Die dreidimensionalen humanen Haut Rekonstruieren Modell: ein Tool für normale Haut und Melanom Progression Study

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein dreidimensionales humanes Hautrekonstrukt für Untersuchungen zur Biologie von Melanozyten, Melanomen und Hautstammzellen herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Insert von Gewebekulturschalen mit neutralisiertem Rinderkollagen beschichtet wird. Im zweiten Schritt wird der zelluläre dermale Kompartiment aus Fibroblasten und Kollagen hergestellt.

Als Nächstes stellen Sie das epidermale Kompartiment aus Keratinozyten her, die mit Melanozyten oder Melanomzellen gemischt sind. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, am Tag 18 ein Hautrekonstrukt zu gewinnen und dieses auf eine Maus zu transplantieren. Letztendlich zeigen immunhistochemische und immunfluoreszenzanalytische Untersuchungen des Transplantats die Architektur einer normalen Haut mit Melanozyten, die Migration und Differenzierung normaler Stammzellen sowie stadienspezifische Melanomphänotypen.

Wir haben das Hautrekonstruktionsmodell vor 20 Jahren entwickelt, weil wir bereits zu Beginn unserer Studien feststellten, dass normale Melanozyten oder Melanomzellen, die in einer Petrischale kultiviert werden, sich ganz anders verhalten als Zellen im Gewebekontext. Daher eignet sich das Hautrekonstruktionsmodell ideal dafür, zu beobachten, wie Zellen von einem Kompartiment der Haut in ein anderes wandern. Die zuvor vorbereitete azelluläre Kollagenmischung auf Eis, und dann ein Milliliter der strohgelben Lösung in jedes Insert eines Sechsers geben.

Die Gewebekulturplatte inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur, damit das Gel gerinnen kann. Während dieser Zeit sollte die Lösung ihre Farbe von gelb nach rosa ändern, während das Gel erstarrt. Behandeln Sie humane Fibroblasten in ihrer Kulturschale mit 0,25 % Trypsin-EDTA, nach fünf Minuten. Geben Sie DMEM mit 10 % FBS zu, um den Neutralisierungsprozess abzuschließen.

Sammeln Sie die abgelösten Zellen durch Zentrifugation fünf Minuten bei 200 ×g bei Raumtemperatur und resuspendieren Sie die Zellen anschließend bei 4,5 × 10⁵ Zellen pro 1,5 Milliliter DMEM, ergänzt mit 10 % FBS. Füllen Sie als Nächstes ein 50-Milliliter-Gefäß mit der zuvor hergestellten Kollagenmischung der zellulären Schicht und stellen Sie das Gefäß auf Eis.

Geben Sie 1,5 Milliliter der Fibroblastensuspension zu dem Röhrchen hinzu und mischen Sie gründlich. Geben Sie drei Milliliter der strohgelben zellulären Schichtlösung auf jeden mit akzellulärer Schicht beschichteten Insert. Anschließend inkubieren Sie die Gewebekulturplatte 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Gewebekulturinkubator mit 5 % Kohlendioxid während der Inkubationszeit.

Die Farbe der zellulären Schichtlösung sollte sich ebenfalls von gelb nach rosa verfärben. Nachdem sich das obere Gelschicht verfestigt hat, geben Sie zwei Milliliter DMEM mit 10 % FBS auf die Innenseite des Inserts in der Gewebekulturplatte und zehn Milliliter auf die Außenseite des Inserts. Inkubieren Sie die Gewebekulturplatten vier Tage lang.

Am vierten Tag überprüfen, ob das Gel schrumpft; am vierten Tag der Inkubation das Medium sowohl vom Inneren als auch vom Äußeren jedes Inserts abpipettieren. Zwei Milliliter Waschmedium in das Innere und 10 Milliliter in das Äußere der Inserts geben, um das normale Serum abzuwaschen. Anschließend die Platten eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren, um die Epidermis zu bilden.

Zunächst wird Trypsin bei humanen Keratinozyten verwendet. Danach, nach fünf Minuten, verwenden Sie Trypsin-Inhibitor aus Sojabohnen, um das Trypsin zu neutralisieren, nachdem die abgelösten Zellen bei 200 ×g fünf Minuten lang zentrifugiert wurden. Resuspendieren Sie das Zellpellet anschließend in Haut bei 4,17 × 10⁶ Zellen pro Milliliter.

Rekonstruieren Sie das Medium, nachdem die Keratinozyten gewonnen wurden. Belichten Sie humane Melanozyten mit Trypsin auf Eis für ein bis zwei Minuten. Neutralisieren Sie erneut das Trypsin mit Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor.

Danach die Zellen nach erneutem Zentrifugieren unter denselben Bedingungen wie zuvor in einem Pellet vorliegen, das Melanozytenpellet in Haut-Rekonstruktions-Medium auf eine Konzentration von 8,3 × 10⁵ Zellen pro Milliliter resuspendieren. Anschließend das Waschmedium sowohl von der inneren als auch von der äußeren Seite jedes Inserts einer vorbereiteten Gewebekulturplatte mit Dermalschicht entfernen.

Ersetzen Sie das Waschmedium, indem Sie 1,5 Milliliter Hautrekonstruktionsmedium eins auf die Innenseite und 10 Milliliter auf die Außenseite jedes Inserts geben. Anschließend mischen Sie 600 Mikroliter der Keratinozyten-Zellsuspension mit 600 Mikrolitern der Melanozyten-Suspension. Geben Sie 200 Mikroliter der gemischten Zellsuspension aus.

Tropfenweise in das Innere jedes Inserts geben. Die Zellkulturplatte zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die Haut, rekonstruiertes Medium eins, sowohl aus dem Inneren als auch aus dem Äußeren jedes Inserts absaugen und anschließend zwei Milliliter Haut, rekonstruiertes Medium zwei, in das Innere und 10 Milliliter in das Äußere des Inserts geben.

Anschießend die Rekonstrukte weitere zwei Tage bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der zweiten zweitägigen Inkubation das Hautrekonstrukt-Medium zwei von der Innenseite und Außenseite jedes Inserts absaugen. Nun 7,5 Milliliter des Hautrekonstrukt-Mediums drei nur auf die Außenseite der Inserts geben.

Stellen Sie die Rekonstrukte zurück in den Inkubator und wechseln Sie die Haut. Erneuern Sie das Rekonstruktionsmedium alle zwei Tage, bis zum Tag 18. Am Tag 18 der Inkubation aspirieren Sie das Medium von der Innenseite und Außenseite der Inserts einer mit Hautrekonstrukten beladenen Gewebekulturplatte.

Entfernen Sie die Inserts aus der Halterung mit einer Pinzette. Schneiden Sie die Konstrukte einschließlich des Polycarbonatfilters aus, indem Sie mit einer Rasierklinge einen Kreis nahe der Kante nachzeichnen. Legen Sie danach das Rekonstrukt mit dem Filter auf eine harte Unterlage und halbieren Sie es mit der Klinge.

Legen Sie eine Hälfte des Rekonstrukts auf ein schwarzes TBS-Biopsiepapier und setzen Sie das Papier in eine Histologiekassette ein. Tauchen Sie die gesamte Kassette mehr als vier Stunden lang in 10 % Formalin ein. Anschließend stellen Sie die Kassette in 70 % Ethanol und lagern sie bei vier Grad Celsius, bis Sie bereit sind, das Rekonstrukt für die Paraffineinbettung zu verarbeiten.

Stellen Sie die andere Hälfte des Rekonstruats in 50 % Saccharose bei vier Grad Celsius für eine bis zwei Stunden. Danach ersetzen Sie die Saccharose durch zwei Molare und lagern sie weitere eine bis zwei Stunden bei vier Grad Celsius. Füllen Sie eine Basismatrize zur Hälfte mit optimalem Schneidetemperatur-Medium (OCT) oder einem ähnlichen Einfriermedium.

Vermeiden Sie jegliche Blasenbildung. Halten Sie den Rand des Rekonstruats mit einer Pinzette fest und nehmen Sie ihn aus der Saccharoselösung heraus. Legen Sie ihn auf Kim-Tücher, bis die Saccharose vollständig absorbiert ist.

Überführen Sie das Rekonstrukt mit einer Pinzette und einem Spatel in das Boot auf die Oberseite des OCT. Bedecken Sie die Oberseite des Rekonstrukts mit weiterem OCT, bis das Boot vollständig gefüllt ist. Vermeiden Sie erneut Blasen.

Stellen Sie das Boot gleichmäßig auf zerkleinertes Trockeneis, damit das OCT vollständig gefriert. Anschließend wickeln Sie die Basisform und die Folie ein und lagern sie bei minus 70 Grad Celsius, bis Sie bereit sind, sie mit einem Kryostaten zu schneiden. Um die Transplantation eines Hautrekonstruktats auf eine Maus vorzubereiten, füllen Sie einen Behälter mit flüssigem Stickstoff und geben fünf Milliliter DMEM in ein 50-Milliliter-Röhrchen.

Füllen Sie einen Becher mit 600 Milliliter Leitungswasser und stellen Sie den Becher auf eine Heizplatte, um das Wasser zu erwärmen. Wählen Sie anschließend eine weibliche skid haarlose, nicht inzüchtige Maus im Alter von etwa sechs Wochen aus. Nach der Anästhesie der Maus mit Isofluran.

Verwenden Sie eine Nasenkappe, um die Anästhesie während des gesamten Eingriffs aufrechtzuerhalten. Tragen Sie einen sterilen Augenschmiermittel auf und gewährleisten Sie Wärmeunterstützung, um eine Hypothermie zu verhindern. Reinigen Sie anschließend die Haut des Mäuses mit Benzoinlösung und alkoholischen Desinfektionstupfern.

Markieren Sie eine Linie auf dem Rücken der Maus, um die gleiche Position für die spätere Naht zu gewährleisten. Schneiden Sie mit Iris-Scheren und Pinzetten ein rundes Wundbett auf dem Rücken der Maus aus und bedecken Sie das Wundbett anschließend mit sterilen Gazetupfern. Legen Sie die runde Maushaut in das 50-Milliliter-Röhrchen mit DMEM.

Stellen Sie das Röhrchen in einen flüssigen Stickstoffbehälter, bis das gesamte Medium und das Gewebe vollständig eingefroren sind. Tauchen Sie das Röhrchen danach in ein Becherglas mit heißem Wasser, bis es vollständig aufgetaut ist. Wiederholen Sie diesen Einfrier- und Auftauvorgang dreimal.

Verwenden Sie eine chirurgische Klinge, um ein Hautrekonstrukt von einem Insert zu lösen. Entfernen Sie die Membran äußerst vorsichtig und übertragen Sie anschließend das Hautrekonstrukt auf das Wundbett der Maus. Legen Sie nun die Maushaut auf das Hautrekonstrukt.

Stellen Sie sicher, dass die erste Naht über der zuvor markierten Markierung liegt und die zweite an der Unterseite liegt. Verwenden Sie dann zwei weitere Nähte an den Seiten der Hautrekonstruktion, um die Maushaut zu fixieren. Reinigen Sie die Maushaut nach der Transplantation und setzen Sie die Maus anschließend in einen neuen Käfig.

Am Tag 18 besteht die Epidermis der Hautrekonstrukte aus geschichteten Keratinozytenschichten; die undifferenzierte basale Schicht und die darauf folgenden differenzierten Schichten sind vertikal orientiert. Färbung des Schnitts der Rekonstrukte mit dem melanocytären Marker.

S 100, wie durch die schwarzen Pfeile angezeigt, zeigt, dass Melanozyten in der basalen Schicht der Epidermis ausgerichtet sind und über dendritische Fortsätze mit mehreren Keratinozyten kommunizieren. Der dermale Kompartiment enthält Fibroblasten, die in einer Kollagen-Typ-I-Matrix eingebettet sind; abgelagertes Kollagen IV markiert die Basalmembran, die die Epidermis vom Dermis trennt. Die folgenden Abbildungen veranschaulichen, wie mehrere Schichten von Keratinozyten in der Epidermis gebildet werden.

Wenn dermale Stammzellen, die mit einem GFP-Lentiviralvektor markiert sind, gemeinsam mit Fibroblasten in eine Kollagen-Typ-I-Matrix eingebettet werden, wandern sie bis zum fünften Tag in die Epidermis ein und differenzieren sich zu Melanozyten. Nach dem Ansäen der Keratinozyten beginnen einzelne Zellen, sich von den Sphären auszuwachsen.

Beachten Sie, dass die Epidermis weiterhin aus einer einzigen Schicht besteht. Am achten Tag erreichen einige Zellen die Grenzfläche zwischen Epidermis und Dermis.

Am Tag 10 sind die GFP-positiven Zellen eng am Basalmembran-Position ausgerichtet, wie hier zu sehen ist. In die Epidermis migrierte GFP-positive Zellen exprimieren den melanozytären Marker HMB 45. Wenn verschiedene Stadien von Melanomzelllinien in Hautrekonstrukte eingebaut werden, spiegelt das Verhalten der Zellen ihre in-vivo-Eigenschaften wider.

Hier sind normale Melanozyten und Melanomzellen, die in 2D-Kulturen gezüchtet wurden, in dieser Abbildung zu sehen. Die Lokalisation und das Wachstum von normalen Melanozyten sind in Hautrekonstrukten eng kontrolliert, wie hier zu sehen ist; primäre Melanome im radialen Wachstumsstadium proliferieren vorwiegend in der Epidermis, während Melanome im vertikalen Wachstumsstadium invasiv in die Dermis wachsen, wie in dieser Abbildung dargestellt. Schließlich ist hier ersichtlich, wie metastasierende Melanome aggressiv tief in die Dermis eindringen.

Unsere Studien an normaler Haut bilden die Grundlage für ein besseres Verständnis der Entstehung und Progression von Melanomen.