Name: Entwicklung von Zell-spezifischen Anti-HIV-gp120-Aptamere für siRNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Lernen Sie die SELEX-basierte Isolierung von RNA-Aptameren gegen HIV-1 gp120 mit Nitrozellulosefiltern. Diese Methode ermöglicht die Entwicklung zielgerichteter Aptamer-siRNA-Chimären für antivirale Therapien.

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Wir bedanken uns bei Britta Hoehn, Guihua Sun, Harris Soifer und Lisa Scherer für hilfreiche Diskussionen. Die CHO-EE-und CHO-Zellen gp160: Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health AI29329 und HL07470 verliehen Folgende Reagenzien JJR wurden durch die NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH erhalten Unterstützung Linie, die pNL4-3 luc-Vektor; HIV-1 BaL gp120 aus DAIDS, NIAID.

<ol><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Robertson, D. L., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+in+vitro+of+an+RNA+enzyme+that+specifically+cleaves+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA.</a> Nature. 344, 467-468 (1990).</li>
<li>Fitzwater, T., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SELEX+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A SELEX primer.</a> Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).</li>
<li>Weiss, C. D., White, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+stable+Chinese+hamster+ovary+cells+expressing+wild-type%2C+secreted%2C+and+glycosylphosphatidylinositol-anchored+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein.</a> J Virol. 67, 7060-706 (1993).</li>
<li>Vodicka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indicator+cell+lines+for+detection+of+primary+strains+of+human+and+simian+immunodeficiency+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses.</a> Virology. 233, 193-198> (1997).</li>
<li>Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection%2C+characterization+and+application+of+new+RNA+HIV+gp+120+aptamers+for+facile+delivery+of+Dicer+substrate+siRNAs+into+HIV+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li>
<li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+biology+of+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The chemical biology of aptamers.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).</li>
<li>Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aptamers+and+aptazymes+in+biotechnology%2C+diagnostics%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy.</a> Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).</li>
<li>Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+mediated+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Aptamer mediated siRNA delivery.</a> Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).</li>
<li>McNamara, J. O., 2nd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+delivery+of+siRNAs+with+aptamer-siRNA+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras.</a> Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).</li>
<li>Dassie, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+optimized+aptamer-siRNA+chimeras+promotes+regression+of+PSMA-expressing+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors.</a> Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+cell-internalizing+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers.</a> Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dual+inhibitory+function+aptamer-siRNA+delivery+system+for+HIV-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy.</a> Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).</li>
</ol>

J. R und JZ haben ein zum Patent angemeldetes auf &quot;Cell-spezifischen Aptamer-siRNA-System für HIV-1-Therapie&quot;. USPTO, Nr.<strong&gt; 12/328994</strong&gt;, Datum der Veröffentlichung: 11. Juni 2009.

Aptamere sind in vitro entwickelt Nukleinsäuren, die spezifische und stabile dreidimensionale Formen annehmen, wodurch eine sehr spezifische, enge Bindung an gezielten Moleküle 8. Die niedrigen nanomolaren Bindungsaffinität und exquisite Spezifität der Aptamere, um ihre Ziele machen vielseitige Werkzeuge für Diagnose, Bildgebung in vivo, und Therapeutika 9. Mit dem Aufkommen der Aptamer-Technologie zur gezielten siRNA Anlieferung ist es nun möglich, die Aptamer-Bindung-Funktion fü...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> MF-Millipore Membranfilter </td><td> Millipore </td><td> HAWP01300 </td><td> Porengröße 0,45 um </td></tr><tr><td> Swinnex Filterhalter </td><td> Millipore </td><td> SX0001300 </td><td> 13 mm Durchmesser </td></tr><tr><td> QIAquick Gel Extraction Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28706 </td><td> DNA-Aufreinigung </td></tr><tr><td> Microcon YM-30 Säule </td><td> Millipore </td><td> 42410 </td><td> RNA-Konzentration </td></tr><tr><td> Bio-Spin-30 Säulenvolumina </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6250 </td><td> RNA-Reinigung </td></tr><tr><td> Taq PCR-DNA-Polymerase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1806 </td><td></td></tr><tr><td> ThermoScript RT-PCR-System </td><td> Invitrogen </td><td> 11146-024 </td><td></td></tr><tr><td> DuraScribe T7 Transkription Kit </td><td> EpiCentre </td><td> DS010925 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP für PCR </td><td> Roche </td><td> 1 581 295 </td><td></td></tr><tr><td> Ribonukleinsäure, Transfer vom E.coli </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R1753 </td><td> tRNA Wettbewerber </td></tr><tr><td> HIV-1 Ba-L gp120-Protein </td><td> die AIDS-Forschung und Referenzreagens Programm </td><td> 4961 </td><td> Zielprotein </td></tr><tr><td> Silencer siRNA Labeling Kit - Cy3 </td><td> Ambion </td><td> 1632 </td><td></td></tr><tr><td> Saure Phenol / Chloroform 5 / 1 Lösung (pH 4,5) </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td><td></td></tr><tr><td> Chloroform / Isopropanol 24 / 1 Lösung </td><td> Sigma </td><td> C0549 </td><td></td></tr><tr><td> Kalbsdarmphosphatase (CIP) </td><td> New England Biolab </td><td> M0290L </td><td></td></tr><tr><td> T4-Polynukleotid-Kinase </td><td> New England Biolab </td><td> M0201L </td><td></td></tr><tr><td> Glykogen </td><td> Roche </td><td> 10 901 393 001 </td><td> RNA Niederschläge </td></tr><tr><td> Gamma-P 32-ATP </td><td> MP Biomedical </td><td> 013502002 </td><td> Radiactivity </td></tr><tr><td> 40% AccuGel 19.01 </td><td> National Diagnostics </td><td> EC-850 </td><td></td></tr><tr><td> 10xTBE </td><td> National Diagnostics </td><td> EC-860 </td><td></td></tr><tr><td> N, N, N, N&#39;-Tetramethylethylendiamin (TMEMD) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9281 </td><td></td></tr><tr><td> Ammoniumpersulfat (APS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3678 </td><td></td></tr><tr><td> L-methioine Sulfoximin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5379-250 mg </td><td></td></tr><tr><td> RPMI Medien 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11835-030 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydrogencarbonat-Lösung, 7,5% w / v </td><td> Invitrogen </td><td> 25080-094 </td><td></td></tr><tr><td> Minimum Essential Medium (MEM) (10 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11430-030 </td><td></td></tr><tr><td> MEM nicht essentielle Aminosäure (100 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> TA Cloning-Kit mit pCR 2.1 </td><td> Invitrogen </td><td> K2040-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

entwicklung von zell-spezifischen anti-hiv-gp120-aptamere für sirna

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

Die globale Epidemie der HIV-Infektion hat ein dringender Bedarf für neue Klassen von antiretroviralen Wirkstoffen erstellt. Die starke Fähigkeit von small interfering (si) RNAs, die Expression der komplementären RNA-Transkripte verhindern wird als eine neue Klasse von Therapeutika für eine Vielzahl von Krankheiten, einschließlich HIV ausgenutzt. Viele frühere Berichte haben gezeigt, dass neue RNAi-basierte anti-HIV/AIDS therapeutische Strategien sehr vielversprechend sind, jedoch ist ein zentrales Hindernis für die erfolgreiche therapeutische Anwendung und klinische Umsetzung von siRNAs effiziente Lieferung. Besonders, wenn man die Sicherheit und Wirksamkeit von RNAi-basierten Therapeutika, ist es höchst wünschenswert, um eine gezielte intrazelluläre siRNA Ansatz für spezifische Zellpopulationen oder Geweben entwickeln. Die HIV-1 gp120-Protein, einem Glykoproteinumhüllung auf der Oberfläche des HIV-1, spielt eine wichtige Rolle in Eindringen des Virus in CD4-Zellen. Die Interaktion von gp120 und CD4, dass HIV-1-Eintrag löst und initiiert Zellfusion wurde als klinisch relevant anti-virale Strategie für die Wirkstoffforschung validiert. Im Folgenden stellen wir zunächst besprechen die Auswahl und Identifizierung von 2&#39;-F modifiziert Anti-HIV-gp120 RNA-Aptameren. Mit einem herkömmlichen Nitrocellulosefilter SELEX-Methode wurden mehrere neue Aptamere mit nanomolaren Affinität von einem 50 zufällige nt RNA-Bibliothek isoliert. Um erfolgreich zu erhalten gebundenen Spezies mit höherer Affinität, ist die Auswahl Stringenz sorgfältig durch Einstellen der Bedingungen gesteuert. Die selektierten Aptamere spezifisch binden können und schnell in Zellen, die das HIV-1 Hüllprotein internalisiert werden. Darüber hinaus können die Aptamere allein neutralisieren HIV-1 Infektiosität. Basierend auf den besten Aptamer A-1, erstellen wir auch einen neuartigen dualen hemmende Funktion anti-gp120 Aptamer-siRNA-Chimäre, in denen sowohl die Aptamer und die siRNA Teile haben starke anti-HIV-Aktivitäten. Darüber hinaus nutzen wir die gp120 Aptamer-siRNA Chimären für die Zell-spezifische Auslieferung der siRNA in HIV-1 infizierten Zellen. Diese Doppelfunktion Chimäre zeigt ein erhebliches Potenzial für die Kombination von verschiedenen Nukleinsäure-Therapeutika (Aptamer-und siRNA) in der Unterdrückung von HIV-1-Infektion, so dass die Aptamer-siRNA Chimären attraktive therapeutische Kandidaten für Patienten, bei denen hochaktive antiretrovirale Therapie (HAART).

Mehrere 2&#39;-Fluoro RNA-Aptamere gegen HIV-1Ba-L gp120 mit Nanomol Affinität von einer RNA-Bibliothek isoliert durch<em&gt; In-vitro-</em&gt; SELEX Verfahren. Ein neuer Dual-hemmende Funktion anti-gp120 Aptamer-siRNA-Chimäre wird erstellt und zeigt viel versprechend für die systemische Anti-HIV-Therapie.

Entwicklung von Zell-spezifischen Anti-HIV-gp120-Aptamere für siRNA

Die globale Epidemie von HIV-Infektionen hat einen dringenden Bedarf an neuen Klassen antiretroviraler Wirkstoffe geschaffen. Die starke Fähigkeit kleiner interferierender ...

Das übergeordnete Ziel der folgenden Experimente besteht darin, mithilfe einer Nitrocellulosemembran RNA-Aptamere in vitro für das HIV-1-GP-120-Protein zu erzeugen. Dies wird durch PCR und anschließende in-vitro-T7-Transkription erreicht. Um die anfängliche DNA- und zufällige RNA-Bibliothek vorzubereiten, wird im zweiten Schritt das Gemisch aus Zielprotein und RNA-Bibliothek auf einen vorbenetzten Nitrocellulosefilter aufgetragen, wodurch eine Isolierung gebundener RNA-Moleküle von ungebundenen RNA-Spezies ermöglicht wird.Nach 12 Selektionszyklen wird die RNA-Bibliothek geklont und sequenziert, um die einzelnen RNA-Aptamer-Kandidaten aus der Bibliothek zu identifizieren. Es werden Ergebnisse erzielt, die mehrere neue Aptamere mit nanomolarer Affinität identifizieren, basierend auf Gelverschiebeassays und konfokaler Mikroskopie. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie BETs oder säulenbasierten Isolierungsverfahren liegt in ihrer Einfachheit und dem Fehlen einer Vorbehandlung des Proteins oder der Bibliotheken, wie beispielsweise der Immobilisierung des Proteins auf der Base. Die RNA-Bibliothek zur Isolierung von anti-HIV-GP120-RNA-Aptameren wird aus einer

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Das Verständnis der Konformationen von viralen Oberflächenantigenen ist erforderlich, um die Antikörperneutralisierung zu bewerten und das Design wirksamer Impfstoffimmunogene zu leiten. In dieser Arbeit beschreiben wir einen zellbasierten ELISA-Assay, der es ermöglicht, die Erkennung von trimerem HIV-1-Env, das an der Oberfläche transfizierter Zellen exprimiert wird, durch spezifische Anti-Env-Antikörper zu untersuchen.

Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine ​​mit eine Handy-basierte ELISA-Test

Hier, um einen Proof-of-Prinzip zweiwertigen Adenovirus Typ 5 (Ad5) Vektor zu erzeugen präsentieren wir ein Protokoll Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 durch Verwendung des Antigen Capsid-Incorporation Strategie. Dieser Vektor wurde gezeigt qualitative Fitness aufweisen, um die Fähigkeit Ad5-positiven Seren in vitro und die Antigenität als auch die Immunogenität für die zugesetzten Antigene zu entkommen.

Unter Verwendung der Antigen Capsid-Incorporation Strategie für die Förderung der Adenovirus-Serotyp 5-Vectored Vaccine Approaches

Methoden zur Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNA-Molekülen, die auf Postintegrationsschritte des HIV-1-Replikationszyklus abzielen, werden beschrieben. Diese Methoden sind nützlich, um neue Moleküle zu screenen und das Format bestehender Moleküle zu optimieren.

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Ein modularer Ansatz für die Synthese von N- Glykanen zur Befestigung an einer Aluminiumoxid-beschichtete Glas schieben (ACG Folie) wie ein Glycan Microarray entwickelt wurde und seine Verwendung für die Profilerstellung für eine HIV weitgehend neutralisierende Antikörper nachgewiesen.

Chemo-enzymatische Synthese von N- Glykanen für Array-Entwicklung und HIV-Antikörper-Profiling

Wir beschreiben eine zellbasierte Assays auf HIV-1 Fusion über den Ausdruck von grün fluoreszierendes Protein nachweisbar durch Flow-zytometrie oder Fluoreszenz-Mikroskopie melden. Es kann verwendet werden, Inhibitoren der viralen Eintrag (speziell bei der Fusion Schritt) in zellfreien und Zell-Zell-Infektion Systeme zu testen.

Ein High-Throughput Cre-Lox aktiviert virale Membran Fusion Assay Ermittlung Inhibitoren der HIV-1 Virus Membranfusion

Hier wird eine detaillierte Methode zur Beschreibung der Reinigung, Umfaltung und Charakterisierung selbstassemblierender Protein-Nanopartikel (SAPNs) für die Impfstoffentwicklung beschrieben.

Herstellung von E. coli-exprimierenden selbstmontierenden Protein-Nanopartikeln für Impfstoffe, die eine trimerische Epitop-Präsentation erfordern

Das rekombinante Antikörperprotein, das in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-Zellen und monoklonalen Antikörpern, die mit der traditionellen Hybridomtechnologie hergestellt werden, exprimiert wird, kann das porcine Aminopeptidase N (APN)-Protein erkennen und daran binden.

Produktion von monoklonalen Antikörpern gegen Aminopeptidase N im Darmschleimhautepithel des Schweins

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von Neutralisationsepitopen auf antigenanzeigenden virusähnlichen Partikeln (VLPs) vor. Die Immunpräzipitation der aus dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) abgeleiteten VLPs erfolgt unter Verwendung von Hüllglykoproteinen-spezifischen monoklonalen Antikörpern, die an Protein G-konjugierte magnetische Kügelchen gekoppelt sind. Gefangene VLPs werden anschließend einer SDS-PAGE- und Western-Blot-Analyse unter Verwendung viraler...

Nachweis neutralisationsempfindlicher Epitope in Antigenen, die auf VLP-basierten Impfstoffen (Virus Like Particle) mit einem Capture-Assay angezeigt werden

Das Glykosylierungsmuster eines Antikörpers bestimmt seine klinische Leistung, so dass die industriellen und akademischen Bemühungen zur Kontrolle der Glykosylierung bestehen bleiben. Da typische Glykoengineering-Kampagnen zeit- und arbeitsintensiv sind, würde sich die Erstellung eines schnellen Protokolls zur Charakterisierung der Auswirkungen von Glykosylierungsgenen mittels transienter Silencing als nützlich erweisen.

Schnelles Antikörper-Glykoengineering in chinesischen Hamster-Eierstockzellen

Wir stellen ein Protokoll zur Verfügung, das im Allgemeinen auf die Auswahl von Aptameren angewendet werden kann, die nur an infektiöse Viren binden und nicht an Viren, die durch eine Desinfektionsmethode nicht infektiös gemacht wurden, oder an andere ähnliche Viren. Dies eröffnet die Möglichkeit, den Infektiositätsstatus in tragbaren und Schnelltests zu bestimmen.

In-vitro-Selektion von Aptameren zur Unterscheidung von infektiösen und nicht-infektiösen Viren

Lernen Sie die SELEX-basierte Isolierung von RNA-Aptameren gegen HIV-1 gp120 mit Nitrozellulosefiltern. Diese Methode ermöglicht die Entwicklung zielgerichteter Aptamer-siRNA-Chimären für antivirale Therapien.

Entwicklung von Zell-spezifischen Anti-HIV-gp120-Aptamere für siRNA

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