Name: Single Drosophila Ommatidium Dissection und Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Lernen Sie die Präparation einzelner Drosophila-Ommatidien für die Bildgebung intrazellulärer Prozesse in Modellen der Neurodegeneration. Diese Methode ermöglicht hochauflösende zellbiologische Analysen und die Erstellung primärer neuronaler Kulturen für Arzneimittelstudien.

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Wir danken Bernard Charroux für Diskussionen. Diese Arbeit wurde von der KCL Biomedical Schule finanziert.

1. Dissektion der Drosophila Netzhaut <ol><li> Füllen Sie eine Vertiefung einer 3-Well Objektträger mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS 1X) und dann zu betäuben fliegt von CO 2. Sowohl Männchen als auch Weibchen können für dieses Experiment verwendet werden. </li><li> Sobald die Fliegen betäubt sind, nehmen Sie eine Fliege mit einer Pinzette und legen Sie es in das Schälchen PBS. </li><li> Unter einem Binokular, kneifen den Rüssel mit einer Pinzette, und dann nehmen Sie den Kopf vom Körper durch Abtrennen der Hals mit einem zweiten Satz von Zangen. </li><li> Halten Sie die Fliege Kopf aus dem Rüssel, geschnitten längs der linken / rechten Mittellinie the fly Kopf mit Mikroschere an das Gehirn offenbaren. </li><li> Verwenden Sie einen Schnitt Pipettenspitze abholen der Netzhaut und die Übertragung auf eine zweite und der 3-Well Objektträger aus Glas mit Schneider Medium gefüllt ist. </li><li> Zunächst abziehen meisten der Kopf Nagelhaut und entfernen Sie dann das Gehirn mit einer Pinzette. Halten Sie die Netzhaut zwischen der Lamina und der Hornhaut eingeklemmt. </li><li> Anschließend Transfer der Netzhaut auf einen Tropfen (50 ul) von frischen Schnieder Medium direkt von der Glasplatte gelegt. </li></ol> 2. Dissection der Ommatidien <ol><li> Abhängig vom endgültigen Ziel der Dissektion (ob sofort ein Bildbearbeitungs-oder Kultur) und auf die Optik des Fluoreszenz-Mikroskops (direkt oder umgekehrt), kann dieser Schritt erfolgt entweder auf einen Objektträger oder in eine 24-Well-Platte. Für die endgültige Zweck dieser Sektion wird der Ommatidien direkt auf das Glas gleiten seziert werden. </li><li> Fassen Sie entweder die dorsalen oder ventralen Ende der Netzhaut mit einer Pinzette. Mit Mikroschere, schneiden die Netzhaut in zwei Hälften entlang der dorsalen / ventralen Mittellinie der Ommatidien in der Mitte des Auges aussetzen. </li><li> Weiter auf die Netzhaut, so dass die Hornhaut nach unten und in der Lamina nach oben zu erfassen. Mit einem feinen Wolfram-Nadel, nehmen Sie den Facettenaugen von der Lamina und der Hornhaut. </li><li> Einzel Facettenaugen und Gruppen von Ommatidien wird auf dem Grund des Brunnens oder schieben zu sammeln. Entfernen Sie alle Fremdkörper, die größer, bevor Sie fortfahren gesammelt haben. </li></ol> 3. Die Behandlung, Färbung und Imaging <ol><li> Zur Analyse Autophagie, verdünnte 1:1000 LysoTracker in der Schneider &amp; Drop (erste Verdünnung 1:10 in Schneider und fügen Sie dann 0,5 ul der Tropfen auf dem Objektträger), mischen und 10 Sekunden warten. </li><li> Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit aus der Folie, wobei darauf geachtet, die Facettenaugen hinter sich zu lassen. Dies geschieht am besten mit einer feinen Spitze für Gel durchgeführt. </li><li> Fügen Sie einen Tropfen Vectashield die Facettenaugen decken, Deckglas auflegen und Dichtung mit Nagellack. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Die gute Ausführung des Protokolls sollten verlassen eine Reihe von einzelnen Ommatidien und kleine Gruppen von Einzelaugen zusammen gehalten durch Fragmente von Lamina aber schön auf der Hornhaut Seite getrennt. Diese können wie in diesem Beispiel dargestellt werden, um ATG8 visualisieren: GFP und LysoTracker, zeigt Autophagosomen, Lysosomen und autophagolysosomes (Abb. 3). Die Methode für die Live-Bildgebung verwendet werden kann, aber in diesem Fall ist zu beachten, dass Autofluoreszenz der Schneider-Medium wird es schwierig machen, mit niedriger Intensität fluoreszierender Signale zu unterscheiden. Ein weiteres Problem ist, dass die Pigmentkörnchen, die die Photorezeptoren verbunden bleiben intensiv fluoreszierende, vor allem in den roten Kanal sind. Ein Hellfeld Bild erforderlich, um sie von echten Organellen unterscheiden. <img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Flussdiagramm der Dissektion Verfahren auf einzelne Ommatidien oder kleine Gruppen von Facettenaugen von der Fliege Netzhaut zu erhalten. <img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Mögliche Variationen des einfachen Protokolls hier zu beschreiben, dass einbeziehen fliegen Genetik und Altern vor der Dissektion und Färbung oder Kultivierung für bis zu 24 Stunden and Drug Administration nach dem Sezieren. <img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3 konfokale Scan Autophagosomen und Lysosomen in einem Ommatidium von aw seziert; GMR-Gal4, UAS-Atro75QN; UAS-GFP:.: ATG8 / + fliegen, Ausdruck einer Polyglutamin Atrophin Mutante und im Alter von 12 Tagen bei 29 ° C. Die Hellfeld-Panel (oben rechts) zeigt die nahezu intakte Struktur des Ommatidium und der Rahmen zeigt das gescannte Gebiet. Rote Markierungen Lysosomen, grün die Autophagosomen, Auto-Lysosomen, was durch die Fusion der beiden Organellen, gelb erscheinen. Die Pfeilspitzen zeigen zwei laufende Fusion Ereignisse zwischen Autophagosomen und Lysosomen.

<ol><li>Marsh, J. L., Thompson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+in+the+study+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila in the study of neurodegenerative disease.</a> Neuron. 52, 169-178 (2006).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li>
<li>Nisoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+by+polyglutamine+Atrophin+is+not+rescued+by+induction+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration by polyglutamine Atrophin is not rescued by induction of autophagy.</a> Cell Death Differ. 17, 1577-1587 (2010).</li>
<li>Charroux, B., Fanto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+line+between+waste+disposal+and+recycling%3A+DRPLA+fly+models+illustrate+the+importance+of+completing+the+autophagy+cycle+for+rescuing+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The fine line between waste disposal and recycling: DRPLA fly models illustrate the importance of completing the autophagy cycle for rescuing neurodegeneration.</a> Autophagy. 6, 667-669 (2010).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+potassium+channels+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive potassium channels in Drosophila photoreceptors.</a> J Neurosci. 11, 3079-3095 (1991).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in neurosciences. 24, 251-254 (2001).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li>
<li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Dev Biol. 351, 128-1234 (2011).</li>
<li>Napoletano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+Atrophin+provokes+neurodegeneration+in+Drosophila+by+repressing+fat%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine Atrophin provokes neurodegeneration in Drosophila by repressing fat.</a> The EMBO journal. 30, 945-958 (2011).</li>
<li>Ravikumar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mTOR+induces+autophagy+and+reduces+toxicity+of+polyglutamine+expansions+in+fly+and+mouse+models+of+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease.</a> Nature. 36, 585-595 (2004).</li>
<li>Zou, S., Meadows, S., Sharp, L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+study+of+aging+and+oxidative+stress+response+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome-wide study of aging and oxidative stress response in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13726-13731 (2000).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die einzelnen Ommatidium Dissektion hier vorgestellten ermöglicht das Speichern von tiefer zellbiologische Informationen über Prozesse wie Neurodegeneration, wenn in der Drosophila Auge nachempfunden. Der Photorezeptor Neuronen sind leichter zugänglich als andere Neuronen und sie Zytoplasma ist besonders groß, und damit geeignet, um Vesikel Dynamik Studie, in der selben Zellen kompetent in vielen Modellen verwendet werden, um Neurodegeneration in vivo zu quantifizieren. Der kritische Aspekt der Dissekt...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Tragbare CO2 Dispenser </td><td> Flystuff </td><td> 59-150 </td><td> Refills auch </td></tr><tr><td> DUMONT Pinzette Nr. 5 </td><td> AGAR Scientific </td><td> T5034 </td><td></td></tr><tr><td> 3-Well Glas Slide </td><td> EMS </td><td> 71561-01 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Schere </td><td> VWR </td><td> HAMMHSB516-09 </td><td></td></tr><tr><td> Schneider-Medium </td><td> VWR </td><td> 733-1663 </td><td></td></tr><tr><td> LysoTracker Red DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L7528 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost Slides </td><td> VWR </td><td> 631-0108 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield mit Dapi </td><td> Vector Labs </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> VWR </td><td> 631-1336 </td><td></td></tr></tbody></table>

single drosophila ommatidium dissection und imaging

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster hat unschätzbare Beiträge zur neurowissenschaftlichen Forschung gemacht und wurde weithin als Modell für neurodegenerative Erkrankungen wegen seiner leistungsfähigen Genetik 1 verwendet. Die Fliege Auge in allem hat das Organ der Wahl für Neurodegeneration Forschung, wobei der am besten zugänglichen und Leben entbehrlich Teil der Drosophila Nervensystem. Doch die große Einschränkung der intakten Augen ist die Schwierigkeit, wegen der intensiven Autofluoreszenz des Pigments, in der Bildgebung intrazelluläre Ereignisse wie Autophagie Dynamik 2, die ausschlaggebend für das Verständnis der Neurodegeneration sind. Wir haben vor kurzem die Präparation und Kultur der einzelnen Ommatidien 3, die wichtig ist für unser Verständnis von autophagischen Dysfunktionen in einer Fliege Modell Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophie (DRPLA) 3, 4 verwendet. Wir berichten nun über eine umfassende Beschreibung dieser Technik (Abb. 1), von elektrophysiologischen Studien 5, die voraussichtlich erheblich erweitern die Möglichkeit des Fly-Modelle für Neurodegeneration angepasst ist. Diese Methode lässt sich an Bild zu leben subzelluläre Ereignisse und wirksames Medikament Verwaltung auf Sehzellen Monitor (Abb. 2). Wenn in Kombination mit Mosaik-Techniken 8.6 verwendet, können die Reaktionen von genetisch unterschiedlichen Zellen parallel getestet werden (Abb. 2).

Der limitierende Faktor in der Verwendung der Erwachsenen<em&gt; Drosophila</em&gt; Blick auf Neurodegeneration und Zellbiologie Studie ist die schwierige Darstellung von intrazellulären Prozessen. Wir beschreiben die Zerlegung der einzelnen Ommatidien zu einer bona-fide primären neuronalen Zellkulturen, die Gegenstand der medikamentösen Behandlung und fortschrittliche Bildgebung erzeugen können.

Single Drosophila Ommatidium Dissection und Imaging

Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster hat unschätzbare Beiträge zur neurowissenschaftlichen Forschung geleistet und wurde weitreichend als Modell für neurodegenerative ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einzelne Drosophila- oder Matia-Exemplare zu präparieren und abzubilden, um intrazelluläre Vorgänge in Modellen der Neurodegeneration zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst der Fliegenkopf vom restlichen Körper abgetrennt und anschließend aufgeschnitten wird.Anschließend werden das Gehirn und andere Gewebe aus dem Kopf entfernt. Danach wird die Cuticula entfernt und jede Retina der Länge nach halbiert. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, das O mit einer Wolframnadel herauszuschneiden und auf einen Objektträger zu übertragen.Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die zytoplasmatische autofagische Organellen mittels fluoreszenzkonfokaler Mikroskopie zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine hochauflösende zellbiologische Analyse in Drosophila-Modellen der Neurodegeneration ermöglicht, die bislang lediglich genetische Einblicke in diesem Bereich bieten konnten, wodurch deutlich wird, dass der Ablauf variabel sein wird. Ein Doktorand aus meinem Labor mit Unterstützung von Daniel Mackay, einem Histologie- und Mikroskopietechniker des Zentrums.Füllen Sie zunächst eine Vertiefung einer Dreier-Glasobjektträger mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung und betäuben Sie die Fliegen mit Kohlendioxid. Sobald die Fliegen betäubt sind, nehmen Sie mithilfe einer Pinzette eine einzelne Fliege auf und geben Sie sie in die kleine Schale mit PBS. Unter einem Stereomikroskop klemmen Sie den Rüssel mit der Pinzette fest und trennen dann den Kopf durch Durchtrennen des Halses vom Körper ab.Unter Verwendung eines zweiten Paars Pinzetten, die den Fliegenkopf am Proboscis halten, den Kopf mit einer Mikroschere entlang der lateralen rostralen Mittellinie halbieren. Um das Gehirn freizulegen, eine abgeschnittene Pipettenspitze verwenden, um den Kopf mit angehängter Retina aufzuheben und in eine andere Vertiefung, die mit Schneider-Medium gefüllt ist, zu überführen. Mithilfe der Pinzette den Großteil der Kopfkutikula ablösen und anschließend das Gehirn entfernen.Halten Sie die Netzhaut zwischen der Lamina und der Hornhaut eingeschlossen. Überführen Sie anschließend die Netzhaut in einen Tropfen frisches Schneider-Medium mit einem Volumen von 50 Mikrolitern. Legen Sie den Tropfen direkt auf einen Objektträger und greifen Sie mit einer Pinzette unter Verwendung von Mikroscheren entweder das dorsalste oder ventralste Ende der Netzhaut an.Schneiden Sie die Netzhaut entlang der dorsoventralen Mittellinie in zwei Hälften, um die AMIA in der Mitte des Auges freizulegen. Halten Sie die Netzhaut weiterhin so fest, dass die Hornhaut nach unten und die Lamina nach oben zeigt. Lösen Sie mithilfe einer feinen Wolframnadel zuerst die oia von der Lamina und anschließend von der Hornhaut.Einzelne OIA und Gruppen von OIA sammeln sich am Boden der Vertiefung oder des Objektträgers an. Entfernen Sie eventuell angesammelte größere Luftblasen, bevor Sie fortfahren. Zum Analysieren der Autophagie verdünnen Sie Lito-Tracer im Verhältnis 1:1000 in einem Tropfen Schneider-Medium, mischen Sie und warten Sie 10 Sekunden.Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit vom Objektträger, wobei darauf geachtet werden sollte, das AMIA zurückzulassen. Geben Sie einen Tropfen Vector Shield hinzu, um das AMIA zu bedecken.Unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie kann nach Anbringen eines Deckglases und Versiegelung mit Nagellack in einem aus einer Fliege, die eine mutierte Form von Atropin exprimiert, isolierten Tedium sowohl das mit gfp-aTG8 markierte Phagosome als auch die durch LysoTracker markierten Lysosomen sichtbar gemacht werden. Das Hellfeldbild in der oberen rechten Ecke zeigt die nahezu intakte Struktur des Tediums, und der Rahmen kennzeichnet den abgebildeten Bereich. Hier markiert Rot die Lysosomen und Grün das Autophagosom.Die Auto-Lysosomen, die durch die Fusion der beiden Organellen entstehen, erscheinen gelb. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Kultivierung von Material und die Verabreichung von Wirkstoffen durchgeführt werden, um unterschiedliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise die Wirkung von Substanzen auf Autophagie-Marker in neuronalen Zellen mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund.Kombination der Vorteile der Drosophila-Genetik mit fortgeschrittenen zellbiologischen Analysen, die in der Zellkultur möglich sind.

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