Name: Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: Lernen Sie hochdurchsatzfähige Screening-Methoden für Gen-Arzneimittel-Interaktionen mit barcodierten Hefebibliotheken. Dieses Protokoll ermöglicht die parallele Analyse tausender Mutanten mittels Automatisierung und Sequenzierung.

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Wir bedanken uns bei Ron Davis, Adam Deutschbauer, und die ganze HIP HOP Labor an der University of Toronto für Gespräche und Beratung. CN wird durch Zuschüsse aus dem National Human Genome Research Institute (Grant Number HG000205), RO1 HG003317, CIHR MOP-84305, und der kanadischen Krebsgesellschaft (# 020380) unterstützt. JO wurde von der Stanford Genome Training Program (Grant Number T32 HG00044 vom National Human Genome Research Institute) und die National Institutes of Health (Grant Number P01 GH000205) unterstützt. GG wird durch die NHGRI RO1 HG003317 und der kanadischen Krebsgesellschaft, Grant # 020380, TD und der Donnelly Sequencing Center unterstützt wird zum Teil durch Zuschüsse aus dem kanadischen Stiftung für Innovation zu Drs unterstützt. Brenda Andrews und Jack Greenblatt. AMS wird von der Universität von Toronto öffnen Fellowship unterstützt.

<ol><li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li>
<li>Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0008-2006.0008 (2006).</li>
<li>Claus, H., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+hotspot+for+transformation+of+Neisseria+meningitidis+by+shuttle+mutagenesis+using+signature-tagged+transposons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of a hotspot for transformation of Neisseria meningitidis by shuttle mutagenesis using signature-tagged transposons.</a> Mol Gen Genet. 259, 363-371 (1998).</li>
<li>Hava, D. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+serotype+4+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors.</a> Molecular microbiology. 45, 1389-1406 (2002).</li>
<li>Costanzo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetic+Landscape+of+a+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Genetic Landscape of a Cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
<li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Pan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+toolkit+for+functional+profiling+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">A robust toolkit for functional profiling of the yeast genome.</a> Molecular cell. 16, 487-496 (2004).</li>
<li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+Function+and+Organization+of+the+Yeast+Early+Secretory+Pathway+through+an+Epistatic+Miniarray+Profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the Function and Organization of the Yeast Early Secretory Pathway through an Epistatic Miniarray Profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Deutschbauer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+haploinsufficiency+revealed+by+genome-wide+profiling+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast.</a> Genetics. 169, 1915-1925 (2005).</li>
<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenomic+profiling%3A+identifying+the+functional+interactions+of+small+molecules+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemogenomic profiling: identifying the functional interactions of small molecules in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 793-798 (2004).</li>
<li>Lum, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li>
<li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+TagModule+collection+for+parallel+genetic+analysis+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">A universal TagModule collection for parallel genetic analysis of microorganisms.</a> Nucleic acids research. 38, e146-e146 (2010).</li>
<li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+annotation+and+drug+target+discovery+in+Candida+albicans+with+a+tagged+transposon+mutant+collection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Gene annotation and drug target discovery in Candida albicans with a tagged transposon mutant collection.</a> PLoS pathogens. 6, (2010).</li>
<li>Nislow, C., Giaever, G. Chapter 387. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNislow%2C+C+%22Yeast+Gene+Analysis%22">Yeast Gene Analysis</a>. Stark, I., Stansfields, M. J. R. , 2nd Edition, Elsevier Ltd. 387-414 (2007).</li>
<li>Pierce, S. E., Davis, R. W., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+barcoded+Saccharomyces+cerevisiae+gene-deletion+mutants+in+pooled+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of barcoded Saccharomyces cerevisiae gene-deletion mutants in pooled cultures.</a> Nature protocols. 2, 2958-2974 (2007).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. Cold Spring Harbor Laboratory. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd. edn, Cold Spring Harbor Laboratory. (2001).</li>
<li>Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phenotyping+via+deep+barcode+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative phenotyping via deep barcode sequencing.</a> Genome Res. , (2009).</li>
<li>Hamady, M., Walker, J. J., Harris, J. K., Gold, N. J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error-correcting+barcoded+primers+for+pyrosequencing+hundreds+of+samples+in+multiplex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Error-correcting barcoded primers for pyrosequencing hundreds of samples in multiplex.</a> Nature. 5, 235-237 (2008).</li>
<li>Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-Level+Analysis+of+Genes+and+Functions+Affecting+Survival+During+Nutrient+Starvation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">System-Level Analysis of Genes and Functions Affecting Survival During Nutrient Starvation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 187, 299-317 (2011).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Hier erörtern wir ein Protokoll, mit bescheidenen Modifikation, leicht zu einer Vielzahl von bestehenden Sammlungen von Barcode-Mutante Sammlungen von verschiedenen Mikroorganismen getaggt mutierten Sammlungen erstellen angepasst werden kann. Wir betonen, dass wir zwar ein Protokoll über den markierten Transposon-Mutagenese haben berichtet, für den humanpathogenen Hefepilz C. albicans, ein sehr ähnliches Protokoll könnte zu einer Vielzahl von einzelligen Pilze angepasst werden. Geändert arbeitet dieses Protokoll auch in Bakterien 13, und derzeit Kollektionen für eine Reihe von zusätzlichen Pilz-und bakterielle Genome sind im Bau. Derzeit bietet dieser Test die einzige umfassende, genomweite unvoreingenommene Bildschirm für die Gen-kleine Molekül-Wechselwirkungen. Eine besonders nützliche Funktion des Tests ist, dass keine Vorkenntnisse des Gens oder kleines Molekül erforderlich ist. Trotz des Umfangs und der Macht dieser Tests hat ihre Übertragbarkeit auf andere Labors wurde ein wenig durch die Erstinvestition und Informatik-Werkzeuge für die Analyse der Ergebnisse erschwert. Mit der Verabschiedung der nächsten Generation Reihenfolge Auslesen mit robuster Werkzeuge für die Analyse kombiniert, erwarten wir ihre Annahme zu erhöhen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Antibiotika </td><td> Hersteller und Katalog-Nummern </td></tr><tr><td> Carbenicillin </td><td> Sigma, Teil # C1613 </td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td> Sigma, Teil # K1876 </td></tr><tr><td> Spectinomycin </td><td> Sigma, Teil # S0692 </td></tr><tr><td> Chloramphenicol </td><td> Sigma, Teil # C0378 </td></tr><tr><td> DNA Clean-up und die Konzentration Kits </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep Spin Miniprep Kit </td><td> Qiagen, Teil # 27106 </td></tr><tr><td> HiSpeed ​​Plasmid Maxi Kit </td><td> Qiagen, Teil # 12663 </td></tr><tr><td> QIAquick PCR Purification Kit </td><td> Qiagen, Teil # 28106 </td></tr><tr><td> QIAquick Gel Extraction Kit </td><td> Qiagen, Teil # 28704 </td></tr><tr><td> PCR und Elektrophorese-Reagenzien </td><td></td></tr><tr><td> Taq DNA Polymerase (Mg-free) Buffer </td><td> New England Biolabs, Teil # M0320L </td></tr><tr><td> Desoxynukleotid Lösung Mix </td><td> New England Biolabs, Teil # N0447L </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl 2 </td><td> Sigma, Teil # 63036 </td></tr><tr><td> Agarose, Loading-Farbstoff und Nukleinsäure-Fleck geeignet für Gel-Elektrophorese </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> 10x TAE-Puffer </td><td> Sigma, Teil # T8280 </td></tr><tr><td> 1 Kb Plus-DNA Ladder </td><td> Invitrogen, Teil # 10787026 </td></tr><tr><td> YPD Brühe </td><td></td></tr><tr><td> 10 g Hefe-Extrakt </td><td> Sigma, Teil # Y1625 </td></tr><tr><td> 20 g Bacto Pepton </td><td> BD Biosciences, Teil # 211677 </td></tr><tr><td> 20 g Dextrose </td><td> Sigma, Teil # D9434 </td></tr><tr><td> Labware </td><td></td></tr><tr><td> Mehrkanalpipetten (1000, 200, und 20 ul) </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> Einweg Pipettieren Stauseen </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> 15 und 50 mL Zentrifugenröhrchen </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> 96 - und 384-Well Deep Well Platten </td><td> Axygen Scientific, Teil # P-2ML-SQ-CS &amp; P-384240SQCS </td></tr><tr><td> 96-well und 384-well PCR-Platten und Dichtung Film </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> Plattenroller zur Abdichtung Multi-Well-Platten </td><td> Sigma, Teil # R1275 </td></tr><tr><td> 30 ° C und 37 ° C Schüttelinkubatoren für den Anbau von Bakterien und Hefen auf Platten und in Rohren </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> In-vitro-Transposon-Mutagenese </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Tn5 Transposase </td><td> Epicentre Biotechnologies, Teil # TNP92110 </td></tr><tr><td> High-Throughput-Transformation </td><td></td></tr><tr><td> Seqprep 96 HT Plasmid Prep Kit </td><td> Edge-Biosystems, Teil # 84359 </td></tr><tr><td> Polyethylenglykol, Molekulargewicht 3350 </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> Lithiumacetat </td><td> Sigma, Teil # 517992 </td></tr><tr><td> 6-Well-Platten, steril </td><td> Corning, Teil # 3335 </td></tr><tr><td> 50 mg / mL Uridin </td><td> Sigma, Teil # U3750 </td></tr><tr><td> 100X Tris-EDTA-Pufferlösung </td><td> Sigma, Teil # T9285 </td></tr><tr><td> 1X TE/0.1M LiOAc </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> Lachs testis DNA </td><td> Sigma, Teil # 1626 </td></tr><tr><td> Das Wachstum der Barcode-Sammlungen </td><td></td></tr><tr><td> 48-Well-Platten, wenn wachsenden Kulturen in Platten </td><td> Greiner, Teil # M9437 </td></tr><tr><td> Klebeplatte Dichtungen </td><td> ABgene, Teil # AB-0580 </td></tr><tr><td> 200 ml Kulturflaschen </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> Spektrophotometer für die Absorption </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> Temperaturgeregelte Schüttler für 250 ml Flaschen oder Schütteln Spektralphotometer </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen, 2 mL </td><td> Eppendorf, Teil # 0030 120.094 </td></tr><tr><td> Hybridisierung Ausrüstung </td><td></td></tr><tr><td> Hybridisierungsofen 640 </td><td> Affymetrix, Teil # 800138 </td></tr><tr><td> GeneChip Fluidic-Station 450 </td><td> Affymetrix, Teil # 00-0079 </td></tr><tr><td> GeneArray Scanner 3000 </td><td> Affymetrix, Teil # 00-0212 </td></tr><tr><td> Kochenden Wasserbad mit schwimmenden Rack </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> Hybridisierung Verbrauchsmaterialien </td><td></td></tr><tr><td> Genflex Tag 16K Array v2 </td><td> Affymetrix, Teil # 511331 </td></tr><tr><td> Denhardt-Lösung, 50X Konzentrat </td><td> Sigma, Teil # D2532 </td></tr><tr><td> Streptavidin, R-Phycoerythrin-Konjugat (SAPE) </td><td> Invitrogen, Teil # S866 </td></tr><tr><td> Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen, 0,5 mL </td><td> Eppendorf, Teil # 0030 123.301 </td></tr><tr><td> Teeny Tough-Spots </td><td> Diversified Biotech, Teil # LTTM-1000 </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> BioRad, Teil # 161-0729 </td></tr><tr><td> 10% Tween </td><td> Sigma, Teil # T2700 </td></tr><tr><td> MES free-Monohydrat </td><td> Sigma, Teil # M5287 </td></tr><tr><td> MES Natriumsalz </td><td> Sigma, Teil # M5057 </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> Sigma, Teil # 71386 </td></tr><tr><td> 20X SSPE </td><td> Sigma, Teil # S2015 </td></tr><tr><td> Molekularbiologie Wasser </td><td> Sigma, Teil # W4502 </td></tr><tr><td> Hybridisierung Primer </td><td> Verschiedene Anbieter (Standard Entsalzung) </td></tr><tr><td> Uptag </td><td> 5 &#39;GATGTCCACGAGGTCTCT 3&#39; </td></tr><tr><td> Buptagkanmx4 </td><td> 5 &#39;Biotin-GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntag </td><td> 5 &#39;CGGTGTCGGTCTCGTAG 3&#39; </td></tr><tr><td> Bdntagkanmx4 </td><td> 5 &#39;Biotin-GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3&#39; </td></tr><tr><td> B213 </td><td> 5 &#39;Biotin-CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Uptagkanmx </td><td> 5 &#39;GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntagkanmx </td><td> 5&#39;GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Uptagcomp </td><td> 5&#39;AGAGACCTCGTGGACATC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dntagcomp </td><td> 5&#39;CTACGAGACCGACACCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Upkancomp </td><td> 5&#39;CGTACGCTGCAGGTCGAC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dnkancomp </td><td> 5&#39;CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Sequenzierungsprimern: Illumina Plattform </td><td> Verschiedene Anbieter </td></tr><tr><td> UpTag Sturm (100um) </td><td> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T GAT GTC CAC GAG GTC TCT 3&#39; </td></tr><tr><td> UpTag Reverse (100um) </td><td> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T NNNNN GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag Sturm (100um) </td><td> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T GAA AAC GAG CTC GAA TTC ATC G 3 &quot; </td></tr><tr><td> DownTag Reverse (100um) </td><td> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T NNNNN CGG TGT CGG TCT CGT AG 3 ` </td></tr><tr><td> Lesen Sie 1 UP-tag seq-Primer (100 um) </td><td> 5 &#39;GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Lesen Sie 1 AB-tag seq-Primer (100 um) </td><td> 5 &#39;CGG TGT CGG TCT CGT AG 3&#39; </td></tr><tr><td> Lesen Sie 2 Index-Sequenzierung Primer (Standard Illumina R1 Primer) (100 um) </td><td> 5 &#39;AC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T 3&#39; </td></tr><tr><td> Zusätzliche Sequencing Reagenzien / Equipment </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute 96 UF PCR Purification Kit </td><td> Qiagen, Teil # 29051 </td></tr><tr><td> Vakuumpumpe </td><td> Jeder Anbieter </td></tr><tr><td> Macherey-Nagel Vacuum Manifold </td><td> Macherey-Nagel, Teil # 740 681 </td></tr><tr><td> Invitrogen Quant-iT dsDNA BR Assay Kit </td><td> Invitrogen, Teil # Q32853 </td></tr><tr><td> Invitrogen Qubit Teströhrchen </td><td> Invitrogen, Teil # Q32856 </td></tr><tr><td> 40% Acrylamid plus 1% N, N&#39;-Methylen-bis-Acrylamid, 37,5:1 </td><td> Bio Rad, Teil # 161-0148 </td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Sigma, Teil # T1503-1KG </td></tr><tr><td> Borsäure </td><td> Sigma, Teil # B6768-500G </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA, pH 8,0 </td><td> Teknova, Teil # E0306 </td></tr><tr><td> Ammoniumpersulfat </td><td> Sigma, Teil # A3678-25G </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> BioShop, Teil # TEM001.25 </td></tr><tr><td> Ethidiumbromidlösung </td><td> BioShop, Teil # ETB444.10 </td></tr><tr><td> 0,5 M Ammoniumacetat </td><td> Teknova, Teil # A2000 </td></tr><tr><td> 10 mM Magnesium-Acetat-Tetrahydrat </td><td> Sigma, Teil # M0631-100G </td></tr><tr><td> 1mM EDTA, pH 8,0 </td><td> Siehe 0,5 M EDTA, pH 8,0 </td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> Natriumacetat, pH 5,2 </td><td> Teknova, Teil # S0297 </td></tr><tr><td> Speed-Vakuum </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> Single-Read Cluster-Generation Kit </td><td> Illumina, part # GD-300-1001 </td></tr><tr><td> 36c Sequencing Kit v4 </td><td>Illumina, part # FC-104-4002 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table> 10x TBE Rezept <table border="1"><tbody><tr><td> Beträge </td><td> Reagenzien </td></tr><tr><td> 108 Gramm </td><td> Tris Base </td></tr><tr><td> 55 Gramm </td><td> Borsäure </td></tr><tr><td> 40mL </td><td> 0,5 M EDTA (pH 8,0) </td></tr><tr><td colspan="2"> Add dH 2 O auf 1L markieren </td></tr></tbody></table> 12% Polyacrylamidgel Rezept <table border="1"><tbody><tr><td> Volumes </td><td> Reagenzien </td></tr><tr><td> 5,8 ml </td><td> 40% Acrylamid plus 1% N, N&#39;-Methylen-bis-Acrylamid, 37,5:1 </td></tr><tr><td> 12 ml </td><td> dH 2 O </td></tr><tr><td> 2 ml </td><td> 10x TBE </td></tr><tr><td> 140 ul </td><td> 10% Ammoniumpersulfat </td></tr><tr><td> Gesamtvolumen: 20 ml </td><td></td></tr></tbody></table> Uptag Primer-Mix: Resuspendieren Uptag und Buptagkanmx4 jeweils in ddH 2 O bei 100 nM, dann in einem Verhältnis von 1:1 mischen für eine Endkonzentration von 50 uM jeder. Lagerung bei -20 ° C. Downtag Primer-Mix: Resuspendieren Dntag und Bdntagkanmx4 jeweils in ddH 2 O bei 100 nM, dann in einem Verhältnis von 1:1 mischen für eine Endkonzentration von 50 uM jeder. Lagerung bei -20 ° C. Mixed-Oligonukleotide: Resuspendieren jedem der folgenden acht Oligos (Standard entsalzt) in ddH 2 O bei 100 uM: Uptag, Dntag, Uptagkanmx, Dntagkanmx, Uptagcomp, Dntagcomp, Upkancomp, Dnkancomp. Mix ein gleiches Volumen der acht Oligonukleotide für eine Endkonzentration von 12,5 uM jeder. 12X MES Lager: Für 10 ml, lösen sich 0,7 g MES free-Monohydrat und 1,93 g MES Natriumsalz in 8 ml Molekularbiologie Wasser. Nach dem Mischen gut, pH-Wert prüfen und einstellen, wenn bis zu einem pH von 6,5 bis 6,7 erforderlich. Fügen Sie Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 10 ml. Filter sterilisiert und bei 4 ° C vor Licht (zB Wickeln Sie das Rohr in Folie) geschützt. Ersetzen Sie, wenn Lösung wird sichtbar gelb oder nach 6 Monaten. 2X Hybridisierungspuffer: Für 50 ml, Mix 8,3 ml 12X MES Lager (ab 2.9.14), 17,7 ml 5 M NaCl, 4,0 ml 0,5 M EDTA, 0,1 ml 10% Tween 20 (vol / vol) und 19,9 ml gefiltert ddH 2 O. Filter sterilisieren. Wash A: 300 ml 20X SSPE, 1 mL 10% Tween (vol / vol), 699 ml ddH 2 O. Filter sterilisieren. Wash B: Mix 150 ml 20X SSPE, 1 mL 10% Tween (vol / vol), 849 ml ddH 2 O. Filter sterilisieren. Barcode Sequenzierungsprimern In UP-tag Primersequenzen die 5 &#39;tail (fett) sind Illumina Adapter-Sequenzen in der F-und R-Primer enthalten. Die variable Sequenz (kursiv) stellt die 5-mer Indizierung Tag in Multiplexen / index Auslesen verwendet. Die 3 &#39;tail (unterstrichen) vertritt die gemeinsamen Primer flankieren die uptag Barcode und wird benötigt, um die Hefe Barcodes zu verstärken. In AB-tag Primersequenzen der 5 &#39;Schwanz ist identisch mit 5&#39; Schwanz des UP-tag-Primer (Illumina bestimmten Reihenfolge), aber die 3 &#39;tail (unterstrichen) ist mit dem Gemeinsamen Primer, die verwendet werden, um die Verstärkung ersetzt DOWN- tag Barcodes.

competitive genomic screens von barcoded hefe bibliotheken

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

Durch Fortschritte in der Sequenzierung der nächsten Generation Technologien haben wir Zugang zu neuen Genom-Sequenzen fast täglich. Das Tempo dieser Fortschritte ist die Beschleunigung, vielversprechende größere Tiefe und Breite. In Anbetracht dieser außergewöhnlichen Fortschritte, wird die Notwendigkeit für eine schnelle, parallele Methoden zur Gen-Funktion zu definieren immer mehr an Bedeutung. Sammlungen von genomweiten Deletionsmutanten in Hefe und E. coli wurden als Arbeitstiere für die funktionelle Charakterisierung der Genfunktion serviert, aber dieser Ansatz ist nicht skalierbar, erfordern aktuelle Gen-Deletion Ansätze jeder der Tausenden von Genen, die ein Genom zu löschen und überprüft werden sollen, umfassen. Erst nachdem diese Arbeit abgeschlossen ist können wir verfolgen, High-Throughput-Phänotypisierung. In den vergangenen zehn Jahren hat unser Labor ein Portfolio von wettbewerbsfähigen, miniaturisierte, High-Throughput-genomweite Tests, die in parallel ausgeführt werden können, verfeinert. Diese Parallelisierung ist wegen der Aufnahme von DNA &#39;Tags&#39; oder &#39;Barcodes, &quot;in jeder Mutante möglich, mit dem Barcode dient als Proxy für die Mutation, und man kann den Barcode Fülle Maßnahme zur mutierten Fitness zu bewerten. In dieser Studie wollen wir die Lücke zwischen DNA-Sequenz und Barcode-Mutante Sammlungen zu füllen. Um dies zu erreichen führen wir eine kombinierte Störung Transposon-Barcoding Ansatz, der sich öffnet parallel Barcode-Assays neu sequenziert, aber schlecht charakterisiert Mikroben. Zur Veranschaulichung dieses Ansatzes präsentieren wir eine neue Candida albicans Barcode Störungen Sammlung und beschreiben, wie beide Microarray-basierte und Sequenzierung der nächsten Generation-Plattformen verwendet werden kann auf 10.000 zu sammeln - 1.000.000 Gen-Gen-und Drogen-Gen-Interaktionen in einem einzigen Experiment.

Wir verfügen über umfassende, unvoreingenommene genomweiten Screens entwickelt, um Gen-Medikament und Gen-Umwelt-Interaktionen zu verstehen. Methoden für das Screening dieser mutierten Sammlungen präsentiert werden.

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

Dank der Fortschritte bei den Next-Generation-Sequencing-Technologien haben wir fast täglich Zugang zu neuen Genomsequenzen. Das Tempo dieser Fortschritte ist ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, genomweite, mit Barcode versehene Mikroben-Sammlungen zu nutzen, um Gen-Wirkstoff- und Gen-Umwelt-Interaktionen auf hochparallelisierte Weise zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem die Mikroben-Sammlung über fünf bis 20 Wachstumsgenerationen hinweg in Gegenwart eines Wirkstoffs mittels Robotik im exponentiellen Wachstum gehalten und gescreent wird. In einem zweiten Schritt werden die Zellen gesammelt, was es uns ermöglicht, genomische DNA gleichzeitig aus 4.000 bis 6.000 Individuen zu extrahieren.Die anschließenden PCR-Produkte, die die amplifizierten Barcodes enthalten, werden entweder mittels Mikroarray-Hybridisierung oder Barcode-Sequenzierung quantifiziert, um die Barcodes zu zählen und somit die Häufigkeit jeder Stammes in einem komplexen Pool zu bestimmen. Letztendlich erhält man Ergebnisse, die zeigen, welche barcodierten Mutanten empfindlich gegenüber Behandlungen sind und daher im Verlauf des Experiments aus dem Pool verdrängt werden. Der Hauptvorteil der heute betrachteten Technik besteht darin, dass wir nicht einzelne Stämme separat als Kolonien auf Platten oder als individuelle Flüssigkulturen bearbeiten müssen, sondern zehntausende bis hunderttausende unterschiedliche Stämme zusammenfassen und als einen einzigen Pool analysieren können.Nachdem wir einmal die Leistungsfähigkeit dieses Assays erkannt hatten, mussten wir ihn automatisieren. Zum Glück arbeitete ich am Stanford Genome Technology Center und war von Ingenieuren umgeben, die es mir ermöglichten, dies zu erreichen. Den Protokollablauf wird heute Andrew Smith demonstrieren, ein leitender Doktorand in meinem Labor, der alle Schritte und zugehörigen Verfahren erläutern wird, sowie Tanya Durick, die uns zeigen wird, wie die Sequenzierungsaspekte des Protokolls durchgeführt werden. Dieses Protokoll verwendet eine Bibliothek von Candida albicans-Mutanten, die mittels Transposon-Mutagenese erzeugt wurden, wobei jede Mutante einen Barcode-Tag trägt, um einzelne Mutanten zu einem einzigen Pool zu kombinieren. Eine Kopie der Bibliothek wird auf 3 × 84 repliziert.Multiwellplatten, die Nährmedium enthalten, werden zwei bis drei Tage lang bei 30 Grad Celsius inkubiert, bis die Kolonien ihre maximale Größe erreicht haben. Anschließend überschwemmt man unter mikrobiologischen Bedingungen mit Flamme und sterilen Laborgeräten jede Platte mit fünf bis 10 Milliliter Medium und lässt sie fünf Minuten lang einweichen. Danach resuspendiert man die Kolonien mit einem Zellverteiler und gießt die Flüssigkeit zusammen mit den Zellen in ein kegelförmiges 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Fügen Sie DMSO auf eine Konzentration von 7 % hinzu. Stellen Sie die Zellen mit Medium, das 7 % DMSO enthält, auf eine endgültige OD600-Konzentration von 50 pro Milliliter ein und portionieren Sie dann 40-Mikroliter-Volumina in PCR-Streifenröhrchen. Die gepoolten Zellaliquote können unbegrenzt bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Um dieses Verfahren zu beginnen, tauen Sie die gepoolten Zellaliquote auf Eis auf und verdünnen Sie den Pool sofort vorsichtig in Medium mit einem gewünschten Wirkstoff oder unter gewünschten Bedingungen, wobei Sie mit einem OD600 von 0,0625 in einem Gesamtvolumen von 700 Mikrolitern pro Vertiefung in einer 48-Loch-Platte ansäen. Für dieses Video werden jeweils Triplicate von zwei Bedingungen vorbereitet.Schließen Sie mindestens eine geeignete Lösungsmittelkontrolle auf der Platte ein. Versiegeln Sie die Platte mit einer Kunststoff-Plattenfolie und inkubieren Sie die Zellen in einem Spektrophotometer oder einem temperaturgeregelten Schüttler bei 30 Grad Celsius mit einem experimentell bestimmten Schüttelprogramm. Beispiel: 14 Minuten schütteln, ein Minute lang die Wells auslesen, dann weiter schütteln.Ein Teil der Zellsuspension kann vom Roboter geerntet und auf einer Kohleplatte auf der Roboterplattform aufbewahrt werden. Zum benutzerdefinierten Zeitpunkt der Generationen, typischerweise nach 5, 10, 15 und 20 Generationen Wachstum, sollten mindestens zwei OD 600 der Zellen für jede Probe und jeden Zeitpunkt geerntet werden.Überführen Sie die geernteten Zellproben in Sicherheitsverschluss-Mikrozentrifugenröhrchen. Diese Zellen können anschließend für die genomische DNA-Extraktion verwendet werden, die im Folgenden zur Einleitung dieses Verfahrens gezeigt wird. Reine genomische DNA aus Zellen, die zu verschiedenen Zeitpunkten mit einem Hefe-Starkit gewonnen wurden.Laut Herstelleranweisungen, mit einer Modifikation, die DNA mit 300 Mikrolitern 0,1 XTE eluieren. Bereiten Sie anschließend zwei PCR-Ansätze für jede Probe vor: einen für die UPT-Tags und einen für die Down-Tags.Überprüfen Sie die resultierenden PCR-Produkte auf einem Gel. Ein 60 Basenpaare langes Produkt für beide PCR-Ansätze wird für Amplifikate erwartet, die zur Hybridisierung verwendet werden, wie in den Kanälen eins und drei gezeigt. In diesem Beispiel wird ein 130 Basenpaare langes Produkt für Amplifikate zur Barcode-Sequenzierung erwartet, wie in den Kanälen fünf und sieben gezeigt.An diesem Punkt können die PCR-Produkte je nach erzeugtem PCR-Produkt entweder für die Microarray-Analyse oder die direkte Barcode-Sequenzierung verwendet werden. Zum Vorbereiten der Microarray-Analyse erwärmen Sie den Hybridisierungsofen auf 42 Grad Celsius und richten Sie ein siedendes Wasserbad sowie einen Eimer mit einer Eis-Wasser-Schlämme ein. Befeuchten Sie die Arrays, indem Sie sie langsam mit 120 Mikrolitern eines 1x-Hybridisierungs.Puffers füllen.Inkubieren Sie die Arrays 10 Minuten lang im Hybridisierungspuffer bei 42 Grad Celsius und 20 U/min. Während die Arrays inkubieren, bereiten Sie verschließbare 0,5-Milliliter-Röhrchen mit jeweils 120 Mikrolitern Hybridisierungspuffer pro Probe plus einem zusätzlichen Röhrchen als Puffer vor. Geben Sie 30 Mikroliter Uptake-PCR und 30 Mikroliter Down-Tag-PCR zur Hybridisierungsmischung hinzu, sodass sich ein Gesamtvolumen von 150 Mikrolitern ergibt.Zwei Minuten lang kochen und anschließend mindestens zwei Minuten in Eiswasser abkühlen. Die Röhrchen vor der Verwendung kurz zentrifugieren. Den Prähybridisierungspuffer von den Arrays entfernen und 120 Mikroliter Hybridisierungs-PCR-Mix hinzufügen, um Verdunstung zu verhindern.Bedecken Sie die Array-Dichtungen mit einem robusten Fleck, hybridisieren Sie 16 Stunden bei 42 Grad Celsius und 20 U/min. Entfernen Sie die Arrays aus dem Hybridisierungsofen und nehmen Sie die robusten Flecken von den Chips. Entfernen Sie langsam die Hybridisierungslösung von den Arrays mittels Pipette und füllen Sie die Arrays. Mit 120 Mikrolitern Waschpuffer die Arrays in die Waschstation der vorbereiteten Fluidikstation laden. Die Arrays werden mit dem GenFlex SV 3 4 50-Protokoll unter folgenden Modifikationen gewaschen: ein zusätzlicher Schritt mit Waschpuffer A vor der Färbung.Waschen Sie B bei einer Temperatur von 42 Grad Celsius anstelle von 40 Grad Celsius und färben Sie bei 42 Grad Celsius an der Fluidikstation anstelle von 25 Grad Celsius. Führen Sie nach den Fluidikoperationen die Fluidikstation aus und beenden Sie das Vier-50-Protokoll. Entladen Sie die Waschanlage, nachdem sichergestellt wurde, dass keine Luftblasen vorhanden sind.Platzieren Sie die Arrays im Scanner und scannen Sie bei einer Emissionswellenlänge von 560 Nanometern. Das 130 Basenpaar lange PCR-Produkt wird für die Barcode-Sequenzierung der nächsten Generation verwendet, um diese erste separate 12-Pool-DNA-Probe auf einem 12%-PAGE-Gel aufzutrennen. Färben Sie anschließend das Gel mit Cyber Green und schneiden Sie das gewünschte DNA-Band aus dem Gel aus.Die aus dem Gel extrahierte DNA wird anschließend mittels Echtzeit-PCR quantifiziert, um Cluster auf einer Einzellese-Flowcell mithilfe des CBOT und des Einzellese-Cluster-Generierungskits zu erzeugen. Laden Sie die Flowcell in den Sequenzierer ein und beobachten Sie die Freisetzung der ersten Base. Der hier gezeigte Sequenzierer ist ein repräsentatives Beispiel. Daten, die zu bestimmten Zeitpunkten des Protokolls gesammelt wurden.Der Pool markierter Mutanten wurde 20 Generationen lang in Gegenwart des antimykotischen Wirkstoffs Clotrimazol und als Kontrolle in DMSO kultiviert; für jedes Gen wurde das Log-Zwei-Verhältnis berechnet und dargestellt. Alle Stämme, die signifikant empfindlich auf die Behandlung mit Clotrimazol reagieren und ein Log-Zwei-Verhältnis von zwei aufweisen, sind rot hervorgehoben. In diesem Beispiel sind vier Stämme dargestellt: NCP eins, ERG zwei und zwei unabhängige Allele von ERG 11.Der bekannte Proteintarget des antimykotischen Wirkstoffs Clotrimazol sollte bei Stämmen, die in einem gepoolten Screen als empfindlich detektiert wurden, hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit in individuellen Wachstumsassays in Gegenwart derselben Wirkstoffkonzentration überprüft werden. Dieses nächste Diagramm zeigt hier die Ergebnisse eines Bestätigungsversuchs. Die vier im Screen detektierten Stämme wiesen ein vermindertes Wachstum im Vergleich zum Wildtyp-Ausgangsstamm auf.BWP 17 in Schwarz gekennzeichnet. Diese individuellen Wachstumskurven verdeutlichen ein wichtiges Merkmal solcher gepoolter Gen-Wirkstoff-Screens, nämlich dass der absolute Rang einer bestimmten Stammvariante nicht notwendigerweise ihr genaues Empfindlichkeitsniveau widerspiegelt. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse den Vorteil auf, mehrere Allele für jedes Gen zur Verfügung zu haben.In diesem Fall weisen die beiden ERG-11-Destruktionsmutanten leicht unterschiedliche Empfindlichkeiten gegenüber dem Wirkstoff auf. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie in fünf Tagen durchgeführt werden – von der Inokulation des Screens bis hin zur Analyse der Daten –, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Daher ist jedes einzelne Experiment zwar biologisch aussagekräftig, doch die eigentliche Aussagekraft ergibt sich erst, wenn viele Experimente durchgeführt und eine Datenbank gesammelt wurden, anhand derer nun Vorhersagen zur Genfunktion und Wirkstoffwirkung möglich sind.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man genomweite, mit Barcodes versehene Mutantensammlungen für die Pool-Screening-Analyse vorbereitet, und wie man anschließend Microray- oder Sequenziermethoden einsetzt, um Gene von Interesse zu identifizieren. Mithilfe dieser Technik konnten Forscher im Bereich der funktionellen Genomik die Funktion jedes der 6.000 verschiedenen Gene im Hefegenom untersuchen.

competitive-genomic-screens-of-barcoded-yeast-libraries

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir ein Plasmid Überexpression Bildschirm...

High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm

Quantitative Analyse Fitness (QFA) ist eine ergänzende Reihe von experimentellen und rechnerischen Methoden zur Schätzung der mikrobiellen Kultur Fitnesswerte. QFA schätzt den Effekt genetischer Mutationen, Medikamente oder andere Behandlungen angewandt auf Mikrobenwachstum. Experimente Skalierung von fokussierten Analyse der einzelnen Kulturen zu Tausenden von parallelen Kulturen ausgelegt werden kann.

A Quantitative Analysis Fitness-Workflow

Barcode Aktiviert Sequenzierung Tetrads (BEST) ersetzt die manuellen Prozesse zu isolieren, zu stören und Abstand Tetraden. BESTE isoliert Tetraden durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung auf Agarplatten, trennt die Sporen durch Schütteln mit Glasperlen, und bestimmt, welche zufällig angeordnet Kolonien wurden aus der gleichen ursprünglichen Tetrade mit Molekular Barcodes abgeleitet.

BEST: Barcode Aktiviert Sequenzierung Tetrads

Hier stellen wir eine kostengünstige Methode zur Definition chemisch-genetischer Interaktionen in knospenden Hefen vor. Der Ansatz baut auf grundlegenden Techniken der Hefemolekularbiologie auf und eignet sich gut für die mechanistische Abfrage kleiner bis mittlerer Ansammlungen von Chemikalien und anderen Medienumgebungen.

Schnelle Identifikation von chemischen Genetische Interaktionen in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll zur Konstruktion und zum Screening von Mutantenbibliotheken für gerichtete Evolutionskampagnen in Saccharomyces cerevisiae.

Entwicklung Methode Regie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliothek Schöpfung und Screening

Dieses Protokoll beschreibt eine Hochdurchsatz-Methodik, funktionell für die Protein-basierten Vererbung in S. CerevisiaeBildschirm.

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Tiefe Sequenzierung der Hefe Bevölkerung ausgewählt für positive Hefe 2-Hybrid Interaktionen potenziell liefert eine Fülle von Informationen über interagierenden Partner Proteine. Hier beschreiben wir den Betrieb von bestimmten Bioinformatik und aktualisierte Individualsoftware Sequenzdaten von solchen Bildschirmen zu analysieren.

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Dieser Artikel stellt eine Paarung basierende Methode zur Überexpression Screening in der angehenden Hefe mit einer angeordneten Plasmid-Bibliothek zu erleichtern.

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Wir präsentieren eine einfache Suppressor Bildschirm Protokoll in Kernspaltung Hefe. Diese Methode ist effizient, Mutagen-frei und selektiv für Mutationen, die oft auf einen einzigen genomischen Locus auftreten.  Das Protokoll ist geeignet für die Isolierung von Unterdrücker, die Wachstumsstörungen in Flüssigkultur lindern, die durch eine Mutation oder ein Medikament verursacht werden.

Ein Deep-Sequenzierung-gestützte, spontane Suppressor-Bildschirm in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für einen Multicopy-Suppressor-Gen-Screen in Schizosaccharomyces pombe. Dieser Bildschirm verwendet eine genomweite Plasmidbibliothek, um Suppressorklone eines Funktionsverlust-Phänotyps zu identifizieren, der mit einem Abfragemutantenstamm assoziiert ist. Neuartige genetische Suppressoren der ell1-Nullmutante wurden mit diesem Screen identifiziert.

Genetischer Screen zur Identifizierung von Multicopy-Suppressoren in Schizosaccharomyces pombe

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Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

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