Single Drosophila Ommatidium Dissection und Imaging
19. August 2011
Der limitierende Faktor in der Verwendung der Erwachsenen Drosophila Blick auf Neurodegeneration und Zellbiologie Studie ist die schwierige Darstellung von intrazellulären Prozessen. Wir beschreiben die Zerlegung der einzelnen Ommatidien zu einer bona-fide primären neuronalen Zellkulturen, die Gegenstand der medikamentösen Behandlung und fortschrittliche Bildgebung erzeugen können.
Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einzelne Drosophila- oder Matia-Exemplare zu präparieren und abzubilden, um intrazelluläre Vorgänge in Modellen der Neurodegeneration zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst der Fliegenkopf vom restlichen Körper abgetrennt und anschließend aufgeschnitten wird.
Anschließend werden das Gehirn und andere Gewebe aus dem Kopf entfernt. Danach wird die Cuticula entfernt und jede Retina der Länge nach halbiert. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, das O mit einer Wolframnadel herauszuschneiden und auf einen Objektträger zu übertragen.
Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die zytoplasmatische autofagische Organellen mittels fluoreszenzkonfokaler Mikroskopie zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine hochauflösende zellbiologische Analyse in Drosophila-Modellen der Neurodegeneration ermöglicht, die bislang lediglich genetische Einblicke in diesem Bereich bieten konnten, wodurch deutlich wird, dass der Ablauf variabel sein wird. Ein Doktorand aus meinem Labor mit Unterstützung von Daniel Mackay, einem Histologie- und Mikroskopietechniker des Zentrums.
Füllen Sie zunächst eine Vertiefung einer Dreier-Glasobjektträger mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung und betäuben Sie die Fliegen mit Kohlendioxid. Sobald die Fliegen betäubt sind, nehmen Sie mithilfe einer Pinzette eine einzelne Fliege auf und geben Sie sie in die kleine Schale mit PBS. Unter einem Stereomikroskop klemmen Sie den Rüssel mit der Pinzette fest und trennen dann den Kopf durch Durchtrennen des Halses vom Körper ab.
Unter Verwendung eines zweiten Paars Pinzetten, die den Fliegenkopf am Proboscis halten, den Kopf mit einer Mikroschere entlang der lateralen rostralen Mittellinie halbieren. Um das Gehirn freizulegen, eine abgeschnittene Pipettenspitze verwenden, um den Kopf mit angehängter Retina aufzuheben und in eine andere Vertiefung, die mit Schneider-Medium gefüllt ist, zu überführen. Mithilfe der Pinzette den Großteil der Kopfkutikula ablösen und anschließend das Gehirn entfernen.
Halten Sie die Netzhaut zwischen der Lamina und der Hornhaut eingeschlossen. Überführen Sie anschließend die Netzhaut in einen Tropfen frisches Schneider-Medium mit einem Volumen von 50 Mikrolitern. Legen Sie den Tropfen direkt auf einen Objektträger und greifen Sie mit einer Pinzette unter Verwendung von Mikroscheren entweder das dorsalste oder ventralste Ende der Netzhaut an.
Schneiden Sie die Netzhaut entlang der dorsoventralen Mittellinie in zwei Hälften, um die AMIA in der Mitte des Auges freizulegen. Halten Sie die Netzhaut weiterhin so fest, dass die Hornhaut nach unten und die Lamina nach oben zeigt. Lösen Sie mithilfe einer feinen Wolframnadel zuerst die oia von der Lamina und anschließend von der Hornhaut.
Einzelne OIA und Gruppen von OIA sammeln sich am Boden der Vertiefung oder des Objektträgers an. Entfernen Sie eventuell angesammelte größere Luftblasen, bevor Sie fortfahren. Zum Analysieren der Autophagie verdünnen Sie Lito-Tracer im Verhältnis 1:1000 in einem Tropfen Schneider-Medium, mischen Sie und warten Sie 10 Sekunden.
Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit vom Objektträger, wobei darauf geachtet werden sollte, das AMIA zurückzulassen. Geben Sie einen Tropfen Vector Shield hinzu, um das AMIA zu bedecken.
Unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie kann nach Anbringen eines Deckglases und Versiegelung mit Nagellack in einem aus einer Fliege, die eine mutierte Form von Atropin exprimiert, isolierten Tedium sowohl das mit gfp-aTG8 markierte Phagosome als auch die durch LysoTracker markierten Lysosomen sichtbar gemacht werden. Das Hellfeldbild in der oberen rechten Ecke zeigt die nahezu intakte Struktur des Tediums, und der Rahmen kennzeichnet den abgebildeten Bereich. Hier markiert Rot die Lysosomen und Grün das Autophagosom.
Die Auto-Lysosomen, die durch die Fusion der beiden Organellen entstehen, erscheinen gelb. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Kultivierung von Material und die Verabreichung von Wirkstoffen durchgeführt werden, um unterschiedliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise die Wirkung von Substanzen auf Autophagie-Marker in neuronalen Zellen mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund.
Kombination der Vorteile der Drosophila-Genetik mit fortgeschrittenen zellbiologischen Analysen, die in der Zellkultur möglich sind.
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Übersicht
In diesem Artikel wird ein Verfahren zur Dissektion und Abbildung einzelner Drosophila-Ommatidien beschrieben, um intrazelluläre Vorgänge in Modellen der Neurodegeneration zu untersuchen. Die Methode ermöglicht die Erzeugung primärer neuronaler Zellkulturen, die pharmakologischen Behandlungen sowie fortschrittlichen bildgebenden Verfahren unterzogen werden können.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Neurodegeneration
Hintergrund
- Die Abbildung intrazellulärer Prozesse in erwachsenen Drosophila ist herausfordernd.
- Die Isolierung einzelner Ommatidien bietet eine Lösung zur Untersuchung zellulärer Mechanismen.
- Primäre neuronale Kulturen ermöglichen die Behandlung mit Wirkstoffen und die Anwendung fortgeschrittener Bildgebung.
- Dieser Ansatz verbessert das Verständnis von Neurodegeneration.
Zweck der Studie
- Dissektion von Drosophila-Ommatidien zur zellulären Analyse.
- Vereinfachung der Abbildung intrazellulärer Vorgänge.
- Schaffung einer Plattform für Studien zur Wirkstoffbehandlung.
Verwendete Methoden
- Befestigen Sie den Fliegenkopf und schneiden Sie ihn auf.
- Entfernen Sie das Gehirn und anderes inneres Gewebe.
- Schneiden Sie die Retina nach Entfernung der Cuticula in zwei Hälften.
- Lösen Sie die Ommatidien mit einer Wolframetznadel heraus und geben Sie sie auf einen Objektträger.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Dissektion einzelner Ommatidien.
- Erstellung echter primärer neuronaler Zellkulturen.
- Möglichkeit, pharmakologische Behandlungen an kultivierten Zellen durchzuführen.
- Anwendung fortschrittlicher Bildgebungstechniken zur Untersuchung intrazellulärer Prozesse.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bietet ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Neurodegeneration.
- Die Dissektion einzelner Ommatidien verbessert die zelluläre Bildgebung.
- Dieser Ansatz kann zu neuen Erkenntnissen in der Neurobiologie führen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Isolierung und Bildgebung einzelner Ommatidien bei Drosophila ermöglicht eine hochauflösende Analyse intrazellulärer Vorgänge, die für die Neurodegeneration relevant sind, und überwindet dabei die Einschränkungen der Autofluoreszenz des gesamten Auges. Diese Technik unterstützt die mechanistische Risikominderung und Zielvalidierung in der frühen Entdeckungsphase, indem sie eine direkte Visualisierung von autophagischen Prozessen und Arzneimittelantworten in genetisch definierten neuronalen Zellen erlaubt. Aufgrund ihrer Eignung für Live-Bildgebung und die Applikation von Substanzen stellt sie eine wiederverwendbare Plattform für Forschungspipelines zur Neurodegeneration dar.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Untersuchung der Autophagie und des intrazellulären Transports in für die Krankheit relevante neuronale Zellen.
- Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung, indem subzelluläre Reaktionen auf genetische oder pharmakologische Störungen sichtbar gemacht werden.
- Erleichtert die mechanistische Ent-Risikobewertung, indem zellautonome Effekte in mosaikartigen genetischen Hintergründen unterschieden werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein validiertes ex vivo-System für die quantitative Bildgebung von autophagischen und lysosomalen Markern.
- Ermöglicht die reproduzierbare Herstellung von Einzelzellproben für standardisierte Wirkstofftests.
- Unterstützt die Skalierbarkeit von Assays und die Wiederverwendung der Plattform zur Untersuchung von Substanzen, die die Neurodegeneration beeinflussen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Abstimmung auf krankheitsrelevante Signalwege, indem eine Dysfunktion der Autophagie in einem genetisch zugänglichen System modelliert wird.
- Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der genetischen Entdeckung zur präklinischen Evaluierung von Substanzen in neuronalen Zellen.
- Unterstützt eine risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem vorhersagende zelluläre Endpunkte für Zielstrukturen der Neurodegeneration bereitgestellt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode schließt die Lücke zwischen der frühen Entdeckung und der präklinischen Forschung, indem sie eine hypothesengeleitete Untersuchung intrazellulärer Mechanismen und Wirkstoffeffekte in einem genetisch definierten neuronalen Kontext ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Autophagie- und Neurodegenerationswegen in einzelnen Ommatidien.
- Screening: Liefert quantitative, reproduzierbare bildgebende Ergebnisse zur Wirkstoffbewertung.
- Analytik: Bietet konfokale mikroskopische Messungen von Autophagosomen, Lysosomen und deren Fusionsprodukten.
- Translationale Forschung: Ermöglicht die Abstimmung zellulärer Phänotypen mit Krankheitsmodellen und die Entwicklung von Biomarkern.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine modulare Plattform, die an unterschiedliche genetische Hintergründe und Wirkstoffbibliotheken angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vorhersagevertrauen bei der Zielvalidierung und mechanistischen Studien zur Neurodegeneration.
- Operationaler Wert: Standardisiert Einzelzell-Dissektions- und Bildgebungsabläufe hinsichtlich Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem direkte zelluläre Nachweise der Zielinteraktion und Wirkstoffwirksamkeit bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Neurodegenerationszielen und therapeutischen Kandidaten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Drosophila Dissektions- und konfokale Abbildungstechniken.
- Erfordert Zugang zu Fluoreszenzmikroskopie und Zellkultur-Infrastruktur.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg für die Probenvorbereitung und die Bildgebung.
- Anpassbar an verschiedene genetische Hintergründe unter Verwendung von Mosaikanalyse-Techniken.
- Auf ex vivo-Analysen beschränkt; eine in vivo-Validierung könnte für eine translationale Kontinuität erforderlich sein.
