Einführung in die Ultraschall-gezielte Mikroblasen Zerstörung Technik

UTMD steht für ultrasound targetiertes Mikrobläschen. Die Zerstörung von UTMD kann verwendet werden, um die gezielte ortsspezifische Abgabe von bioaktiven Molekülen – einschließlich therapeutischer Gene – an Organe zu lenken, die für Ultraschall zugänglich sind, wie Herz und Leber. Bei der UTMD werden bioaktive Moleküle, wie negativ geladene Plasmid-DNA-Vektoren, die ein Gen der gewünschten Spezifität kodieren, an die kationischen Schalen von lipidhaltigen Mikrobläschen-Kontrastmitteln gebunden. Die an die Vektoren gebundenen Mikrobläschen können intravenös oder direkt in das linke Ventrikel des Herzens appliziert werden.

Bei größeren Tieren können sie auch über einen transkoronaren Katheter mit oder ohne Verweilzeit appliziert werden. Der anschließende Transport aus der Zirkulation in ein Zielorgan erfolgt optimal durch akustische Kavitation bei einer Resonanzfrequenz der Mikrobläschen. Es scheint wahrscheinlich, dass die durch die Zerstörung der Mikrobläschen erzeugte mechanische Energie vorübergehende Poren in oder zwischen den endothelialen Zellen der Mikrozirkulation des Zielbereichs entstehen lässt.

Aufgrund dieses Sauna-Parion-Effekts wird die Transfektions-Effizienz in und durch die endothelialen Zellen erhöht, und Transgen-exprimierende Vektoren können im umgebenden Zielgewebe abgelagert werden. Im Blutkreislauf verbleibende Plasmadna wird rasch durch Nukleasen im Blut abgebaut. Eine Aliquotprobe einer hergestellten Mikroblasen-Stammlösung enthält Glucose, gepufferte Kochsalzlösung mit Phosphat, Dioleoyl-Glycerol-Phosphatidylcholin und Dioleoyl-Glycerol drei.

Phosphatidyl-ethanolamin wird zunächst 15 Minuten bei 40 Grad Celsius inkubiert. Die erwärmte Mikrobläschenlösung wird anschließend in ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen überführt, das Glycerin und zwischen ein und zwei Milligramm gereinigte Plasmadna enthält, die einen Expressionskonstrukt für das Gen der Interesse codiert. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung wird bis zu einem Endvolumen von 500 Mikrolitern zugegeben.

Die Luft im Mikroröhrchen wird anschließend durch Octafluorpropan-Gas ersetzt. Das Mikroröhrchen wird dann 20 Sekunden lang kräftig in einem zahnmedizinischen Amalgamator geschüttelt. Vor der ersten Verwendung muss die Kalibrierung des Ultraschall-Mikroblasendetektors (UTMD) mit einer Frequenz von einem Megahertz durchgeführt werden, um einen korrekten mechanischen Index und eine korrekte Pulswiederholung sicherzustellen.

Ein untergetauchter Transducer mit einer Megahertz-Frequenz ist über einen Leistungsverstärker mit einem Funktionsgenerator verbunden. Der Transducer wird in einen mit Wasser gefüllten Plastikbehälter platziert, der direkt auf ein Hydrophon ausgerichtet ist, das über einen Ladungsverstärker mit einem Oszilloskop verbunden ist. Frequenz, Amplitude, Burstzyklus und Leistungsverstärkung des Signals können alle angepasst werden, um den geeigneten Tastgrad und den optimalen mechanischen Index für die Kavitation der Mikrobläschen zu erreichen. In diesem Aufbau wurde das System auf einen mechanischen Index kalibriert, der bei einer Mikrobläschenapplikation mit einem Megahertz einem Wert von etwa 1,3 entspricht, vor der Applikation von Mikrobläschen und UTMD. C57BL/6-Mäuse werden mit 100 Milligramm pro Kilogramm Ketamin und 5 Milligramm pro Kilogramm Xylazin über eine intraperitoneale Injektion anesthesiert.

Die Verabreichung von Mikrobläschen erfolgt intravenös durch eine direkte Injektion in den linken Ventrikel des Herzens oder über eine Katheterisierung der Schwanzvene, wobei im Folgenden die direkte Herzinjektion gezeigt wird. Ein Volumen von bis zu 100 Mikrolitern der mit Plasmid-DNA beladenen Mikrobläschenlösung wird mittels einer 30-Gauge-Nadel, die unter ultraschallgesteuerter Sicht in den vorderen vierten Interkostalraum eingeführt wird, in den linken Ventrikel des Herzens injiziert. Der aus der Injektion in den linken Ventrikel resultierende Bolus der Mikrobläschenlösung wird mithilfe eines hochfrequenten Ultraschallwandlers von Visual Sonic erfasst, der in einer stationären Position im langen Achsenschnitt auf dem Thorax der Maus platziert ist.

Unmittelbar nach der Injektion erfolgt die Zerstörung der Mikrobläschen für etwa fünf Minuten mithilfe eines zweiten, kleineren niederfrequenten Wandler mit 1,0 Megahertz, der direkt über dem gewünschten Zielorgan gehalten wird, um die Zerstörung auf diesen Bereich zu beschränken. Der Ultraschall wird an der Leber mit einer Impuls-Wiederholungsfrequenz von 1,0 Megahertz, einem mechanischen Index von etwa 1,3 bis 1,5 und einer Impuls-Wiederholungsperiode von 100 Millisekunden für jeweils 20 Zyklen appliziert. Alternativ kann der Impuls über das EKG der Maus gesteuert werden, wodurch jeweils ein Burst von drei Ultraschallbildern alle vier bis sechs Herzzyklen ausgelöst wird. Bei der Verabreichung der Mikrobläschen über die Schwanzvene wird die Maus auf die gleiche Weise anästhesiert wie bei einer Spritze, die das Plasmid enthält.

An DNA-gebundene Mikrobläschen wird ein Katheter für die Schwanzvene mit 27 G angeschlossen. Der Schwanzvenenkatheter wird in das distale Drittel entweder der rechten oder linken lateralen Vene eingeführt, die entlang des Schwanzes der Maus verläuft. Die Spritze mit den Mikrobläschen wird in eine Infusionspumpe eingesetzt, die automatisch ein einheitliches, vordefiniertes Volumen der Lösung über einen festgelegten Zeitraum verabreicht.

Die Biolumineszenz-Analyse von UTMD, der Wirksamkeit der durch UTMD vermittelten Plasmid-DNA-Übertragung, kann anhand verschiedener Methoden bewertet werden, abhängig von den in dem Konstrukt codierten Genen. Insbesondere die in vivo-Biolumineszenz-Bildgebung ist eine Methode, die es ermöglicht, das Vorhandensein und die Dauer der Genexpression zu überwachen. Bei Mäusen, die mit dem Plasmid transfiziert wurden, das ein Biolumineszenz-Reportergen wie Luciferase codiert.

Das Enogen-In-vivo-Bildgebungssystem wird für die Biolumineszenz verwendet. Bildaufnahmen werden normalerweise am ersten Tag nach der UTMD-vermittelten Transfektion von allen Mäusen angefertigt und alle drei bis vier Tage wiederholt, bis die Expression des Biolumineszenzgens mit dem System nicht mehr sichtbar nachweisbar ist. Zur Vorbereitung der Mäuse auf die biolumineszente Bildgebung erhalten die Tiere zunächst eine intraperitoneale Injektion des Luciferase-Reportersubstrats Lucifer.

Die Mäuse werden anschließend anästhesiert. Ungefähr drei Minuten später wird die Bioverteilung des Luciferin-Substrats etwa 10 Minuten lang fortgesetzt, bevor das oder die Tiere in die XenoGen-Bildgebungskammer platziert werden und während der Aufnahme eine Ganzkörperbildaufnahme durchgeführt wird. Die vom System erfassten Photonen, die aus der Luciferase-vermittelten Biolumineszenzreaktion emittiert werden, werden nach jeder Bildaufnahme bestimmt.

Mithilfe des Xeno-In-vivo-Bildgebungssystems wird die sichtbare lumineszierende Region von Interesse mit der Systemsoftware gemessen und quantifiziert.