Die dreidimensionalen humanen Haut Rekonstruieren Modell: ein Tool für normale Haut und Melanom Progression Study

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine menschliche 3D-Hautrekonstruktion für Studien zur Melanozyten-, Melanom- und Hautstammzellbiologie zu generieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Einlage von Gewebekulturschalen mit neutralisiertem Rinderkollagen beschichtet wird. Der zweite Schritt besteht darin, das zelluläre Hautkompartiment aus Fibroblasten und Kollagen herzustellen.

Als nächstes stellen Sie das epidermale Kompartiment aus Keratinozyten her, die mit Melanozyten oder Melanomzellen gemischt sind. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, am 18. Tag eine Hautrekonstruktion zu entnehmen und eine Hautrekonstruktion auf eine Maus zu transplantieren. Letztendlich zeigen immunhistochemische und immunfluoreszierende Analysen des Transplantats die Architektur normaler melanozytenhaltiger Haut, die Migration und Differenzierung normaler Stammzellen und stadienspezifischer Melanom-Phänotypen.

Wir haben das Hautrekonstruktionsmodell vor 20 Jahren entwickelt, weil wir schon früh in unseren Studien festgestellt haben, dass normale Melanozyten oder Melanomzellen, die auf einer Schale kultiviert werden, sich ganz anders verhalten als Zellen, die sich in einem Gewebekontext befinden. Das Hautrekonstruktionsmodell ist also ideal für uns, um zu sehen, wie sich Zellen von einem Kompartiment in der Haut zu einem anderen Ort bewegen. Die zuvor vorbereitete azelluläre Schicht Kollagenmischung auf Eis, und fügen Sie dann einen Milliliter der strohgelben Lösung in jede Einlage einer Sechs hinzu.

Nun, Gewebekulturschale inkubieren Sie die Schale 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit sich das Gel verfestigen kann. Während dieser Zeit sollte sich die Farbe der Lösung von gelb nach rosa ändern, während das Gel Trypsin-Augen, menschliche Faserstrahlen aus ihrem Kulturkolben mit 0,25%-Tripsin EDTA nach fünf Minuten verfestigt. Fügen Sie DMEM mit 10 % FBS hinzu, um den Aktivierungsprozess zu neutralisieren.

Sammeln Sie die abgelösten Zellen durch Zentrifugation für fünf Minuten bei 200 g bei Raumtemperatur und resuspendieren Sie die Zellen dann bei 4,5 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro 1,5 Milliliter. DMEM ergänzt mit 10%FBS. Füllen Sie anschließend ein 50-Milliliter-Röhrchen mit der zuvor vorbereiteten Zellschicht-Kollagenmischung und stellen Sie das Röhrchen auf Eis.

Geben Sie 1,5 Milliliter der Fibroblastensuspension in das Röhrchen und mischen Sie. Geben Sie drei Milliliter der strohgelben Zellschichtlösung zu jeder mit der azellulären Schicht beschichteten Einlage. Inkubieren Sie dann die Gewebekulturschale während der Inkubationszeit 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Gewebekultur-Inkubator.

Auch die Farbe der Zellschichtlösung sollte sich von gelb nach rosa ändern. Nachdem das Gel der obersten Schicht erstarrt ist, geben Sie zwei Milliliter DMEM mit 10 % FBS auf die Innenseite des Einsatzes in der Gewebekulturschale und 10 Milliliter auf die Außenseite des Einsatzes. Inkubieren Sie die Gewebekulturschalen vier Tage lang.

Überprüfen Sie am vierten Tag, ob sich das Gel am vierten Tag der Inkubation zusammenzieht, und aspirieren Sie das Medium sowohl von der Innen- als auch von der Außenseite jedes Einsatzes. Geben Sie zwei Milliliter Waschmittel auf die Innenseite und 10 Milliliter auf die Außenseite der Einsätze, um das normale Serum abzuwaschen. Dann inkubieren Sie die Schalen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius zur Erzeugung der Epidermis.

Das erste Trypsin sind humane Keratinozyten. Verwenden Sie dann nach fünf Minuten einen Sojabohnen-Trypsin-Hemmer, um das Trypsin zu neutralisieren, nachdem Sie die abgelösten Zellen fünf Minuten lang bei 200 G heruntergeschleudert haben. Reus suspendiert das Zellpellet bei 4,17 mal 10 zu den sechs Zellen pro Milliliter in der Haut.

Rekonstruieren Sie das Medium eins, nachdem die Keratinozyten entnommen wurden. Trypsin eist menschliche Melanozyten für ein bis zwei Minuten. Auch hier wird das Trypsin mit Soja-Trypsin-Inhibitor neutralisiert.

Nachdem Sie die Zellen unter den gleichen Bedingungen wie zuvor heruntergeschleudert haben, resuspendieren Sie das Melanozyten-Pellet mit 8,3 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter in der Haut. Rekonstruieren Sie auch das Medium. Entfernen Sie anschließend das Waschmedium sowohl von der Innen- als auch von der Außenseite jedes Einsatzes einer für die Hautschicht vorbereiteten Gewebekulturschale.

Ersetzen Sie das Waschmedium, indem Sie 1,5 Milliliter Haut hinzufügen, rekonstruieren Sie das Medium, einen nach innen und 10 Milliliter nach außen. Mischen Sie dann 600 Mikroliter der Keratinozyten-Zellsuspension mit 600 Mikrolitern der Melanozyten-Suspension. Geben Sie 200 Mikroliter der gemischten Zellsuspension ab.

Tropfen für Tropfen auf die Innenseite jeder Einlage. Inkubieren Sie die Gewebekulturschale zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius. Nachdem Sie die Zellen inkubiert haben, aspirieren Sie die Haut, rekonstruieren Sie Medium eins sowohl von der Innen- als auch von der Außenseite jedes Einsatzes und fügen Sie dann zwei Milliliter Haut hinzu, rekonstruieren Sie das Medium, zwei nach innen und 10 Milliliter nach außen.

Dann inkubieren Sie die Rekonstruktionen für weitere zwei Tage bei 37 Grad Celsius. Nach der zweiten zweitägigen Inkubation aspirieren Sie die Haut, rekonstruieren Sie Medium zwei von der Innen- und Außenseite jedes Einsatzes. Geben Sie nun 7,5 Milliliter der Haut hinzu, rekonstruieren Sie Medium drei nur an der Außenseite der Einsätze.

Lege die Rekonstruktionen zurück in den Inkubator und wechsle die Haut. Rekonstruieren Sie Medium drei jeden zweiten Tag bis zum 18. Tag. Am 18. Tag der Inkubation wird das Medium von innen und außen aus den Einsätzen einer mit Hautrekonstruktion beladenen Gewebekulturschale aspiriert.

Entfernen Sie die Einsätze mit einer Pinzette aus dem Tablett. Schneide das Konstrukt inklusive des Polycarbonat-Filters aus, indem du mit einer Skalpellklinge einen Kreis nahe dem Rand nachzeichnest. Legen Sie dann die Rekonstruktion im Filter auf eine harte Unterlage und schneiden Sie sie mit der Klinge in zwei Hälften.

Legen Sie eine Hälfte der Rekonstruktion auf ein schwarzes TBS-Biopsiepapier und legen Sie das Papier dann in eine Histologiekassette. Weichen Sie die gesamte Kassette mehr als vier Stunden lang in 10% Formalin ein. Legen Sie dann die Kassette in 70%Ethanol und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius, bis Sie bereit sind, die Rekonstruktion für die Paraffineinbettung zu verarbeiten.

Die andere Hälfte der Rekonstruktion für ein bis zwei Stunden in 50%ige Saccharose bei vier Grad Celsius legen. Tauschen Sie dann die Saccharose gegen zwei Molare aus und lagern Sie sie dann bei vier Grad Celsius für weitere ein bis zwei Stunden. Füllen Sie eine Grundform zur Hälfte mit optimaler Schnitttemperatur, Gefriermedium oder OCT.

Vermeiden Sie Blasen. Fassen Sie den Rand der Rekonstruktion mit einer Pinzette und entfernen Sie die Rekonstruktion aus der Saccharose. Legen Sie es auf die Kim-Tücher, bis die Saccharose absorbiert ist.

Übertragen Sie die Rekonstruktion mit einer Pinzette und einem Spatel in das Boot auf dem OCT. Decken Sie die Oberseite der Rekonstruktion mit mehr OCT ab, bis das Boot vollständig gefüllt ist. Auch hier gilt: Blasen vermeiden.

Stellen Sie das Boot gleichmäßig auf zerstoßenes Trockeneis, damit das OCT vollständig einfrieren kann. Wickeln Sie dann die Grundform und die Folie ein und lagern Sie sie bei minus 70 Grad Celsius, bis Sie bereit sind, sie mit einem Kryostaten zu schneiden. Um die Transplantation einer Hautrekonstruktion an einer Maus vorzubereiten, füllen Sie einen Behälter mit flüssigem Stickstoff und geben Sie fünf Milliliter DMEM in ein 50-Milliliter-Röhrchen.

Füllen Sie ein Becherglas mit 600 Millilitern Leitungswasser und stellen Sie das Becherglas zum Erwärmen auf eine Kochplatte. Wählen Sie dann eine weibliche, kufenhafte, haarlose, ausgezüchtete Maus im Alter von etwa sechs Wochen aus. Nach der Betäubung der Maus mit Fluor.

Verwenden Sie einen Nasenkonus, um die Anästhesie während des gesamten Eingriffs aufrechtzuerhalten. Tragen Sie steriles ophthalmisches Gleitmittel auf und sorgen Sie für Wärmeunterstützung, um Unterkühlung zu verhindern. Reinigen Sie anschließend die Maushaut mit zusammengesetzter Benzoe-Tinktur und Alkoholvorbereitungstupfern.

Markieren Sie eine Linie auf dem Rücken der Maus, um die gleiche Position für das spätere Nähen beizubehalten. Schneiden Sie mit einer Irisschere und einer Pinzette ein rundes Wundbett auf den Rücken der Maus und decken Sie das Wundbett dann mit sterilen Mullschwämmen ab. Legen Sie die runde Maushaut in die 50 Milliliter Tube DMEM.

Tauchen Sie das Röhrchen in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff, bis das gesamte Medium und das Gewebe vollständig gefroren sind. Tauen Sie dann das Rohr in einem Becherglas mit heißem Wasser auf, bis es vollständig aufgetaut ist. Wiederholen Sie dies, frieren Sie den Vorgang ein und tauen Sie ihn dreimal auf.

Verwenden Sie eine chirurgische Klinge, um eine Hautrekonstruktion von einem Einsatz zu lösen. Entfernen Sie die Membran sehr vorsichtig und übertragen Sie dann die Hautrekonstruktion auf die Oberseite des Mäusewundbetts. Legen Sie nun die Maushaut auf die Hautrekonstruktion.

Stellen Sie sicher, dass sich die erste Naht auf dem zuvor beschrifteten Marker und die zweite auf der Unterseite befindet. Verwenden Sie dann zwei weitere Nähte an den Seiten der Haut, um die Maushaut zu fixieren. Reinigen Sie die Maushaut nach der Transplantation und setzen Sie die Maus dann in einen neuen Käfig.

Am Tag 18. Die Epidermis der Hautrekonstruktionen besteht aus geschichteten Keratinozytenschichten, die undifferenzierte Basalschicht und die sequentiell differenzierten Schichten sind vertikal orientiert. Färbung des Rekonstruktionsabschnitts mit dem melanozytären Marker.

S 100, wie durch die schwarzen Pfeile angedeutet, zeigt, dass die Melanozyten in der Basalschicht der Epidermis ausgerichtet sind und über Dendritenfortsätze mit mehreren Keratinozyten kommunizieren. Das dermale Kompartiment enthält Fibroblasten, die in eine Kollagenmatrix vom Typ 1 eingebettet sind, abgelagertes Kollagen vier zeigt die Basalmembran an, die die Epidermis von der Dermis trennt. Die folgenden Abbildungen veranschaulichen, wie sich mehrere Schichten von Keratinozyten in der Epidermis entwickeln.

Wenn dermale Stammzellen, die mit einem GFP-lentiviralen Vektor markiert sind, mit Fibroblasten eingebettet sind. In einer Kollagen-Typ-1-Matrix wandern sie in die Epidermis und differenzieren sich am fünften Tag zu Melanozyten. Nach der Aussaat von Keratinozyten beginnen einzelne Zellen aus den Kugeln zu wandern.

Beachten Sie, dass die Epidermis immer noch aus einer einzigen Schicht besteht. Am achten Tag. Einige Zellen erreichen die Grenzfläche der Epidermis.

Am Tag 10 sind GFP-positive Zellen eng an der Position der Basalmembran ausgerichtet, wie hier zu sehen ist. Migrierte GFP-positive Zellen in der Epidermis exprimieren den melanozytären Marker HMB 45. Wenn verschiedene Stadien von Melanomzelllinien in Hautrekonstruktionen eingebaut werden, spiegelt das Verhalten der Zellen ihre in vivo Eigenschaften wider.

Hier sind in dieser Abbildung normale Melanozyten und Melanomzellen zu sehen, die in 2D-Kulturen gezüchtet wurden. Die Lage und die Wachstumsrate normaler Melanozyten werden in Hautrekonstruktionen, wie hier zu sehen, streng kontrolliert, radiale Wachstumsphase, primäre Melanome proliferieren überwiegend in der Epidermis, während Melanome in der vertikalen Wachstumsphase invasiv in die Dermis wachsen, wie in dieser Abbildung zu sehen ist. Schließlich ist hier die Art und Weise zu sehen, wie metastasierende Melanome aggressiv tief in die Dermis eindringen.

Unsere Studien an normaler Haut bilden die Grundlage für ein besseres Wissen über die Entstehung und den Verlauf von Melanomen.