Entwicklung von Zell-spezifischen Anti-HIV-gp120-Aptamere für siRNA

Das übergeordnete Ziel der folgenden Experimente besteht darin, mithilfe einer Nitrocellulosemembran RNA-Aptamere in vitro für das HIV-1-GP-120-Protein zu erzeugen. Dies wird durch PCR und anschließende in-vitro-T7-Transkription erreicht. Um die anfängliche DNA- und zufällige RNA-Bibliothek vorzubereiten, wird im zweiten Schritt das Gemisch aus Zielprotein und RNA-Bibliothek auf einen vorbenetzten Nitrocellulosefilter aufgetragen, wodurch eine Isolierung gebundener RNA-Moleküle von ungebundenen RNA-Spezies ermöglicht wird.

Nach 12 Selektionszyklen wird die RNA-Bibliothek geklont und sequenziert, um die einzelnen RNA-Aptamer-Kandidaten aus der Bibliothek zu identifizieren. Es werden Ergebnisse erzielt, die mehrere neue Aptamere mit nanomolarer Affinität identifizieren, basierend auf Gelverschiebeassays und konfokaler Mikroskopie. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie BETs oder säulenbasierten Isolierungsverfahren liegt in ihrer Einfachheit und dem Fehlen einer Vorbehandlung des Proteins oder der Bibliotheken, wie beispielsweise der Immobilisierung des Proteins auf der Base. Die RNA-Bibliothek zur Isolierung von anti-HIV-GP120-RNA-Aptameren wird aus einer kommerziell synthetisierten DNA-Bibliothek vorbereitet, die 50 Nukleotide mit zufälligen Sequenzen enthält.

Die Einzelstrang-DNA-Oligo-Bibliothek hat eine Länge von 81 Nukleotiden. Wie in diesem Diagramm dargestellt, ist der zufällige Bereich von konstanten Bereichen flankiert, einem 30-Tumor am Fünf-Prim-Ende und einem 16-MA am Drei-Prim-Ende. Die konstanten Bereiche enthalten den T-sieben-Promotor für die In-vitro-Transkription sowie einen Drei-Prim-Tag für die R-T-P-C-R.

Amplifizieren Sie die einzelsträngige DNA-Oligo-Zufallsbibliothek mittels PCR, wobei die PCR auf 10 Zyklen begrenzt wird, um die Häufigkeit der ursprünglichen DNA-Bibliothek zu erhalten. Nach den PCR-Reaktionen wird der amplifizierte doppelsträngige DNA-Pool mithilfe eines Gele-Reinigungs-Kits gewonnen. Die doppelsträngige DNA wird anschließend gemäß den Herstelleranweisungen unter Verwendung des cript-Kits in eine RNA-Bibliothek umgewandelt, wobei im Transkriptionsreaktionsgemisch CTP und UTP durch zwei Fluoropyrimidine, CTP und zwei Fluoropyrimidin-UTP, ersetzt werden, um ribonuklease-resistente RNA herzustellen.

Wenn die Transkriptionsreaktionen abgeschlossen sind, verdauen Sie die Ansätze mit DS one, um die Vorlagen-DNA zu entfernen, und reinigen Sie mittels eines 8 %igen Polyacrylamid-Gels mit sieben Molar Harnstoff. Quantifizieren Sie anschließend die gereinigte RNA-Bibliothek durch UV-Spektroskopie. Vor der Selektion von Optimas bereiten Sie die erforderlichen Puffer vor und lagern Sie bei den entsprechenden Temperaturen.

Puffer für Heaps bei Raumtemperatur und Puffer für das RNA-Umfalten und die RNA-Bindung bei minus 20 Grad Celsius. Bevor der erste Selektionszyklus beginnt, präinkubieren Sie den zufälligen RNA-Pool mit einem vorbenetzten Nitrocellulosefilter bei Raumtemperatur für 30 Minuten, um unspezifische Bindungen an den Filter zu minimieren. Nach 30 Minuten entfernen Sie den Nitrocellulosefilter.

Vermischen Sie die vorgereinigte zufällige RNA-Pool mit dem HIV-einem-Darm-GP-eins-20-Protein in einem RNA-Bindungspuffer mit niedrigem Salzgehalt und inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einer rotierenden Plattform. Danach leiten Sie die Reaktion durch einen vorbenetzten Nitrocellulosefilter und waschen diesen mit einem Milliliter RNA-Bindungspuffer mit niedrigem Salzgehalt, um die gebundene RNA vom Filter zu eluieren. Entfernen Sie die Nitrocellulosemembran aus dem Filterhalter.

Fügen Sie 200 Mikroliter Eluierpuffer zur Membran hinzu und erhitzen Sie ihn bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten. Nachdem die RNA aus dem Filter eluiert wurde, zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz, überführen Sie die RNA-Lösung in ein neues Röhrchen und führen Sie eine Phenol-Chloroform-Extraktion am Eluat durch. Verwenden Sie eine MicroCon YM 30-Säule, um die RNA zu konzentrieren, und eluieren Sie die gewonnene RNA mit 20 Mikrolitern RNA-freiem Wasser.

Der gewonnene RNA-Pool wird anschließend revers transkribiert und für 15 Zyklen mittels PCR amplifiziert. Nach der Reinigung des amplifizierten doppelsträngigen Pools wird dieser wie zuvor gezeigt in einen neuen RNA-Pool transkribiert, bevor die nächste Selektionsrunde beginnt. Den RNA-Pool in einmaligem HBS-Puffer umfalten, auf 95 Grad Celsius für drei Minuten erhitzen und dann langsam auf 37 Grad Celsius abkühlen lassen.

Die Inkubation bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten fortsetzen. Die umgefaltete RNA adsorbieren und 30 Minuten lang auf einen Nitrocellulosefilter ziehen, bevor die Inkubation mit dem Ziel-HIV-Darm-GP120-Protein für die nächste Selektionsrunde erfolgt. Um die APTAMERE mit höherer Bindungsaffinität erfolgreich zu erhalten, muss die Selektionsstringenz durch Anpassung der Selektionsbedingungen sorgfältig kontrolliert werden.

Die Selektionsbedingungen sind in dieser Tabelle dargestellt. Für die Cellex-Runden eins bis vier inkubieren Sie den vorgereinigten RNA-Pool mit dem Zielprotein in RNA-Bindepuffer mit niedrigem Salzgehalt für 30 Minuten. Ab der vierten Cellex-Runde verwenden Sie RNA-Bindepuffer mit hohem Salzgehalt, während Cellex fortschreitet.

Verringern Sie die Menge an HIV-1-GP120-Protein und erhöhen Sie die Menge an konkurrierender Hefe-tRNA, um die Stringenz der Aptamer-Selexion in jedem Zyklus zu erhöhen. Der Fortschritt der HIV-1-GP120-Optima-Selexion wird mittels eines Filterbindungstests überwacht. In diesem Video werden die 12 RNA-Pools, die nach allen Selektionszyklen gesammelt wurden, analysiert.

Entfernen Sie zunächst das initiierte fünfstellige Triphosphat, indem Sie jeden RNA-Pool eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit Kälberdarmphosphatase behandeln. Um die CIP-behandelte RNA für die Markierung mit T4-Polynukleotidkinase und P32-80p vorzubereiten, erhitzen Sie sie fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius, gefolgt von einer Abkühlung auf Eis. Die Markierung der RNA erfolgt in einem speziellen Raum für Experimente mit Radioaktivität in PNK-Puffer, T4-Polynukleotidkinase, einem Mikroliter Gamma-P32-ATP und Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern. Inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Nach 30 Minuten 20 Mikroliter Wasser zu jeder Reaktion hinzufügen und über eine G-50-Säule reinigen. Schließlich 40 Mikroliter markierte RNA in einer Endkonzentration von 250 Nanomolar erhalten, jede markierte RNA-Probe in einmaligem HBS-Puffer auf 95 Grad Celsius für drei Minuten erhitzen. Danach auf 37 Grad Celsius abkühlen lassen, was 30 bis 40 Minuten dauert.

Setzen Sie die Inkubation bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten fort. Führen Sie, sobald der RNA-Pool umgefaltet wurde, eine 100-Mikroliter-Bindungsreaktion durch. Kombinieren Sie den endmarkierten RNA-Pool mit GP one 20 Protein und einem zehnfachen molaren Überschuss an unspezifischem Kompetitor tRNA in RNA-Bindungspuffer mit hohem Salzgehalt und inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur.

Am Ende der 30 Minuten trennen Sie 50 Mikroliter der Bindungsreaktion mittels eines vorbenetzten Nitrocellulosefilters. Waschen Sie anschließend den Filter mit zwei Millilitern Bindungspuffer und zählen Sie die auf dem Filter zurückgehaltene Radioaktivität unter Verwendung eines vielseitigen Szintillationszählers als Eingabekontrollwert. Gleichzeitig wurden die verbleibenden 50 Mikroliter der Bindungsreaktion sowie der Bindungsassay des RNA-Pools nach jedem Selektionszyklus durch einen Filterbindungsassay mit kompetitivem tRNA analysiert, um den Fortschritt von HIV-1, GP-120 zu überwachen.

Die Bindungsaktivitäten von Optima wurden als Prozentsatz der auf der Membran in Form eines Protein-RNA-Komplexes zurückgehaltenen Eingangs-RNA berechnet, wie hier gezeigt. Die anfängliche RNA-Pool zeigt lediglich 0,1 % der eingesetzten RNA, die auf der Membran zurückgehalten wird. Nach neun Selektionsrunden weist jedoch die neunte RNA-Bibliothek 9,72 % der gebundenen Eingangs-RNA auf.

Obwohl zusätzliche Selektionsrunden durchgeführt wurden, ist keine weitere Anreicherung zu beobachten, was darauf hindeutet, dass die maximale Bindung des RNA-Pools erreicht wurde. Die Bindungsaktivitäten der RNA-Pools wurden durch Elektrophoretische Mobilitätsverschiebeassays weiter bestätigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass einige Liganden mit hoher Bindungsspezifität für das Zielprotein in diesen RNA-Pools erfolgreich angereichert wurden.

In diesem Beispiel wies der 12. RNA-Pool die höchste Bindungsaktivität auf, da nach der 12. Selektionsrunde die maximale Bindung des RNA-Pools erreicht war. Dieser RNA-Pool wurde revers transkribiert in cDNA, die anschließend mittels PCR amplifiziert wurde. Das PCR-Produkt wurde dann gereinigt und in einen TA-Klonierungsvektor eingebaut, woraufhin nach der Alignierung von 140 Klonen die Sequenzierung erfolgte. Es wurden sechs Gruppen von anti GP one 20 Optimas identifiziert.

Nur die zufälligen Sequenzen der Aptima-Kernregionen sind in dieser Tabelle angegeben. Etwa 40 % der Klone enthalten eine konservierte Sequenz. Aufgrund ihres relativen Vorkommens innerhalb ihrer Gruppe wurde je eine repräsentative Sequenz aus jeder Gruppe für die weitere Charakterisierung ausgewählt; mittels eines nativen Gelaufwandsverschiebeassays wurden die Dissoziationskonstanten KD dieser repräsentativen Apts berechnet, beispielsweise A eins.

Das beste der Abers weist einen scheinbaren KD-Wert von 52 Nanomolar auf. Wie hier gezeigt. Diese ausgewählten Abers können selektiv an das Ziel-HIV-1-Bowel-GP-120 binden, jedoch nicht an das H-I-V-G-P-120-CM-Protein. CHO-G-160-Zellen, die stabil das HIV-Hüllglykoprotein GP-160 exprimieren, wurden zur Untersuchung der Bindung und Internalisierung der ausgewählten anti-GP-120-Optimas verwendet.

Diese Zellen verarbeiten GP160 nicht zu GP120 und G41, da ihnen die vom gag kodierten Proteasen fehlen, die für die Hüllproteinaufarbeitung erforderlich sind. Die Durchflusszytometrie-Analyse zeigt, dass die mit S3 markierten Abers spezifisch an die CHO-GP160-Zellen binden, jedoch nicht an die Kontrollzellen CHO-EE, die GP160 nicht exprimieren. Darüber hinaus weist die Echtzeit-Lebendzell-Mikroskopie mit Z-Achsen-Konfokaltechnik darauf hin, dass das mit SI3 markierte Aptamer nach zweistündiger Inkubation selektiv von den CHO-GP160-Zellen aufgenommen wird, nicht jedoch von den CHO-EE-Kontrollzellen. Es wurde außerdem beobachtet, dass sich das Aptamer im Zytoplasma anreichert, was darauf hindeutet, dass das GP120-Aptamer möglicherweise über eine rezeptorvermittelte Endozytose in die Zellen eindringt.

Am Ende dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man feldbasierte Methoden zur Isolierung von RNA-Abers verwendet.