Name: Fluorescence Lifetime Imaging für molekulare Rotoren in lebenden Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Lernen Sie Fluorescence Lifetime Imaging für molekulare Rotoren in lebenden Zellen. Diese Methode ermöglicht die Kartierung von Mikroumgebungen und liefert Einblicke in zelluläre Dynamiken in Echtzeit.

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MKK dankt dem britischen Engineering and Physical Science Research Council (EPSRC) Life Sciences Interface-Programm für eine persönliche Gemeinschaft. Wir möchten auch die Finanzierung von der britischen Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) anerkennen.

Die Protokolle für FLIM Probenvorbereitung sich nicht von denen für die konfokale oder Wide-Feldstärke-basierte Fluoreszenzmikroskopie unterscheiden. Die Datenerfassung wird durch die Hauptaufgabe der Datenanalyse folgte, also Extrahieren der Fluoreszenz-Lebensdauern aus den Rohdaten. Sobald diese gewonnen wurden, hilft die Interpretation der Daten zu verifizieren oder zu falsifizieren Hypothesen. 1. Anfärben der Zellen mit molekularer Rotoren <ol><li> Vorbereiten einer Stammlösung (10 ml) durch Auflösen von ungefähr 1 mg / ml des Farbstoffs in einem geeigneten Lösungsmittel (zB Methanol BODIPY-C 12) unter Verwendung eines 6,7 genaue Gleichgewicht und einer Pipette. </li><li> Die Zellen (ein Modell-Zelllinie, HeLa in unserem Fall) zu färbenden auf in einer Multiwell-Platte mit einer Unterseite für die Mikroskopie coverslide geworden, in einem Inkubator bei 37 ° C mit einer 5% CO 2-Atmosphäre, bis ~ 80% konfluent . </li><li> In 10 bis 20 ul der Stammlösung zu den lebenden Zellen wachsen in einer Multi-WELl Platte (SmartSlide 50 Mikro-Inkubation System, WaferGen) in 4 ml Opti-MEM-Medium (GIBCO) pro Well für eine 6-Well-Platte. Dies ergibt eine Mikro-molaren Farbstoffkonzentration in dem Bohrloch. </li><li> Gibt die Multi-Well-Platte in einen Inkubator bei 37 ° C mit einer 5% CO 2-Atmosphäre für 10-45 Minuten für die Färbung. </li><li> Entfernen Sie die Multiwell-Platte aus dem Inkubator und Waschen der Zellen 3-4 mal mit 4 ml optisch klaren Zellkulturmedium (zB Opti-MEM), um überschüssige Farbe zu entfernen. </li><li> Übertragen der Multiwell-Platte auf dem Mikroskoptisch und eine Verbindung zu einem Temperaturregler / 5% CO 2 Gaseinlaß nach Bedarf, in Vorbereitung für die Bildgebung. </li></ol> 2. FLIM fluoreszierender molekularer Rotoren in Zellen <ol><li> Legen Sie die Probe auf dem Mikroskoptisch und erhalten eine Sende-und Fluoreszenz-Bild zu fluoreszierenden Zellen zu identifizieren. Ein schematisches Diagramm des experimentellen Aufbaus ist in gezeigt. 1.Verify, dass die Fluoreszenz geht von der Erfahrung StandortenCTED (zB Zellmembran, Zytoplasma). Erhalten ein Fluoreszenzemissionsspektrum und sicherzustellen, dass es, dass der Farbstoff oder Protein erwartet ist, in diesem Fall das Spektrum des molekularen Rotors. Als eine negative Kontrolle, Bild ein nicht-gefärbten Probe und sicherzustellen, dass es nicht fluoresziert. Dieser Schritt ist zwar nicht zwingend speziell für FLIM, ist es gute Praxis im Allgemeinen und nicht helfen zu überprüfen, ob die Probe ist, was Sie denken es ist. </li><li> Wechseln Sie zu FLIM-Modus - dieser wird einfach durch Bewegen eines Spiegels aus dem Fluoreszenz-Detektion Strahlengang ("externe Detektor"-Taste auf "Beam Path Setting"-Panel auf dem Leica TCS SP2 Erwerb Steuer-Software) durchgeführt. Eine entsprechende Fluoreszenzemission Filter auf jedes anregende Licht den Detektor erreicht blockieren müssen in der Fluoreszenz-Detektion Strahlengang sein. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="1"> Abbildung 1. Experimentelle Anordnung zur Time-Domain-FLIM mit aconfocal Laser Scanning Mikroskop. <ol start="3"><li> Scannen Sie die Probe und prüfen, auf dem Computer die Steuerung der FLIM Erwerb, dass der Detektor Zählrate (schwarzer Balken gekennzeichnet CFD auf Erwerb Steuerungs-Software der Becker &amp; Hickl SPC 830 board) nicht mehr als etwa 1% des Laser-Wiederholrate ist ( grünen Balken markiert SYNC Erwerb Steuer-Software). Wenn ja, reduzieren die Laseranregung Intensität, zB indem ein Graufilter im Laserstrahlengang, um zu vermeiden, Massenkarambolage verzerrten Fluoreszenzabklingkurven. </li><li> Eignen Sie sich ein Bild FLIM, in der Regel für 3-5 min, Suche beenden und speichern Sie die Rohdaten (ein 3D-Daten "Würfel", bestehend aus räumlichen Koordinaten x und y, und Zeit). </li><li> Öffnen Sie die Rohdaten in der Fluoreszenzabklingzeiten Analyse-Software-Paket, zum Beispiel Tri-2 14 oder kommerzielle Software, um die Intensität der Fluoreszenz Bild anzuzeigen. Das ist einfach das integrierte Fluoreszenzabklingzeiten, dh die Fläche unter dem Fluoreszenz-Abklingkurve, in jederPixel. </li><li> Wählen Sie einen typischen Pixel indem Sie den Cursor darauf und überprüfen den Fluoreszenzabklingzeiten in diesem Pixel. Wenn der Peak-Zahl unter 100, verwenden räumliche Binning von Pixeln. Die Zählungen der benachbarten Pixel (zB 3x3 oder 5x5) in das zentrale Pixel addiert, so dass eine höhere Spitzenleistung Zählung erhalten wird. Dies bietet eine höhere statistische Genauigkeit für den nächsten Schritt. Alternativ könnte die Messung für eine längere Erfassungszeit (Schritt 5) wiederholt werden. Für 30-50min, wird ein etwa 10-fach höhere Peak count (und Gesamtaktivität) erhalten, aber das ist viel zu lange Zeit eine Anschaffung für die meisten biologischen Proben wegen der Gefahr der Einführung Artefakte durch Bewegung der Probe, Drift-Mikroskop, Phototoxizität und Ausbleichen. </li><li> Wählen Sie einen globalen Pixel Schwellenwert (über dem der Zerfall in einem Bildpunkt vorhanden ist) und wenden Sie einen einzigen exponentiellen Abfall passen zu dem Bild. Das Ergebnis ergibt sich eine Fluoreszenzlebensdauer für jedes Pixel über dem Schwellenwert, der dann wiederum kodiertFarbe. Jedes Pixel wird mit dem Ergebnis der Anpassung gefärbt, und eine FLIM Karte erhalten wird. Überprüfen Sie die Chi-Quadrat-Werte für verschiedene Pixel - rund 1 (und bis zu 1,3) deutet auf eine gute Passform. Prüfen der entsprechenden Residuen, die zufällig um Null verteilt werden soll. </li><li> Die Fluoreszenz-Lebensdauer-Histogramm, wie oft bestimmte Fluoreszenzlebensdauern gegenüber der Fluoreszenz-Lebensdauer selbst auftreten. Passen Sie den Farbbereich, so dass die Fluoreszenz-Lebensdauer-Verteilung in die Farbpalette passt. </li><li> Wenn ein monoexponentielle Passform nicht nachgibt einen Chi-Quadrat-Wert von etwa 1 (und bis zu 1,3), und es gibt eine systematische Abweichung der Residuen von Null, wird ein komplexeres Modell erforderlich. Zum Beispiel versuchen Anbringen einer doppelt exponentiellen Modell auf die Fluorezenzzerfaelle zur Berücksichtigung für zwei verschiedene Umgebungen die Sonde auf sein kann Passung ergibt ebenfalls die präexponentiellen Faktoren oder Amplituden, die einen Hinweis auf die relative Menge des Farbstoffes in einem Umweltment oder das andere. Alternativ kann eine gestreckte Exponentialfunktion angebracht, eine Verteilung der Fluoreszenz-Lebensdauern ausmachen. </li><li> Die Ergebnisse für die Fluoreszenz-Lebensdauer, präexponentiellen Faktoren, und die Lebensdauer-Verhältnis und dem präexponentiellen Faktor Verhältnis für jedes Pixel können dann farbig kodiert werden. Jedes Pixel ist farbig nach seinen Wert, und der Kontrast durch Fluoreszenz-Lebensdauern, präexponentiellen Faktoren und deren Verhältnisse erreicht wird. Wieder finden Sie die Chi-Quadrat-Werte (die auch in Farbe kodiert werden und angezeigt als Bild) - rund 1 (und bis zu 1,3) deutet auf eine gute Passform. Untersuchen Sie die Residuen, die zufällig um Null verteilt werden sollten. </li><li> Fluoreszenz-Lebensdauer-Histogramme sollten alle Bilder zur einfachen Visualisierung von mittleren Fluoreszenzlebensdauer Werte, und die Fluoreszenz-Lebensdauer-Verteilung begleiten. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse Fluorezenzzerfaelle für gemessendas fluoreszierende molekulare Rotor bei steigender Viskosität in Methanol / Glycerin-Mischungen sind in Abb. 2. Die Fluoreszenz-Zerfälle sind monoexponentielle, und die Fluoreszenz-Lebensdauer variiert stark in Abhängigkeit von der Viskosität. Sie steigt von rund 300 PS in Methanol (Viskosität 0,6 cP) bis 3,4 ns in 95% Glyzerin (Viskosität 950 cP). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="2"> Abbildung 2. Fluoreszenz-Abklingverhalten für BODIPY-C 12 in Methanol / Glycerin mit unterschiedlicher Viskosität. 6 Die logarithmische Eichkurve Fluoreszenzlebensdauer τ gegen die Viskosität η für die fluoreszierende molekulare Rotor ist in Abb. 3. Es ist eine gerade Linie durch den Förster Hoffman Gleichung 9 gefordert <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq1.jpg" alt="Gleichung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Gleichung 1"> wobei k 0 ist die radiative Geschwindigkeitskonstante, und z und x Konstanten sind, und mit 0 &lt;x &lt;1 ist. Logarithmieren auf beiden Seiten ergibt <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq2.jpg" alt="Gleichung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Gleichung 2"> wobei x die Steigung der geraden Linie. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Eine Auftragung von log Fluoreszenz-Lebensdauer vs log Viskosität für BODIPY-C 12 ergibt sich eine gerade Linie in Übereinstimmung mit dem Förster-Hoffmann-Gleichung. 6 Nach der Inkubation von lebenden Zellen mit dem fluoreszierenden molekularen Rotor eine punktförmige Verteilung Farbstoff wird in den Fluoreszenz-Bildern beobachtet. FLIM Bilder von HeLa-Zellen mit einem meso-substituierten BODIPY Farbstoff inkubiert sind in Abb. 4. Die Fluoreszenz-Zerfälle in jedem Pixel des Bildes adäquat ausgestattet werden mit einer einzigen exponentiellen Modell. 4. (A) Fluoreszenzintensität und (b) FLIM Bilder von HeLa-Zellen mit BODIPY-C 12-gefärbt. Die hellen, punktförmigen Regionen weisen eine kürzere Lebensdauer als andere Regionen. Diese kürzere liftime entspricht einer niedrigeren Viskosität im Puncta, wahrscheinlich Fetttröpfchen, gemäß der Förster-Hoffmann Gleichung. Durch Auftragen der Lebensdauern von jedem Pixel extrahiert, erhalten wir eine Fluoreszenz-Lebensdauer-Histogramm des gesamten Bildes, wie in Abb. 5. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Histogramme der Fluoreszenz-Lebensdauern von FLIM Bilder von HeLa-Zellen mit meso-substituierten BODIPY molekularer Rotoren gefärbt.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

FLIM bietet einige entscheidende Vorteile gegenüber Intensität-basierte Fluoreszenz-Imaging. Es kann auf photophysikalische Ereignisse, die schwierig oder unmöglich zu Fluoreszenzintensität Bildgebung beobachten sind zu berichten, da es sie von Fluorophorkonzentration Effekte zu trennen kann. Dies ist besonders nützlich für die Zuordnung intrazellulären Viskosität durch Abbilden fluoreszierenden molekularen Rotoren. Die Fluoreszenz-Lebensdauer kann leicht zu einer Viskosität unter Verwendung einer Eichkurve umgewandelt werden, wie in gezeigt. 3, unabhängig von der Konzentration der fluoreszierenden molekularen Rotoren. In FLIM kann es zu Artefakten, die die Interpretation der Daten erschweren kann. Instrumental 10 Ausstellungsstücken zählen Streulicht, die Show wird als Peak auf der Oberseite des Anfang des Fluoreszenzabklingzeiten und kann mit einer kurzen Abklingzeit verwechselt werden, oder eine kleine Spitze, nachdem der IRF welche sich durch Reflexionen im Innern des Mikroskops verursacht werden. Diese Streulicht Artefakte können als solche identifiziert werdenweil sie mit spektralen Diskriminierung unterschieden werden können - sie sind immer auf der gleichen Wellenlänge wie das anregende Licht. Daran erinnernd, dass in Luft, Licht 30 cm bewegt sich in 1 Nanosekunde hilft, den Ursprung von Reflexionen zu lokalisieren. Filter-oder Glas-Fluoreszenz könnten auch dazu führen, ein Artefakt, insbesondere bei niedrigen Probenfluoreszenz, aber dies kann leicht durch eine Messung ohne Probe identifiziert werden: wenn ein Zerfall unter diesen Umständen gewonnen wird, ist es aufgrund des Instruments und hat nichts zu tun mit der Probe! Auf der anderen Seite, dass Probe Autofluoreszenz kann auch mit einem Fluoreszenzabklingzeit wirken. In zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung (TCSPC), Time-to-Amplituden-Wandler (TAC) Nichtlinearitäten können zu einer schlechten passt, kann aber durch die Blockierung der Anregung und glänzenden Umgebungslicht, zB aus dem übertragenen Lichtquelle auf die Probe identifiziert werden und Messen der Timing. Eine konstante Hintergrund sollteerhalten in jedem Pixel des Bildes. Regionen, in denen Abweichungen von einer konstanten Hintergrund ablaufen, wird niemals zu ergeben eine gute Passform und sollte für die Messung vermieden werden, wenn sie nicht durch Einstellen der Parameter für die TCSPC Karte eliminiert werden. Ein berühmt-berüchtigten Artefakt in TCSPC Photon ist Pile-Up, das durch zu hohe Erkennungsrate eines Photons verursacht. 11,12 Dies führt zu einer nur des ersten Photons wird zeitlich und ignoriert alle nachfolgenden Photonen, weil die Elektronik beschäftigt sind Timing und der Verarbeitung des ersten Photons. Pile-up führt zu einer Verkürzung der Fluoreszenz-Lebensdauer, und der beste Weg, um dies zu vermeiden ist es, die Photonen-Zählrate bei rund 1% des Laser-Repetitionsrate zu halten. Ausblick Es gibt verschiedene Implementierungen von FLIM und, je nach Anwendung, jeder hat seine Vorteile und Nachteile. 13 Die ideale Fluoreszenzmikroskop erwerben würde die gesamte multidimensionale Fluoreszenz emission Kontur der Intensität, Position, Lebensdauer, Wellenlänge und Polarisation in einer einzigen Messung, mit Single-Photon-Empfindlichkeit, räumliche Auflösung maximale und minimale Messzeit. Es gibt gegenwärtig keine Technologie, mit dieser einzigartigen Kombination von Merkmalen, einen zu bauen und bleibt eine Herausforderung für die Messtechnik-Entwickler. Die Anwendung des neuen physikalischen Techniken, um wichtige Probleme in der Zellbiologie ist oft der Weg zu unerwarteten Entdeckungen, und es gibt einen langen Weg vor uns, bevor wir nah an sättigenden die Fähigkeiten von Fluoreszenz-Imaging für Zellbiologie sind. In der Tat sind Abbildung von Fluoreszenz-Parameter wie Lebensdauer, Spektrum und Polarisation, sowie bildgebende schneller in 3D bei hoher räumlicher Auflösung, bestimmte neue Aspekte in der Zellbiologie zu offenbaren.

Probe mit fluoreszierenden molekularen Rotoren Hardware: invertierte Leica TCS SP2 Rastermikroskop Coherent Mira 900 Ti: Saphir-Femtosekundenlaser mit einer Verdi-V6-Pumplaser oder Hamamatsu PLP-10 470 Pikosekunden Diodenlaser gepulsten Anregungsquellen Becker &amp; Hickl SPC 830 Board in 3GHz, Pentium IV, 1 GB RAM Computer mit Windows XP gekühlten Becker &amp; Hickl PMC100-01-Detektor Kopf auf Hamamatsu H5773P-01 Photomultipliern, auf Mikroskop-x1-Port angebracht, oder Hybrid-Detektoren basieren DCC-100 Detektor-Steuermodul Software: Tri-2 14 oder SPCImage 2,8 von Becker &amp; Hickl

fluorescence lifetime imaging für molekulare rotoren in lebenden zellen

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion ist oft ein wichtiger geschwindigkeitsbestimmende Schritt in chemischen Reaktionen oder biologische Prozesse und spielt eine Rolle in einer Vielzahl von intrazellulären Ereignissen. Die Viskosität ist einer der wichtigsten Parameter, die die Diffusion von Molekülen und Proteinen, und Änderungen in der Viskosität haben, um Krankheit und Störung wurde auf zellulärer Ebene verknüpft. 3.1 Während Methoden, um die Masse zu messen Viskosität gut entwickelt sind, bleibt eine Herausforderung Bildgebung Mikroviskosität . Viskosität Karten von mikroskopisch kleinen Objekten, wie einzelne Zellen, haben bis vor kurzem noch schwer zu bekommen. Mapping Viskosität mit Fluoreszenz-Verfahren ist vorteilhaft, da, ähnlich wie bei anderen optischen Techniken, es minimal-invasiven, nicht-destruktiv ist und kann an lebenden Zellen und Geweben angewandt werden. Fluoreszierende molekularer Rotoren weisen Fluoreszenzlebensdauern und Quantenausbeuten, die eine Funktion der Viskosität ihrer Mikroumgebung sind. 4,5 Intramolekulare Verdrehen oderDrehung führt zu nicht-strahlenden Zerfall aus dem angeregten Zustand zurück in den Grundzustand. Ein viskoser Umwelt verlangsamt diese Rotation oder Verdrehung, die den Zugang zu dieser nicht-strahlenden Zerfall Weg. Dies führt zu einer Erhöhung der Fluoreszenz-Quantenausbeute und der Fluoreszenzlebensdauer. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) von modifizierten hydrophoben BODIPY Farbstoffe, die als fluoreszierende molekulare Rotoren wirken zeigen, dass die Fluoreszenz-Lebensdauer dieser Sonden eine Funktion der Mikroviskosität ihrer Umgebung ist. 8.6 eine logarithmische Darstellung der Fluoreszenz-Lebensdauer im Vergleich zu den Lösungsmittelviskosität Erträge eine gerade Linie, die die Förster Hoffman Gleichung gehorcht. 9 Dieses Grundstück dient auch als Eichkurve zur Fluoreszenz-Lebensdauer in Viskosität zu konvertieren. Nach der Inkubation von lebenden Zellen mit dem modifizierten BODIPY fluoreszierende molekulare Rotor wird eine punktförmige Verteilung in den Farbstoff Fluoreszenz-Bildern beobachtet. Die Viskosität Wert in th erhaltene puncta in lebenden Zellen ist etwa 100 mal höher als die von Wasser und Zytoplasma. 6,7 Zeitaufgelöste Fluoreszenzanisotropiemessungen nachgeben Rotationskorrelationszeiten im Einvernehmen mit diesen großen Mikroviskosität Werte. Zuordnen der Fluoreszenz-Lebensdauer ist unabhängig von der Intensität der Fluoreszenz, und ermöglicht somit die Trennung der Sonde Konzentration und Viskosität Effekte. Zusammenfassend haben wir eine praktische und vielseitige Herangehensweise an die Mikroviskosität in Zellen auf molekularer FLIM von fluoreszierenden Rotoren basierte Landkarten entwickelt.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) wurden als wesentliche Technik, um Bild die Umwelt und die Interaktion bestimmter Proteine ​​und Farbstoffe, die in lebenden Zellen entstanden. FLIM fluoreszierender molekularer Rotoren ermöglicht die Zuordnung der Viskosität in lebenden Zellen.

Fluorescence Lifetime Imaging für molekulare Rotoren in lebenden Zellen

Die Diffusion ist häufig ein wichtiger geschwindigkeitsbestimmender Schritt in chemischen Reaktionen oder biologischen Prozessen und spielt eine Rolle in einer Vielzahl intrazellulärer ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie oder FLIM von fluoreszierenden molekularen Rotoren in lebenden Zellen durchzuführen. Dies wird erreicht, indem Zellen zunächst mit modifizierten hydrophoben Bo-Dipy-Farbstoffen, die als molekulare Rotoren fungieren, angefärbt werden – fluoreszierende Moleküle, deren Fluoreszenzlebensdauer von der Viskosität ihrer mikroskopischen Umgebung abhängt.Als zweiten Schritt wird die Zeitbereichs-Phlegm mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durchgeführt. Anschließend werden die Daten an einen exponentiellen Abfall angepasst, um eine Fluoreszenzlebensdauer für jedes Pixel zu erhalten. Eine FLIM-Karte, begleitet von einem Histogramm der Fluoreszenzlebensdauern, kann dann erstellt werden, indem die aus jedem Pixel des FLIM-Bildes extrahierten Lebensdauern aufgetragen werden.Ein Histogramm der Fluoreszenzlebensdauern kann über das gesamte Bild hinweg erhalten werden, wodurch die Abbildung der Mikroviskosität in unterschiedlichen zellulären Bereichen lebender Zellen ermöglicht wird. Viskositätskarten einzelner Zellen waren bis vor Kurzem schwer zu erhalten. Die Abbildung der Viskosität mittels Fluoreszenztechniken ist vorteilhaft, da sie minimal invasiv und nicht zerstörend ist und daher auf lebende Zellen und Gewebe angewendet werden kann.Die Durchführung der Prozedur wird mein Doktorand und Dr. James Levit, ein Postdoktorand in meinem Labor, vornehmen. Fluoreszenz ist ein Mehrparameter-Signal, das durch Position, Intensität, Wellenlänge, Lebensdauer und Polarisation charakterisiert werden kann. Besonders interessieren wir uns für die Position und die Lebensdauer vor Beginn dieser Prozedur.LAR-Zellen in einer Mehrfach-Platte oder Schale, die auf einem Mikroskopständer auf 37 Grad Celsius erwärmt und mit 5 % Kohlendioxid versorgt werden kann, bis die Zellen etwa 80 % Konfluenz erreicht haben. Als Nächstes wiegen Sie mithilfe einer genauen Waage ausreichend BO-dippy-C12-Farbstoff für eine 10-Milliliter-Stammlösung mit einer Konzentration von etwa einem Milligramm pro Milliliter ab und lösen Sie diesen in Methanol mit einer Pipette auf. Danach geben Sie 10 bis 20 Mikroliter der D-Stammlösung zu den lebenden Zellen hinzu, die in vier Milliliter Zellkulturmedium pro Vertiefung wachsen.Dadurch ergibt sich eine mikromolare Farbstoffkonzentration in der Mulde. Stellen Sie die Zellen nach der Inkubation zurück in den Inkubator, um die Färbung zu ermöglichen. Waschen Sie die Zellen drei bis viermal mit je vier Milliliter optisch klarem Zellkulturmedium.Medium, um überschüssiges Farbstoffmittel zu entfernen. Bereiten Sie die Zellen zur Bildgebung vor, indem Sie die Mehrfach-Well-Platte auf die Mikroskopbühne überführen, die an eine Temperaturregelung und einen 5%igen Kohlendioxid-Gasanschluss angeschlossen ist, falls erforderlich. Bevor Sie eine FLIM-Aufnahme von fluoreszierenden molekularen Rotoren in Zellen starten, erzeugen Sie ein Transmissions- und ein Fluoreszenzbild, um die fluoreszierenden Zellen zu identifizieren.Überprüfen Sie, ob die Fluoreszenz von den erwarteten Positionen innerhalb der Zellen ausgeht. Es sollte eine punktförmige Verteilung zusammen mit einer diffusen Färbung im gesamten Zellbereich vorliegen. Erhalten Sie ein Fluoreszenzemissionsspektrum, indem Sie das Bild in verschiedenen Wellenlängenbereichen scannen.Überprüfen Sie, ob das Spektrum dem erwarteten Futter oder Protein entspricht. Das Emissionsspektrum des hier gezeigten molekularen Rotors sollte scharf bei etwa 490 Nanometern ansteigen, bei etwa 515 Nanometern ein Maximum erreichen und bei etwa 600 Nanometern abfallen. Verwenden Sie als Negativkontrolle ein Bild einer nicht mit ST gefärbten Probe, und vergewissern Sie sich, dass keine Fluoreszenz auftritt. Wechseln Sie anschließend in den FLIM-Modus, indem Sie einen Spiegel aus dem Strahlengang der Fluoreszenzdetektion herausbewegen.Verwenden Sie einen geeigneten Fluoreszenzemissionsfilter im Strahlengang der Fluoreszenzdetektion, um sicherzustellen, dass anregendes Licht nicht den Detektor erreicht. Wechseln Sie in den FLIMM-Modus und bereiten Sie die Probenscanung vor. Stellen Sie sicher, dass die Detektionszählerate nicht mehr als etwa 1 % der Laserwiederholungsrate beträgt.Falls ja, verringern Sie die Laseranregungsintensität, beispielsweise indem Sie einen Neutraldichtefilter in den Laserstrahlengang einbringen. Um die Aufnahme von durch Pile-up verzerrten Fluoreszenzabklingkurven zu vermeiden, nehmen Sie ein Bild üblicherweise drei bis fünf Minuten lang auf, beenden Sie anschließend das Scannen und speichern Sie die Rohdaten. Die Rohdaten stellen einen dreidimensionalen Datenwürfel dar, der aus den räumlichen Koordinaten X und Y sowie der Zeit besteht. Öffnen Sie die Rohdaten in der Software zur Analyse von Fluoreszenzabklingkurven.Hier gezeigt ist ein SPC-Bild von Becker und Hickle. Dies zeigt das Fluoreszenzintensitätsbild, das einfach die integrierte Fluoreszenzabklingung darstellt. Wählen Sie in jedem Pixel ein typisches Pixel aus, indem Sie den Cursor darauf platzieren.Überprüfen Sie den Fluoreszenzzerfall in diesem Pixel. Wenn die Spitzenanzahl unter 100 liegt, verwenden Sie eine räumliche Bündelung von Pixeln, indem Sie die Zählraten benachbarter Pixel zum zentralen Pixel addieren, um eine höhere Spitzenanzahl zu erhalten. Dies liefert eine höhere statistische Genauigkeit für den nächsten Schritt.Als Nächstes wählen Sie einen globalen Pixel-Schwellenwert aus und wenden einen einfachen exponentiellen Abklingfit auf das Bild an. Das Ergebnis ist eine Fluoreszenzlebensdauer für jeden Pixel oberhalb des Schwellenwerts. Mithilfe eines Regenbogen-Farbschemas weist die Software jedem Pixel eine Farbe zu.Jedem Pixel wird dann die Farbe des Anpassungsergebnisses zugewiesen, und aus dem Phlegma-Bild wird eine FLIM-Karte erstellt. Die Häufigkeit bestimmter Fluoreszenzlebensdauern wird gegen die Fluoreszenzlebensdauer selbst aufgetragen, um das Fluoreszenzlebensdauer-Histogramm zu erhalten. Dieses Diagramm sollte einer glockenförmigen Kurve entsprechen, und sein Mittelwert sollte mit anderen Studien zu Bo JPC 12 in Zellen übereinstimmen. Passen Sie den Farbbereich so an, dass die Verteilung der Fluoreszenzlebensdauer in den der Lebensdauer-Spanne zugewiesenen Farbbereich passt. Überprüfen Sie an den Pixeln die reduzierten Chi-Quadrat-Werte für verschiedene Pixel.Ein Wert von ungefähr eins bis 1,3 deutet auf eine gute Anpassung hin; überprüfen Sie die entsprechenden Residuen, die zufällig um null verteilt sein sollten. Wenn eine monoexponentielle Anpassung keinen guten Chi-Quadrat-Wert ergibt und systematische Abweichungen der Residuen von null vorliegen, ist ein anspruchsvolleres Modell erforderlich. Passen Sie die Daten mithilfe eines geeigneten Softwarepakets an einen doppelexponentiellen Zerfall an, um zwei verschiedene Umgebungen des Probes zu berücksichtigen.Die Anpassung liefert außerdem die präexponentiellen Faktoren beziehungsweise Amplituden, die einen Hinweis auf die relative Menge der Nahrung in einer Umgebung im Vergleich zu einer anderen geben. Die Ergebnisse für die fluoreszierenden Lebensdauern und die präexponentiellen Faktoren können dann farblich codiert werden, indem wie zuvor jedes Pixel entsprechend seinem Wert eingefärbt und mit den anderen kontrastiert wird. Um das Verhältnis der Lebensdauer und das Verhältnis der präexponentiellen Faktoren für jedes Pixel zu erhalten, überprüfen Sie, ob die reduzierten Chi-Quadrat-Werte auf eine gute Anpassung hinweisen.Überprüfen Sie die Residuen, die erneut zufällig um null verteilt sein sollten. Ein Histogramm der fluoreszierenden Lebensdauer sollte allen Bildern beigefügt werden, um eine einfache Visualisierung der durchschnittlichen Werte der fluoreszierenden Lebensdauer sowie der Verteilung der fluoreszierenden Lebensdauer zu ermöglichen. Die für den molekularen Rotor bei zunehmender Viskosität gemessenen Fluoreszenzabklingkurven in Methanol-Glycerin-Mischungen sind dargestellt. Die Fluoreszenzabklingkurven sind monoexponentiell, und die Fluoreszenzlebensdauer variiert deutlich in Abhängigkeit von der Viskosität.Er steigt von etwa 300 Pikosekunden in Methanol auf 3,4 Nanosekunden in 95 % Glycerin an. Eine logarithmische Kalibrierungskurve der logarithmierten Fluoreszenzlebensdauer gegen die logarithmierte Viskosität. Für BO DPC 12 ergibt sich eine Gerade gemäß der erzwungenen Hoffmann-Gleichung.Die Fluoreszenzintensität von HeLa-Zellen, die mit dem molekularen Rotor inkubiert wurden, zeigt deutlich die intrazelluläre Aufnahme des molekularen Rotors mit punktförmiger D-Verteilung. Vermutlich in den Lipidtröpfchen. Ein Phlegma-Bild der LAR-Zellen, die mit BoDPC 12 inkubiert wurden, ist dargestellt.Die hellen punktförmigen Bereiche weisen eine kürzere Lebensdauer auf als die zytoplasmatischen Bereiche, was gemäß der Förster-Hoffmann-Gleichung einer geringeren Viskosität entspricht. Die Fluoreszenzabklingkurven in jedem Pixel des Bildes können ausreichend mit einem einfachen exponentiellen Abklingmodell angepasst werden. Durch die Darstellung der aus jedem Pixel extrahierten Lebensdauern kann ein Histogramm der fluoreszenten Lebensdauern über das gesamte Bild hinweg erstellt werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Viskosität in lebenden Zellen mithilfe fluoreszierender molekularer Rotoren abbilden kann.

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Forschung

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Bioengineering

Biotechnik

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