Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, genomweite Barcode-Mikrobensammlungen zu verwenden, um die Wechselwirkungen zwischen Gen, Medikament und Genumwelt auf hochgradig parallele Weise zu verstehen. Dies wird erreicht, indem die Mikrobensammlung auf fünf bis 20 Wachstumsgenerationen in Gegenwart eines Medikaments untersucht wird, wobei Robotik verwendet wird, um die Zellen im exponentiellen Wachstum zu halten. In einem zweiten Schritt werden Zellen gesammelt, die es uns ermöglichen, genomische DNA von 4.000 bis 6.000 Individuen gleichzeitig zu extrahieren.

Als nächstes werden PCR-Produkte, die die amplifizierten Barcodes enthalten, entweder mittels Microarray-Hybridisierung oder Barcode-Sequenzierung quantifiziert, um die Barcodes zu quantifizieren und dadurch die Häufigkeit jedes Stammes in einem komplexen Pool zu bestimmen. Letztendlich werden Ergebnisse erzielt, die zeigen, welche barcodierten Mutanten empfindlich auf Behandlungen reagieren und daher im Laufe des Experiments aus dem Pool entfernt werden. Der Hauptvorteil der Technik, die wir heute sehen werden, besteht darin, dass wir es nicht mit einzelnen Stämmen als Kolonien auf Platten oder einer einzelnen Flüssigkultur zu tun haben, sondern Zehn- oder Hunderttausende verschiedener Stämme ziehen und sie als einen einzigen Pool analysieren können.

Als wir also die Leistungsfähigkeit dieses Assays erkannten, mussten wir ihn automatisieren, und glücklicherweise arbeitete ich am Stanford Genome Technology-Sensor und war von Ingenieuren umgeben, die es mir ermöglichten, dies zu erreichen. Das Protokoll wird heute von Andrew Smith demonstriert, einem leitenden Doktoranden in meinem Labor, der alle Protokolle und die damit verbundenen Verfahren durchgehen wird. sowie Tanya Durick, die uns zeigen wird, wie man die Sequenzierungsaspekte des Protokolls durchführt. Dieses Protokoll verwendet eine Bibliothek von Canada albicans-Mutanten, die durch Transponierung bei Mutagenese erzeugt wurden, wobei jede Mutante ein Barcode-Tag trägt, um einzelne Mutanten in einem einzigen Pool zu kombinieren. Eine Kopie der Bibliothek wird auf 3 84 repliziert.

Mit Platten mit Edia-Platten werden die Kolonien zwei bis drei Tage lang bei 30 Grad Celsius wachsen lassen, bis sie ihre maximale Größe erreicht haben. Arbeiten Sie dann in einer mikrobiologischen Umgebung mit Flamme und steriler LabWare, fluten Sie jedes Tablett mit fünf bis 10 Millilitern Medium und lassen es fünf Minuten lang einweichen. Reanimation, suspendieren Sie die Kolonien mit einem Zellstreuer und gießen Sie die Flüssigkeit plus Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

DMSO zu 7 % hinzufügenStellen Sie die Zellen auf eine endgültige OD 600-Konzentration von 50 pro Milliliter mit Medien mit 7 % DMSO ein und aliquotieren Sie dann ein Volumen von 40 Mikrolitern in PCR-Streifenröhrchen, gepoolte Zellaliquote können unbegrenzt bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Um dieses Verfahren zu beginnen, tauen Sie gepoolte Zellaliquote auf Eis auf, verdünnen Sie das Pool sofort vorsichtig in Medien mit einem Arzneimittel oder einer Bedingung Ihrer Wahl und inokulieren Sie mit einem OD 600 von 0,0625 in einem Gesamtvolumen von 700 Mikrolitern pro Vertiefung in einer 48-Well-Platte. Für die Zwecke dieses Videos werden Triplikate von zwei Bedingungen erstellt.

Bringen Sie mindestens eine geeignete Lösungsmittelkontrolle auf der Platte an. Versiegeln Sie die Platte mit einer Kunststoffplattendichtung, züchten Sie die Zellen in einem Spektralphotometer oder einem temperaturgesteuerten Shaker, der bei 30 Grad Celsius mit einem experimentell festgelegten Schüttelschema geschüttelt wird. Schütteln Sie z. B. 14 Minuten lang, lesen Sie eine Minute lang die Vertiefungen und setzen Sie dann den Schüttelvorgang fort.

Ein Teil der Zellsuspension kann vom Roboter geerntet und auf einer Kohleplatte auf dem Roboterdeck gespeichert werden. Zu benutzerdefinierten Generierungszeitpunkten in der Regel 5, 10, 15 und 20 Wachstumsgenerationen. Ernten Sie mindestens zwei oder 600 Zellen für jede Probe und jeden Zeitpunkt.

Übertragen Sie die geernteten Zellproben in sicher verschließbare Mikrozentrifugenröhrchen. Diese Zellen können dann für die genomische DNA-Extraktion verwendet werden, die als nächstes gezeigt wird, um dieses Verfahren zu beginnen. Aufgereinigte genomische DNA von Zellen, die zu verschiedenen Zeitpunkten mit einem Hefestern-Kit geerntet wurden.

Nach Herstellerangaben wird mit einer Modifikation die DNA mit 300 Mikrolitern 0,1 XTE eluiert. Richten Sie als Nächstes zwei PCR-Reaktionen für jede Probe ein. Einen für die UPT-Tags und einen für die Down-Tags.

Überprüfen Sie die resultierenden PCR-Produkte auf einem Gel. Für Amplikons, die für die Hybridisierung verwendet werden, wird ein 60-Basenpaar-Produkt für beide PCRs erwartet, wie in den Spuren eins und drei gezeigt. In diesem Beispiel wird ein Produkt mit 130 Basenpaaren für Amplikons für die Barcode-Sequenzierung erwartet, wie in den Lanes fünf und sieben gezeigt.

Zu diesem Zeitpunkt können die PCR-Produkte entweder für die Microarray-Analyse oder die direkte Barcode-Sequenzierung verwendet werden, je nachdem, welches PCR-Produkt generiert wurde. Zur Vorbereitung der Microarray-Analyse heizen Sie die Temperatur des Hybridisierungsofens auf 42 Grad Celsius vor und stellen Sie ein kochendes Wasserbad und einen Eiskübel mit einer Eiswasseraufschlämmung auf. Befeuchten Sie die Arrays vor, indem Sie sie langsam mit 120 Mikrolitern einer x-Hybridisierung befüllen. Puffer.

Inkubieren Sie die Arrays 10 Minuten lang im Hybridisierungspuffer bei 42 Grad Celsius und 20 U/min, während die Arrays inkubiert werden, und bereiten Sie 0,5-Milliliter-Röhrchen mit 120 Mikrolitern Hybridisierung vor. Mischen Sie pro Probe plus eine zusätzliche Probe als Puffer für jedes Röhrchen. Fügen Sie dem Hybridisierungsmix 30 Mikroliter Aufnahme, PCR und 30 Mikroliter Down-Tag-PCR hinzu, um ein Gesamtvolumen von 150 Mikrolitern zu erhalten.

Zwei Minuten kochen lassen und mindestens zwei Minuten in Eiswasser ruhen lassen. Drehen Sie die Röhren vor dem Gebrauch kurz. Entfernen Sie den Vorhybridisierungspuffer aus den Arrays und fügen Sie 120 Mikroliter Hybridisierungs-PCR-Mix hinzu, um eine Verdunstung zu verhindern.

Decken Sie die Array-Dichtungen mit einer harten Stelle ab und hybridisieren Sie 16 Stunden lang bei 42 Grad Celsius und 20 U/min. Nehmen Sie die Arrays aus dem Hybridisierungsofen und entfernen Sie die harten Stellen von den Chips. Entfernen Sie langsam die Hybridisierungsmischung mit einer Pipette aus den Arrays und füllen Sie die Arrays.

Mit 120 Mikrolitern Wash a laden Sie die Arrays in die Waschmaschine der grundierten Fluidikstation. Die Arrays werden unter Verwendung des Genprotokolls Flex SV 3 4 50 mit den folgenden Modifikationen gewaschen. Ein zusätzlicher Schritt mit Waschgang A vor dem Färben.

Waschen B, Temperatur von 42 Grad Celsius statt 40 Grad Celsius und Färbung bei 42 Grad Celsius auf der Fluidikstation statt bei 25 Grad Celsius. Führen Sie nach den Fluidikvorgängen die Fluidikstation aus und fahren Sie vier 50-Protokolle herunter. Entladen Sie die Waschmaschine, nachdem Sie sichergestellt haben, dass keine Luftblasen vorhanden sind.

Legen Sie die Arrays in den Scanner und scannen Sie bei einer Emissionswellenlänge von 560 Nanometern. Das PCR-Produkt mit 130 Basenpaaren wird für die Barcode-Sequenzierung der nächsten Generation verwendet, um diese erste Trennung von 12 Pool-DNA-Proben auf einem 12%-Seiten-Gel durchzuführen. Färzen Sie anschließend das Gel mit Cybergrün und schneiden Sie das gewünschte Gelband aus.

Die aus dem Gel extrahierte DNA wird dann durch Realtime-PCR quantifiziert und Cluster auf einer Flusszelle mit einem einzigen Read unter Verwendung des CBOT- und Single-Read-Cluster-Generation-Kits generiert. Laden Sie die Durchflusszelle in den Sequenzer und beobachten Sie, wie sich die erste Basis löst. Der hier gezeigte Sequenzer ist ein repräsentatives Array Daten, die an bestimmten Punkten des Protokolls gesammelt wurden.

Der Pool der markierten markierten Mutanten wurde über 20 Generationen in Gegenwart des Antimykotikums Clotrimazol gezüchtet, und in DMSO wurde als Kontrolllog das Verhältnis von zwei für jedes Gen berechnet und aufgetragen. Alle Stämme, die signifikant empfindlich auf eine Clotrimazol-Behandlung mit einem logarithmischen Zwei-Verhältnis von zwei reagieren, sind rot hervorgehoben. In diesem Beispiel sind vier Stämme dargestellt, NCP, ein ERG zwei und zwei unabhängige Allele von ERG 11.

Das bekannte Proteinziel der Antimykotika-Clotrimazol-Stämme, die in einem gepoolten Screening als empfindlich nachgewiesen wurden, sollte hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit in individuellen Wachstumsassays in Gegenwart der gleichen Konzentration des Arzneimittels überprüft werden. Die nächste Grafik zeigt die Ergebnisse eines Bestätigungsexperiments. Die vier im Screen nachgewiesenen Stämme wiesen im Vergleich zum Wildtyp-Elternstamm ein vermindertes Wachstum auf.

BWP 17 schwarz dargestellt. Diese individuellen Wachstumskurven verdeutlichen ein wichtiges Merkmal solcher gepoolten Gen-Wirkstoff-Screenings, nämlich dass der absolute Rang eines bestimmten Stammes nicht unbedingt dessen exakte Empfindlichkeit widerspiegelt. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, wie wertvoll es ist, mehrere Allele für jedes Gen zu haben.

In diesem Fall weisen die beiden ERG 11-Disruptionsmutanten leicht unterschiedliche Sensitivitäten gegenüber dem Medikament auf. Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf Tagen von der Impfung des Bildschirms bis zur Analyse der Daten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Während also jedes einzelne Experiment biologisch aufschlussreich ist, kommt die wahre Kraft, wenn man viele Experimente durchgeführt und eine Datenbank gesammelt hat, so dass man jetzt in der Lage ist, die Genfunktion und die Wirkung von Medikamenten vorherzusagen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie genomweite barcodierte Mutantensammlungen für das Pool-Screening vorbereiten und wie Sie Mikrostrahlen oder Sequenzierung verwenden, um Gene von Interesse nach ihrer Entwicklung zu identifizieren. Diese Technik ermöglichte es Forschern auf dem Gebiet der funktionellen Genomik, die Funktion jedes der 6.000 verschiedenen Gene im Hefegenom zu untersuchen.