehnten. Jedoch schlägt letzten Beweis, dass therapeutische Reaktion wird durch die Tumorzelle Mikro beeinflusst. Daher haben wir eine ex vivo-Analyse des Primärtumorproben für die Arzneimittelentwicklung Zwecke entwickelt.

Ex-vivo-Ansprechen auf die Behandlung von Primärtumoren und / oder assoziierten Metastasen für die präklinische und klinische Entwicklung von Therapeutika

Baumwollratten sind extrem erregbar und haben eine starke Flucht-oder-Kampf-Reaktion. Es wird eine zur Stressreduktion der Tiere optimierte Handhabungsmethode beschrieben, die Baumwollratten als präklinisches Modell leichter zugänglich machen wird.

Die Handhabung der Baumwolle Ratte in Studien für die präklinische Bewertung onkolytischer Viren

Onkolytische Virotherapien befinden sich in der Entwicklung als neuartige Therapeutika zur Behandlung des hepatozellulären Karzinoms (HCC).  In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur lokoregionären Therapie des HCC über die hepatische arterielle Verabreichung des onkolytischen Virus beschrieben.

Transarterial Verwaltung von onkolytischen Viren für lokoregionale von Orthotopische HCC bei Ratten

Hier beschreiben wir ein Protokoll für den Einsatz von Hochdurchsatz-Screening der RNAi Host Ziele aufzudecken, die manipuliert werden können, um die onkolytische Viren Therapie zu verbessern, speziell Rhabodvirus und Vaccinia-Virus-Therapie, aber es kann leicht an andere onkolytische angepasst werden Virus-Plattformen oder für die Entdeckung von Host-Gene, die Replikation des Virus in der Regel zu modulieren.

Genomweiten RNAi-Screening, Host Faktoren zu identifizieren, die onkolytische Viren Therapie zu modulieren

Infektion des menschlichen Gewebes mit Human Immunodeficiency Virus (HIV) ex Vivo bietet eine wertvolle 3D-Modell des Virus Pathogenese. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu verarbeiten und infizieren Gewebeproben aus menschlichen Tonsillen und weiblichen genitalen Schleimhäute mit HIV-1 und in der Kultur an der Air liquide-Schnittstelle zu erhalten.

Ex-Vivo Infektion der lymphatischen Gewebe und weiblichen genitalen Schleimhaut mit Human Immunodeficiency Virus 1 und Histoculture

Dieses Protokoll beschreibt einen detaillierten Workflow für die Generierung und ex-Vivo Charakterisierung von onkolytische Viren für den Ausdruck von Immunmodulatoren, Masern-Viren Codierung bispezifische T Zelle Engagers als Beispiel verwenden. Anwendung und Anpassung an andere Vektor-Plattformen und transgene beschleunigt die Entwicklung von neuartigen Immunovirotherapeutics für klinische Übersetzung.

Paramyxoviruses für Tumor-gezielte Immunmodulation: Gestaltung und Evaluation Ex Vivo

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Erzeugung und Charakterisierung von Urothelorganoiden der Maus, die Deletionen in interessanten Genen beherbergen. Die Methoden umfassen die Gewinnung von Maus-Urothelzellen, die Ex-vivo-Transduktion mit Adenovirus-treibender Cre-Expression mit einem CMV-Promotor sowie die In-vitro- sowie In-vivo-Charakterisierung.

Ex vivo Organoid-Modell von Adenovirus-Cre-vermittelten Gendeletionen in Urothelzellen der Maus

Erfahren Sie die ex-vivo-Infektion frischer Gewebeproben mit onkolytischem Vaccinia-Virus zur Bewertung der Infizierbarkeit. Diese Methode ermöglicht die Überwachung viralen Replikation durch Fluoreszenz- und Biolumineszenzbildgebung.

Ex-vivo-Infektion von lebendem Gewebe mit onkolytischen Viren

Weitere Videos entdecken