Name: Oral Biofilm Analyse Palatal Expander durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung und konfokale Laser Scanning Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Lernen Sie die Analyse oraler Biofilme von Gaumensegmentern mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung und konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die dreidimensionale Visualisierung bakterieller Gemeinschaften.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von der Hygiene Fonds der Medizinischen Universität Graz unterstützt. Alle Probanden gaben ihre Einwilligung. Institutionelle Zustimmung des Studienprotokoll wurde von der Medizinischen Universität Graz erhalten.

1. Probengewinnung <ol><li> Entfernen Sie feste palatinale Expander nach 4 Monaten von intraoralen Service. Verwenden Sie NOLA Dry Field System die Geräte, bevor Sie sie (Abbildungen 1 und 2) zu isolieren. </li><li> Gebrauch sterilisiert Zangen, Handschuhen und Trays zu Expander ohne Zugabe von Verunreinigungen (Abb. 3 und 4) zu entfernen. </li><li> Shop-Objekte in Sarstedt 120 ml Fläschchen bei -20 ° C. Nehmen Sie zum Labor auf Eis und Verfahren innerhalb von 24 Stunden. </li></ol> 2. Biofilm Fixierung <ol><li> Abkratzen Biofilm Flocken mit einem sterilen Skalpell oder sammeln Stücke mit einer sterilen Pinzette. </li><li> Add eiskalte 4% PFA-Lösung bis die Probe gut bedeckt ist. </li><li> Inkubieren Sie die Mischung bei +4 ° C (nicht einfrieren!) Für 3 bis 12 Stunden. Längere Fixierung Zeiten oder höher Fixierung Temperaturen machen die Zellhüllen der gram-negativen Zellen weniger durchlässig für Oligonukleotid-Sonden. </li><li> Entfernen PFA-Lösung und Waschen mit eiskaltem 1X PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt 2-3 mal zu remove restliche PFA. </li><li> Resuspendieren der Probe in 1 vol. eiskaltes 1X PBS geben und 1 vol. eiskaltem 96% (v / v) Ethanol. </li><li> Lagern Sie die Proben bei -20 ° C. Proben fixiert nach diesem Protokoll kann für mehrere Monate bis Jahre gespeichert werden. </li></ol> 3. Die Dehydratisierung von festen Proben <ol><li> Übernehmen 5-30 ul der PFA-fixierten Probenmaterials auf einen Objektträger. </li><li> Trocken bei 46 ° C für ca. 15 min oder bei Raumtemperatur länger. Tauwetter das Lysozym und das Formamid. </li><li> Add 250 ul Lysozym (1mg/ml) bei Raumtemperatur für 10 min und erleichtert so das Eindringen der Sonden in den Zellen durch die teilweise Zerstörung der Zellwände. </li><li> Dip Abgleiten in 50%, 80% und 96% (v / v) Ethanol für jeweils 3 min. Die entwässernde Wirkung der Ethanol-Konzentration Serie wird zerfallen die Zellmembranen. </li><li> Trocknen Sie die Objektträger bei 46 ° C für 10 min. </li></ol> 4. In-situ-Hybridisierung <ol><li> Bereiten Sie 1 mlfrischen Hybridisierungspuffer (siehe Tabelle 1 für Konzentrationen). Formamid-Konzentrationen in dieser Studie verwendet: 10% (EUBmix), 20% (Bac303, POGI, MUT590) bzw. 45% (LGCmix). </li><li> Auftauen Oligonukleotidsonde Lösungen. Aufgetaute Sonden sollten auf Eis gehalten werden und vor Licht geschützt. </li><li> Add 2 ul jeder Sonde zu 200 ul Hybridisierungspuffer, gut mischen und wenden Sie die Mischung auf die dehydrierte Probe auf einen Objektträger. </li><li> Legen Sie ein Stück Seidenpapier in eine quadratische Petrischale und gießen Sie die verbleibenden Hybridisierungspuffer auf die Tissue-Papier. </li><li> Anschließend wird der Objektträger horizontal in die Schüssel, und schließen Sie die Schüssel. Inkubieren in einem Ofen bei 46 ° C für 1-5 Stunden (90 min wird in den meisten Fällen genügen). Das Gericht fungiert als einer feuchten Kammer verhindert Verdunstung Hybridisierungslösung aus der Folie. Insbesondere kann die Verdunstung von Formamid verursachen unspezifische Sonde Bindung an Nicht-Zielzellen. </li><li> Bereiten Sie 50 ml Waschpuffer (siehe Tabelle 2 für concentrations). Bereiten Sie den Waschpuffer in einem 50 ml-Tube und Vorwärmung bis 48 ° C in einem Wasserbad. Der Waschschritt wird bei 48 ° C durchgeführt </li><li> Entfernen Sie die Schale mit der Folie aus der Hybridisierungsofen. Sofort abwaschen Hybridisierungspuffer mit einem kleinen Volumen von vorgewärmten Waschpuffer, und übertragen Sie die Folie in den verbleibenden Waschpuffer. </li><li> Das Röhrchen mit dem Waschpuffer und dem Schlitten zurück ins Wasserbad und Inkubieren bei 48 ° C für 10-15 min. </li><li> Entfernen Sie Folie aus der Tube und tauchen Sie ein in eiskaltem ddH 2 O für 2-3 Sekunden, um restliche Waschpuffer zu beseitigen. </li><li> Der Luft trocknen die Folie so schnell wie möglich (die Verwendung von Druckluft wird empfohlen). Schnelle Trocknung reduziert Sonde Dissoziation. </li><li> Getrocknete Folien können im Dunkeln bei -20 ° C für mehrere Wochen gelagert, ohne signifikanten Verlust der Sonde-verliehenen Fluoreszenzsignal. </li></ol> 5. Mikroskopie <ol><li> Nach FISH und Waschen apply zwei Tropfen antifadent in der Nähe der linken und rechten Ende eines Schiebers (gefroren Scheiben sollten auf Raumtemperatur erwärmt vor diesem Schritt werden). </li><li> Legen Sie ein Mikroskop Abdeckung auf der Oberseite gleiten und warten, bis die antifadent über die gesamte Folie ausgebreitet hat. Beachten Sie, dass eine übermäßige Menge an antifadent kann das mikroskopische Bild verwischen. </li><li> Beachten Sie die Proben unter einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit geeigneten Filtern oder Lasern ausgestattet. Wir verwendeten eine Leica TCS-Einheit (HCX PL APO/63x; NA 1,2). Die Daten können mit einer Software wie Imaris oder AMIRA analysiert werden. </li><li> Slides in antifadent eingebettet werden bei +4 ° C gelagert werden (nicht einfrieren) für bis zu 7 Tage vor der Sonde-verliehenen Fluoreszenz beginnt zu sinken. Alternativ kann die antifadent mit ddH 2 O entfernt werden, und die getrockneten Objektträger können bei -20 ° C über einen längeren Zeitraum gelagert werden. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Scraping Biofilm aus festsitzenden kieferorthopädischen Apparaturen (Abbildung 5) ergibt geeignet Flocken (Abb. 6), die direkt auf beschichtete Objektträger für die Mikroskopie hybridisiert werden können. Auf diese Weise können verschiedene Gruppen von orobiome Bakterien in ihrer natürlichen dreidimensionalen Umgebung von Tagging bakterielle rRNA mit unterschiedlich markierten Sonden (Abb. 7 und 8) identifiziert werden. In Abbildung 7 wurde Biofilm mit EUBmix (grün, alle Bakterien) und LGCmix (gelb, Firmicutes) gefärbt. Firmicutes erscheinen in grün, wie sie mit gelben und blauen Flecken waren. In Abbildung 8 wurde Biofilm mit EUBmix (rot, alle Bakterien), Bac303 (blau, Bacteroidetes) und POGI (gelb, Porphyromonas gingivalis) gefärbt. Porphyromonas gingivalis in gelblich-weiß gezeigt wird, wie alle drei Sonden an die DNA binden und die Überlappung der Farben ergibt sich ein weißes Signal. Morphologischen Unterschiede zwischen Gruppen von Bakterien können auch identifiziert werden (Abb. 9 und 10). Große Cluster von Kokken sind in Abbildung 9, wo Färbung mit EUBmix durchgeführt wurde gezeigt (grün, alle bacteria). Verschiedene Formen von oralen Bakterien wurden visualisiert in Abbildung 10, wo coccoid und fadenförmige Bakterien durch Färbung mit EUBmix (rot) unterschieden werden können. Auch eine typische pilzförmige Struktur des Biofilms können über 3D-Modellierung der CLSM-Daten (Abbildungen 11 und 12) bearbeitet werden <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2967/Film1%20Klug%20Santigli%2001_2_JES_Web.mov">Klicken Sie hier, um einen Film von der 3D-Modellierung zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Fester palatinale Expander in situ. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Nola Dry Field System. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Sterilisierte Zangen, Handschuhen und Fach. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Removed Expander. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Abschaben Biofilm mit einem sterilen Skalpell. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. Resin Flocken direkt auf beschichtete Objektträger hybridisiert. <img alt="Abbildung 7" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 7"> Abbildung 7 CLSM Bild:. Ausdifferenzierung eines bestimmten bakteriellen Gruppe. 2D-Überlagerung von 3D-CLSM-Stack-Daten. Biofilm gefärbt mit EUBmix (grün, alle Bakterien) und LGCmix (gelb, Firmicutes). <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 8"> Abbildung 8 CLSM Bild:. Ausdifferenzierung eines bestimmten bakteriellen Gruppe. 2D-Überlagerung von 3D-CLSM-Stack-Daten. Biofilm gefärbt mit EUBmix (rot, alle Bakterien), Bac303 (blau, Bacteroidetes) und POGI (gelb, Porphyromonas gingivalis). <img alt="Abbildung 9" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig9.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 9"> Abbildung 9 CLSM Bild:. Differenzierung von spezifischen Morphologien. 2D-Überlagerung von 3D-CLSM-Stack-Daten. Biofilm gefärbt mit EUBmix (grün, alle Bakterien). Große Cluster von Kokken (Pfeile). <img alt="Abbildung 10" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig10.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 10"> . Abbildung 10 CLSM-Bilder: Differenzierung von spezifischen Morphologien. 2D-Überlagerung von 3D-CLSM-Stack-Daten. Biofilm gefärbt mit EUBmix (rot, alle Bakterien). Kokkoiden (Pfeil unten) und fadenförmige Bakterien (Pfeil oben) unterschieden werden kann. <img alt="Abbildung 11" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 11"> Abbildung 11. Mushroom Struktur, 3D-Ansichten von unten. Stacks von Biofilm-Flocken (abgeschabt der Oberfläche eines kieferorthopädischen Gerätes), mit EUBmix und Verfahren angefärbtssed mit Imaris (CLSM-Bild). <img alt="Abbildung 11" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 11"> Abbildung 12. Mushroom, 3D Seitenansicht. Stacks von Biofilm-Flocken (abgeschabt der Oberfläche eines kieferorthopädischen Gerätes) mit Imaris (CLSM Bild) verarbeitet. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Hybridisierungspuffer (200 ul) </td></tr><tr><td> Formamid-Konzentration </td><td> 10% </td><td> 20% </td><td> 45% </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 36 </td><td> 36 </td><td> 36 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 2% SDS </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> FA </td><td> 20 </td><td> 40 </td><td> 90 </td></tr><tr><td>2 O </td><td> 138 </td><td> 118 </td><td> 68 </td></tr><tr><td> Jede FISH-Sonde </td><td> 2 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Bestandteile des Hybridisierungspuffer (Konzentrationen in ul). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Waschpuffer (50 ml) </td></tr><tr><td> Formamid-Konzentration </td><td> 10% </td><td> 20% </td><td> 45% </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 4500 </td><td> 2150 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> 1000 </td><td> 1000 </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> 0 </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> ddH 2 O </td><td> 44 500 </td><td> 46 350 </td> 48 200 </tr></tbody></table> Tabelle 2. Inhaltsstoffe von Wasch-Puffer (Konzentrationen in ul). Movie 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2967/Film1%20Klug%20Santigli%2001_2_JES_Web.mov">Klicken Sie hier, um den Film zu sehen.</a>

<ol><li>Sunde, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+for+direct+visualization+of+bacteria+in+periapical+lesions+of+asymptomatic+root-filled+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of bacteria in periapical lesions of asymptomatic root-filled teeth.</a> Microbiology. 149, 1095-1102 (2003).</li>
<li>Sussman, M., Loya, Y., Fine, M., Rosenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marine+fireworm+Hermodice+carunculata+is+a+winter+reservoir+and+spring-summer+vector+for+the+coral-bleaching+pathogen+Vibrio+shiloi%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The marine fireworm Hermodice carunculata is a winter reservoir and spring-summer vector for the coral-bleaching pathogen Vibrio shiloi.</a> Environ. Microbiol. 5, 250-255 (2003).</li>
<li>Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+among+oral+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Communication among oral bacteria.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66, 486-505 (2002).</li>
<li>Zijnge, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+biofilm+architecture+on+natural+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oral biofilm architecture on natural teeth.</a> PLoS One. 5, e9321-e9321 (2010).</li>
<li>Thurnheer, T., Gmur, R., Giertsen, E., Guggenheim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+fluorescent+in+situ+hybridization+for+the+specific+detection+and+quantification+of+oral+streptococci+in+dental+plaque%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated fluorescent in situ hybridization for the specific detection and quantification of oral streptococci in dental plaque.</a> J. Microbiol. Methods. 44, 39-47 (2001).</li>
<li>Hojo, K., Nagaoka, S., Ohshima, T., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+interactions+in+dental+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dent.+Res%22%5BJournal%5D)">Bacterial interactions in dental biofilm development.</a> J. Dent. Res. 88, 982-990 (2009).</li>
<li>Jung, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+initial+bacterial+colonization+on+dentine+and+enamel+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Visualization of initial bacterial colonization on dentine and enamel in situ.</a> J. Microbiol. Methods. 81, 166-174 (2010).</li>
<li>Al-Ahmad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+colonization+of+enamel+in+situ+investigated+using+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial colonization of enamel in situ investigated using fluorescence in situ hybridization.</a> J. Med. Microbiol. 58, 1359-1366 (2009).</li>
<li>Bryers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Medical biofilms.</a> Biotechnol. Bioeng. 100, 1-18 (2008).</li>
<li>Cardinale, M., Vieira de Castro, J., Muller, H., Berg, G., Grube, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+the+bacterial+community+associated+with+the+reindeer+lichen+Cladonia+arbuscula+reveals+predominance+of+Alphaproteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of the bacterial community associated with the reindeer lichen Cladonia arbuscula reveals predominance of Alphaproteobacteria.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 66, 63-71 (2008).</li>
<li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+normal+bacterial+flora+of+the+oral+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Defining the normal bacterial flora of the oral cavity.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).</li>
<li>Chin, M. Y., Busscher, H. J., Evans, R., Noar, J., Pratten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+biofilm+formation+and+the+effects+of+antimicrobial+agents+on+orthodontic+bonding+materials+in+a+parallel+plate+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Orthod%22%5BJournal%5D)">Early biofilm formation and the effects of antimicrobial agents on orthodontic bonding materials in a parallel plate flow chamber.</a> Eur. J. Orthod. 28, 1-7 (2006).</li>
<li>Loy, A., Maixner, F., Wagner, M., Horn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((probeBase--an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes%3A+new+features+2007%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes: new features 2007.</a> Nucleic. Acids. Res. 35, (2007).</li>
<li>Diaz, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+subject-specific+oral+microflora+during+initial+colonization+of+enamel%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2837-2848 (2006).</li>
<li>Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+identification+of+streptococci+and+other+bacteria+in+initial+dental+biofilm+by+confocal+laser+scanning+microscopy+and+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Oral+Sci%22%5BJournal%5D)">In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization.</a> Eur. J. Oral Sci. 115, 459-467 (2007).</li>
<li>Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+interactions+and+successions+during+plaque+development%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology%22%5BJournal%5D)">Bacterial interactions and successions during plaque development.</a> Periodontology. 42, 47-79 (2000).</li>
<li>Kolenbrander, P. E., Palmer, R. J., Periasamy, S., Jakubovics, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+multispecies+biofilm+development+and+the+key+role+of+cell-cell+distance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oral multispecies biofilm development and the key role of cell-cell distance.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 471-480 (2010).</li>
<li>Chalmers, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantum+dot+luminescent+probes+to+achieve+single-cell+resolution+of+human+oral+bacteria+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 630-636 (2007).</li>
<li>Wecke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+monitoring+the+development+of+bacterial+biofilms+in+human+periodontal+pockets%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">A novel technique for monitoring the development of bacterial biofilms in human periodontal pockets.</a> FEMS Microbiol. Lett. 191, 95-101 (2000).</li>
<li>Moter, A., Gobel, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+for+direct+visualization+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms.</a> J. Microbiol. Methods. 41, 85-112 (2000).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das Protokoll beschrieben ist eine sehr praktikable Ansatz zur Färbung Biofilme aus harten Materialien gesammelt. Sampling und Hybridisierung sind die wichtigsten Schritte. Bei der Probenahme ist darauf zu achten, dass Scheiben von ausreichender Dicke gesammelt werden, um sicherzustellen, dass der Biofilm-Struktur intakt bleibt. Während der Hybridisierung ist es wichtig, starken Temperaturschwankungen zu vermeiden, wodurch die unspezifische Bindung oder Verlust der Bindung, der fluoreszenzmarkierten Sonden. Diese FISH-Protokoll ist eine elegante Methode zur normalen heterogenen Biofilm direkt auf Glas-Objektträger Fleck ohne Unterbrechung seiner Zusammensetzung. Die Folien können sofort für die Mikroskopie, ohne die Notwendigkeit, die Probe erneut verschieben werden. Auf diese Weise ist eine Verbesserung gegenüber Färbung in Röhren von weniger Querkraft wird, um den Biofilm aufgebracht werden. Slices&gt; 50 um dicke vorbereitet und auf diese Weise untersucht werden.

oral biofilm analyse palatal expander durch fluoreszenz in situ hybridisierung und konfokale laser scanning mikroskopie

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) der natürlichen heterogenen Biofilm ist heute durch ein umfassendes Angebot an Färbetechniken, von denen einer Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) erleichtert. 1,2 Wir haben eine Pilotstudie, in der mündlichen Biofilm Proben aus festen gesammelt wurden, kieferorthopädischen Apparaturen (palatinale Expander) wurden durch FISH mit dem Ziel, die dreidimensionale Organisation der natürlichen Biofilm und Plaque zu beurteilen gefärbt. 3,4 FISH schafft eine Gelegenheit, um Zellen in ihrer Muttersprache Biofilm-Umgebung Fleck durch die Verwendung von fluoreszenzmarkierten 16S rRNA-Targeting-Sonden. 4-7,19 Im Vergleich zu alternativen Techniken wie Immunfluoreszenz Kennzeichnung, ist dies eine kostengünstige, präzise und einfache Kennzeichnung Technik, um verschiedene bakterielle Gruppen in gemischten Biofilm Konsortien zu untersuchen. 18,20 Allgemeine Sonden verwendet wurden, die Bindung an Eubakterien ( EUB338 + + EUB338II EUB338III; nachfolgend EUBmix), 8-10 Firmicutes (LGC354 AC;. Wurden nachfolgend LGCmix), 9,10 und Bacteroidetes (Bac303) 11 Darüber hinaus spezifische Sonden Bindung an Streptococcus mutans (MUT590) 12,13 und Porphyromonas gingivalis (POGI) 13,14 verwendet . Die extreme Härte der Oberfläche beteiligten Materialien (Edelstahl und Acryl) zwang uns, neue Wege zur Herstellung des Biofilms zu finden. Da diese Oberflächen-Materialien könnten nicht ohne weiteres mit einem Kryotom geschnitten werden, wurden verschiedene Methoden zur Probenahme untersucht werden, um intakte orale Biofilm zu erhalten. Die meisten praktikable dieser Ansätze ist in dieser Mitteilung vorgestellt. Kleine Flocken des Biofilms tragenden Acrylharz wurden mit einem sterilen Skalpell abgekratzt, kümmert sich nicht um den Biofilm-Struktur beschädigen. Pinzetten wurden verwendet, um Biofilm aus dem Stahl-Oberflächen zu sammeln. Einmal gesammelt, wurden die Proben fixiert und direkt auf Polysine beschichteten Glasplättchen gelegt. FISH wurde direkt auf diese Folien mit den Sonden m durchgeführtentioned oben. Verschiedene FISH-Protokolle wurden kombiniert und modifiziert werden, um ein neues Protokoll, das einfach zu handhaben war zu schaffen. 5,10,14,15 Anschließend werden die Proben mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie analysiert. Namhafte Konfigurationen 3,4,16,17 visualisiert werden, einschließlich Pilz-style-Formationen und Gruppen von Kokken durch Kanäle durchzogen. Darüber hinaus wurden die bakterielle Zusammensetzung dieser typischen Biofilm Strukturen analysiert und 2D-und 3D-Bilder erstellt.

Wir präsentieren ein Protokoll für die strukturelle und Analyse der Zusammensetzung der natürlichen oralen Biofilm aus kieferorthopädischen Apparaturen mit<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (FISH) und konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM). Oral Biofilm-Proben wurden von palatinal Expander gesammelt, Schaben Acrylharz-abplatzt ihrer Oberfläche und deren Weiterleitung für die molekulare Verarbeitung.

Oral Biofilm Analyse Palatal Expander durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung und konfokale Laser Scanning Mikroskopie

Die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) natürlicher heterogener Biofilme wird heute durch eine umfassende Palette von Färbetechniken erleichtert, eine ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, natives orales Biofilm von Gaumennahtexpandergeräten für die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zu gewinnen. Zunächst wird hierzu der Gaumennahtexpander entfernt, der das vier Monate alte Biofilm vom Patienten trägt. Anschließend werden die Acrylharzsplitter, die das Biofilm enthalten, vom Gaumennahtexpander abgekratzt.Anschließend wird die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung des fixierten Biofilms direkt auf beschichteten Objektträgern durchgeführt. Abschließend erfolgt die Analyse des angefärbten Biofilms mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie. Am Ende werden Struktur und Zusammensetzung bakterieller Biofilm-Gemeinschaften mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung und konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie dargestellt. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir dicke Biofilme auf kieferorthopädischen Expansionsgeräten entdeckten, die mit bloßem Auge sichtbar waren.Sie ließen uns über mögliche Zusammenhänge zwischen ihnen und parodontalen Erkrankungen nachdenken. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der oralen Mikrobiologie zu beantworten, wie beispielsweise die räumliche Anordnung und Zusammensetzung nativer oraler Biofilme. Die Methode ist interdisziplinär und muss von verschiedenen Fachleuten durchgeführt werden.Elizabeth ist also Orthodontistin und Barbara Molekularbiologin im Labor. Zunächst nach viermonatiger intraoraler Beladung mit dem NOLA-Dry-Field-System den festen Gaumenausdehner unter Ausschluss von Kontamination isolieren. Die Apparatur mit sterilisierten Zangen, Handschuhen und Tabletts aus dem Mund des Patienten entfernen.Bewahren Sie die Objekte in 120-Milliliter-Fläschchen bei minus 20 Grad Celsius auf. Bringen Sie sie auf Eis in das Labor und verarbeiten Sie sie innerhalb von 24 Stunden, um die Proben zu fixieren. Schaben Sie Biofilmläppchen mit einem sterilen Skalpell ab oder sammeln Sie Stücke mit sterilen Pinzetten ein.Es ist entscheidend, Acrylharzsplitter mit ausreichender Dicke abzukratzen, um sicherzustellen, dass die Biofilmstruktur bei eisiger Kälte intakt bleibt. 4% Paraldehydlösung, bis die Probe vollständig bedeckt ist. Inkubieren Sie das Gemisch bei vier Grad Celsius für drei bis zwölf Stunden.Längere Fixierungszeiten oder höhere Fixierungstemperaturen können die Zellhüllen gramnegativer Zellen weniger permeabel für Oligonukleotidsonden machen. Nach der Inkubation entfernen Sie die Paraldehydlösung und waschen mit eiskaltem einmaligem PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei bis drei Mal, um restlichen Paraldehyd zu entfernen. Reese hat die Probe in einem Volumen eiskaltem einmaligem PBS suspendiert und ein Volumen eiskalten 96 %igen Ethanol hinzugefügt; lagern Sie die Probe bei minus 20 Grad Celsius.Die Proben können über mehrere Monate bis Jahre hinweg gelagert werden, um die Probe zu entwässern. Tragen Sie zunächst fünf bis 30 Mikroliter an Paraldehyd fixiertes Probenmaterial auf einen Mikroskopobjektträger auf. Trocknen Sie die Probe 15 Minuten lang bei 46 Grad Celsius oder länger bei Raumtemperatur, während die Probe trocknet, damit Lysozym und Formaldehyd die Zellwände teilweise abbauen können.Fügen Sie für eine bessere Eindringung der Sonden 250 Mikroliter einer Lösung mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter Lysozym für 10 Minuten bei Raumtemperatur hinzu, tauchen Sie die Objektträger jeweils drei Minuten in 50, 80 und 96 %igen Ethanol. Die dehydrierende Wirkung der Ethanol-Konzentrationsreihe wird die Membranen auflösen, um die Aufnahme der Oligonukleotidsonden zu verbessern. Trocknen Sie die Objektträger abschließend bei 46 Grad Celsius, um die in situ U-Hybridisierung durchzuführen.Bereiten Sie zunächst ein Milliliter frischen Hybridisierungspuffer vor und erwärmen Sie ihn auf 47 Grad Celsius vor. Tauen Sie die Oligonukleotid-Sondenlösungen auf Eis auf und schützen Sie sie vor Licht. Legen Sie ein Stück Filterpapier in eine quadratische Petrischale und pipettieren Sie 800 Mikroliter des Hybridisierungspuffers auf das Filterpapier.Schließen Sie die Kammer sofort wieder, da der Puffer Formamid enthält. Geben Sie zwei Mikroliter jeder Sonde zu 200 Mikrolitern des restlichen Hybridisierungspuffers. Mischen Sie gründlich und geben Sie die Mischung unmittelbar auf die dehydrierte Probe auf einem Objektträger. Legen Sie den Objektträger horizontal in die Schale und decken Sie sie ab. Inkubieren Sie die Schale eine bis fünf Stunden lang bei 46 Grad Celsius in einem Ofen.Die Schale fungiert als Feuchtekammer und verhindert die Verdunstung der Hybridisierungslösung von dem Objektträger. Insbesondere die Verdunstung von Ameisensäure kann zu unspezifischer Sondebindung an Nicht-Zielzellen führen. Bereiten Sie 50 Milliliter Waschpuffer vor und erwärmen Sie diesen auf 48 Grad Celsius in einem Wasserbad. Entfernen Sie die Schale mit dem Objektträger aus dem Hybridisierungs-Ofen. Spülen Sie sofort den Hybridisierungspuffer mit einer kleinen Menge vorgewärmten Waschpuffer ab und überführen Sie den Objektträger in den verbleibenden Waschpuffer. Stellen Sie das Röhrchen mit dem Waschpuffer und dem Objektträger zurück in das Wasserbad und inkubieren Sie 10 bis 15 Minuten bei 48 Grad Celsius.Um die Proben mit mehr als einer Sonde zu färben, wiederholen Sie die vorherigen Schritte, nachdem der Waschpuffer entfernt wurde. Achten Sie darauf, mit der höchsten Form einer milden Konzentration zu beginnen. Entfernen Sie den Objektträger aus dem Röhrchen und tauchen Sie ihn in Eis.Kalte doppelt destillierte Wasser für zwei bis drei Sekunden. Um restliche Waschpuffer zu entfernen, trocknen Sie den Objektträger so schnell wie möglich lufttrocken, da schnelles Trocknen einer Proben-Dissociation entgegenwirkt.Bewahren Sie die getrockneten Objektträger mehrere Wochen lang im Dunkeln bei minus 20 Grad Celsius auf, ohne dass ein signifikanter Verlust des durch die Sonde vermittelten Fluoreszenzsignals auftritt. Um die Proben abzubilden, geben Sie zwei Tropfen Antifa-Reagenz nahe den linken und rechten Enden eines Objektträgers auf und legen anschließend einen Deckglaser auf. Untersuchen Sie die Proben unter einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, das mit geeigneten Filtern oder Lasern ausgestattet ist. Die Objektträger können bis zu sieben Tage bei vier Grad Celsius gelagert werden oder können mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen und für längere Zeiträume bei minus 20 Grad Celsius aufbewahrt werden.Es handelt sich um die Gewinnung von Biofilmen von festen kieferorthopädischen Apparaturen. Sie erhalten geeignete Plaques, die direkt auf beschichteten Objektträgern für die Mikroskopie hybridisiert werden können, sodass verschiedene Gruppen des oralen Mikrobioms, Bakterien in dreidimensionaler Anordnung, durch spezifische Sonden identifiziert werden können. In dieser Abbildung wurde der Biofilm mit EUB-Mix und LGC-Mix gefärbt, wobei Firmacutes grün erscheinen, da sie mit gelber und blauer Farbe angefärbt wurden.Hier wurde der Biofilm mit der EUB-Mix-Back-3-0-3- und POGI-Färbung versehen. Bakterien der Gruppe Bacteria dts erscheinen rosa und blassrot. Ramons gingivalis zeigt sich gelblichweiß, da alle drei Sonden an seine DNA binden und die Überlagerung der Farben ein weißes Signal ergibt. Morphologisch.Unterschiede zwischen Bakteriengruppen können ebenso identifiziert werden wie bestimmte Strukturen, beispielsweise große Kokkenbakterien-Cluster. Beispiele solcher Cluster werden hier gezeigt, wobei EUB mix zur Färbung verwendet wurde. Zusätzlich kann eine typische, pilzartige Struktur des Biofilms durch 3D-Modellierung der CLSM-Daten dargestellt werden.Dies ist eine 3D-Animation des mit EUB gemischt gefärbten Biofilms. Diese Methode kann Einblicke in die durch kieferorthopädische Maßnahmen induzierte Biofilmbildung ermöglichen. Sie kann außerdem auf jede andere künstliche Oberfläche im menschlichen Körper angewendet werden, die komplexe Biofilmstrukturen mit möglicher Pathogenität trägt.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man native orale Biofilme für die Fluoreszenz in situ Hybridisierung und die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie vorbereitet. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass dies ein interdisziplinäres Forschungsfeld ist und Sie nur im Team erfolgreich sein können. Behandeln Sie Ihre Kolleginnen und Kollegen daher stets respektvoll.

oral-biofilm-analysis-palatal-expanders-fluorescence-situ

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Biofilme auf der Zahnoberfläche gebildet sind sehr komplex und in denen konstante angeborenen und exogene ökologischen Herausforderungen, die ihre Architektur modulieren, Physiologie und Transkriptom. Wir entwickelten eine Toolbox, um die Zusammensetzung, die strukturelle Organisation und Genexpression von oralen Biofilmen, die auf andere Bereiche der Biofilm-Forschung angepasst werden können zu prüfen.

Ein analytisches Werkzeug-Box für umfassende biochemische, strukturelle und Transkriptom Evaluation of Oral Biofilme von Mutans Streptokokken Mediated

Dieses Video zeigt einen Echtzeit-Assay zur Überwachung des extrazellulären pH-Werts in dentalen Biofilmen mit einer pH-sensitiven ratiometrischen Sonde. Wenn ein in situ gezüchteter bakterieller Biofilm Glukose ausgesetzt wird, protoniert eine Verringerung des extrazellulären pH-Werts in der Nähe der bakteriellen Biomasse die Sonde, was zu einer erhöhten Konzentration in den Bakterien führt. Die Diskrepanz in der Emissionswellenlänge zwischen der protonierten und der unprotonierten Sonde wird...

Ein Assay zur Echtzeitüberwachung des extrazellulären pH-Werts in dentalen Biofilmen

Es wird ein Protokoll für die gleichzeitige Quantifizierung und den Vergleich von drei zellulären und extrazellulären Komponenten innerhalb von Biofilmen vorgestellt. Die Methodik umfasst den Einsatz von konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie, Biofilm-Strukturanalyse- und Visualisierungssoftware sowie statistischer Analysesoftware.

Gleichzeitige Quantifizierung zellulärer und extrazellulärer Bestandteile von Biofilmen

Das Ziel dieser Verfahren ist es, die Papier Verwendung eines mikrofluidischen Systems für die Entwicklung von Mehrarten Biofilmen, die typischerweise bei humanen supragingivale Plaque identifiziert Arten enthalten beschreiben. Methoden, um die Biofilmarchitektur Biofilm Lebensfähigkeit und ein Konzept für die Ernte Biofilm für kulturabhängig oder kulturunabhängige Analysen hervorgehoben zu beschreiben.

Verwendung eines Hochdurchsatz-<em&gt; In-vitro-</em&gt; Mikrofluidik-System auf die mündliche Multi-Spezies-Biofilme entwickeln

Ein pH-sensitive ratiometrisch Farbstoff wird in Kombination mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie und digitale Bildanalyse zur Überwachung der extrazellulären pH in der dentalen Biofilme in Echtzeit verwendet.

Ratiometrisch Imaging von extrazellulären pH in Dental Biofilme

Dieses Protokoll beschreibt ein neues Verfahren zu wachsen und qualitativ bakteriellen Biofilmen auf Pilzhyphen durch konfokale und Elektronenmikroskopie analysiert.

Eine neue Methode zur qualitativen Mehrskalige Analyse von bakteriellen Biofilmen auf filamentösen Pilzkolonien mittels konfokaler und Elektronenmikroskopie

Änderungen in der mündlichen Microbiome während der gesamten Kindheit sind von wachsendem Interesse. Vergleich der verschiedenen Microbiome Studien zeigt einen Mangel an standardisierten Probenahme Protokolle. Begrenzten Raum macht Probenahme Ton subgingivalen Sulcus von schwierigen Kindern. Papier Punkt Probenahme präsentiert sich hier im Detail als die Methode der Wahl für diesen Bereich.

Oralen Biofilm Sampling für Microbiome Analyse bei gesunden Kindern

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur mündlichen Biofilmbildung auf Titan und Zirkonoxid Materialien für Zahnersatz Aufbauten, einschließlich der Analyse von Bakterienzellen Lebensfähigkeit und morphologische Eigenschaften zu bewerten. Der oralen Biofilm-Analyse dient eine in Situ -Modell mit mächtigen mikroskopiertechniken verbunden.

Mündliche Biofilmbildung auf unterschiedlichen Materialien für Zahnimplantate

Das Protokoll beschreibt den Anbau von königreichübergreifenden Biofilmen, die aus Candida-Albicans und Streptococcus-Mutanen bestehen, und stellt eine konfokale Mikroskopie-basierte Methode zur Überwachung des extrazellulären pH-Werts in diesen Biofilmen dar.

Überwachung des extrazellulären pH-Werts in cross-kingdom Biofilmen mit Konfokalmikroskopie

In dieser Arbeit wird ein halbautomatisiertes digitales Bildanalyseverfahren zur planimetrischen Quantifizierung von offengelegtem Zahnbelag auf Basis von Bildern vorgestellt, die mit einer intraoralen Fluoreszenzkamera aufgenommen wurden. Die Methode ermöglicht eine schnelle und zuverlässige Quantifizierung von Zahnbelag im Forschungsumfeld.

Halbautomatische planimetrische Quantifizierung von Zahnbelag mittels intraoraler Fluoreszenzkamera

Ziel dieses Protokolls ist es, einen standardisierten Ansatz zur quantitativen Bewertung der Integrität der murinen gingivalen Epithelbarriere zu bieten, indem fluoreszenzmarkierte Dextrans unterschiedlicher Molekülgröße in vivo auf die Gingivaloberfläche topisch aufgetragen werden, gefolgt von einer ex-vivo-Bildgebung mit einem Einzelphotonenmikroskopiesystem.

Funktionelle Beurteilung der Maus-Gingival-Epithelbarriere mit fluoreszierenden Traceren

Lernen Sie die Analyse oraler Biofilme von Gaumensegmentern mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung und konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die dreidimensionale Visualisierung bakterieller Gemeinschaften.

Oral Biofilm Analyse Palatal Expander durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung und konfokale Laser Scanning Mikroskopie

Weitere Videos entdecken