Name: Calcium Imaging von geruchs-evozierte Potentiale in der Drosophila Antennallobus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Lernen Sie Calcium-Imaging geruchs-evozierter Potentiale im Antennallobus von Drosophila melanogaster. Diese optische Methode mit GCaMP ermöglicht die Erfassung neuronaler Aktivitätsmuster in Echtzeit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir erkennen an, Silke Sachse und Beate Eisermann in der Entwicklung dieser Methodik, Pablo Traversa für das Zeichnen der Montageblock Blaupausen und Daniela Pelz für die Verwendung des in Abbildung 1 schematisch. Wir danken Silke Sachse, Pavan Ramdya und Raphael Rytz für Anmerkungen zum Manuskript. R. Bell wird von einem Boehringer Ingelheim Stiftung PhD Fellowship unterstützt. Research in R. Benton-Labor wird von einem European Research Council Starting Independent Researcher Grant und die Swiss National Science Foundation finanziert.

1. Montageblockanordnung <ol><li> Die Plexiglas-Montageblock (Abbildung 1A) sollte auf die genauen Spezifikationen in der Blaupause gegeben werden (erhältlich bei <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> ) Zu ermöglichen eine einfache Montage und Zerlegung der Fliege. Faden durch die Schrauben von der Rückseite, sondern sie erstrecken sich nicht über die vor dem Block, ihre Position wird während der Vorbereitung des Tieres angepasst werden (siehe 2.7). </li><li> Mit einer Präzisions-Bohrmaschine, eine Delle in den oberen Rand der kreisförmigen Kammer für die Fliege, unter der Oberfläche graben, um Platz für Körper der Fliege zu machen, die Verringerung der Dicke des Blocks an dieser Stelle. </li><li> Schneiden einer Kupfer-Gitter mit einem Skalpell senkrecht und in der Nähe der Unterseite des Schlitzes, um eine "Kragen" zu schaffen. Achten Sie darauf, die beiden entstehenden Klappen sind eben, wie dies Einsetzen der Fliege helfen. </li><li> Mit einem Zahnstocher, platzieren Sie einen kleinen Tropfen Sekundenkleber auf den Montageblock oberhalb der runden Kammer für die Fliege. Platzieren Sie die Kupfer Gitter auf den Klebstoff und Position, so dass der Schlitz auf dem Block (1A) zentriert ist. Drücken Sie vorsichtig und entfernen Sie überschüssigen Leim. Mit einer Pinzette, fügen winzigen Tropfen Klebstoff unter den Klappen auf jeder Seite und falten Sie das Raster über die vor dem Block, so dass der Schlitz senkrecht nach unten. Achten Sie darauf, die oben am Tisch auf gleicher Höhe mit dem Block. Vollständig trocknen lassen. </li><li> Montieren Sie einen Drahthalter: schneiden Sie ein Deckglas aus Kunststoff in zwei Hälften und entfernen Sie eine zentrale Stück, ein "U"-Form zu machen. Verwenden Bienenwachs zu kleben ein Stück Draht über den oberen Teil des "U"; nicht machen das Kabel zu straff. </li><li> Konstruieren Sie die antennalen Schild: machen Sie ein Loch in einem Kunststoff-Deckglas mit einem Papier-Locher. Schneiden der Kanten des Deckglases bis 0,5 x 0,7 cm. Kleben Sie die durchbohrten Kunststoff Deckglas zu Klebeband und legen Sie dann einen Tropfen Ethanol auf dem Band durch das Loch an exponiertenentfernen Sie den Klebstoff. </li></ol> 2. Tierische Vorbereitung <ol><li> Fliegen des entsprechenden Genotyps - also tragen die gewünschte Kombination von "driver"-Reporter und Aktivität Transgene - sollte 1-3 Wochen alt, die Kutikula der jüngeren Fliegen ist zu weich und schwierig zu schneiden. Bei Experimenten direkten Vergleich verschiedener Genotypen erfordern, und um die Expression der Transgene übereinstimmen, sollte Fliegen sein Alter abgestimmt auf altersbedingte physiologische Unterschiede zu vermeiden. Wenn Geschlecht nicht wichtig ist, bevorzugen wir es, weibliche Fliegen verwenden, da sie einen größeren Kopf haben und sind leichter zu manipulieren. </li><li> Anesthetize Fliegen durch Abkühlen auf Eis. </li><li> Führen Sie eine Fliege in den Montageblock. Halten der Fliege durch die Flügel zu schieben und, Rücken-Oberfläche zunächst über den Schlitz des Kupfergitter so daß sie durch den Hals (1B-C) suspendiert. Wenn nötig, drehen ihn, bis er nach unten schaut. </li><li> Legen Sie eine feine Kaktusstachel vor dem fly den Kopf, um es an der Flucht (Abbildung 1B-C) zu verhindern. Setzen Sie den Kaktus Wirbelsäule vor den Rüssel, um es zu Bewegung zu verhindern. Befestigen Sie den Kaktus Wirbelsäule auf den Block mit Bienenwachs. Stellen Sie sicher, dass die Oberseite des Kopfes mit der Oberseite des Blocks ist. </li><li> Befestigen Sie den Kopf der Fliege auf den Block mit einem kleinen Tropfen von Kolophonium (gelöst in Ethanol). Den Block in einem befeuchteten Box und lassen Sie das Kolophonium zu verhärten für etwa eine Stunde. </li><li> Mit einer Pinzette, ziehen Sie die Platte nach vorn antennalen-and-Drop den Draht an der Halterung (Wachs-Side-out, siehe 1.5) in der Kutikula Falte zwischen der Antenne und Kopf. Befestigen Sie die Halterung an der Vorderseite des Blocks mit Bienenwachs. </li><li> Verwenden Sie die Schrauben in den Block gebaut, vorsichtig in das Drahthalter uns auf etwas Platz zwischen dem antennalen Platte und der Kopf zu schaffen. </li><li> Setzen Sie den antennalen Schild (siehe 1.6) über den oberen Teil der Fliege Kopf mit dem Loch positioniert zentral. Fix mit Bienenwachs an der Spitze der Montageblock. </li><li> Mit einem Messer-Splitter, cuta kleines Loch in der Band auf dem Schild Aussetzen der Kutikula der Fliege den Kopf hinter der Antenne. Das Loch sollte nicht über den Augen erstrecken, um die Herstellung auslaufen. </li><li> Dichten Sie das Loch zwischen dem Band und die Nagelhaut mit Zwei-Komponenten-Silikon. Entfernen Sie überschüssiges Silikon von der Spitze der Fliege den Kopf. </li><li> Geben Sie einen Tropfen von Drosophila Ringer-Kochsalzlösung (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 36 mM Saccharose, 5 mM HEPES, pH 7,3) auf den Kopf. Stellen Sie sicher, dass keine Lecks vorhanden sind: die Antennen bleiben sollte vollständig trocken ist. Mit einem Saphir Messer, schnitt ein Loch in die Nagelhaut. Zuerst leicht Punktzahl entlang der Kutikula fach direkt hinter der Antenne, dann entlang den Augen und über den Ocellen geschnitten auf der Rückseite. Schließlich falten Sie das Blatt über die Kutikula erzielte Kante geschnitten und von der Unterseite zu vermeiden Durchtrennen der antennalen Nerven. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Drüsen und der Luftröhre mit feinen Pinzette. Spülen Sie immer wieder mit Drosophila </li></ol> 3. Geruch Stimulus Lieferung <ol><li> Geruch Spritzen: legen Sie eine Cellulose-Pad in ein 2 ml Kunststoff-Spritze mit sauberem Pinzette und Pipette auf sie (mit Filter tips) 20 ul Geruch, verdünnt wie in einem geeigneten Lösungsmittel gewünscht, mit der Pipettenspitze, um das Kissen tief in den Lauf schieben . Plug-and-Kappe der Spritze, bis sie benötigt. Frischer Geruch Verdünnungen sollten mindestens alle 3 Monate (oder häufiger bei sehr flüchtigen und / oder häufig verwendete Gerüche) werden, und neue Pads sollten für Geruch Spritzen direkt vor jeder Aufnahme-Session vorbereitet werden. Verwenden Sie keine Geruchs-Pads für mehr als drei Stimulationen, da der Geruch Konzentration könnte zerfallen. </li><li> Maßgeschneiderte Olfaktometer (2): einen primären Luftstrom (1 l / min) durch Teflon-Schlauch (0,4 mm Innendurchmesser) gerichtet ist; 27 cm oberhalb vom Austritt des Rohres eine sekundäre Luftstrom (1 l / min ) zugegeben. Beide Luftströme werden durch Membranpumpen erzeugt wird, unddie Fließgeschwindigkeit wird durch zwei unabhängige Durchflussmesser geregelt. Die Luftströme können befeuchtet werden, indem es durch Wasser in Gaswaschflaschen, wobei darauf zu achten, um über-Befeuchtung zu vermeiden (dh mehr als ~ 60%) werden. Die sekundäre Luftstrom wird entweder durch eine Spritze oder Geruch einer leeren Spritze gerichtet: Spritzen werden, um den Luftstrom durch eine Spritzennadel (1,2 mm Außendurchmesser) Durchstechen des Kolbens verbunden ist. Ein Drei-Wege-Magnetventil über ein Ventil Steuereinheit (zB Harvard Apparatus VC6) gesteuert wird verwendet, um zwischen der sauberen Luft und Geruch Impulse zu wechseln. </li></ol> 4. In-vivo-Imaging <ol><li> Wir beschreiben hier eine aufrechte Bildgebung mit Fluoreszenz-Mikroskop (zB aufrecht feste Bühne Zeiss Axio Examiner D1) mit einem 20x Wasser Zielsetzung (z. B. Zeiss W "Plan-Apochromat" 20x / 1,0 M27 DIC) (Abbildung 2) ausgestattet. Für die Bildgebung mit G-Camp (Anregung / Emission: 488/509 nm), einen Filter verwenden, Block mit den folgenden Eigenschaften: 450-490 nm Anregungsfilter, Dichroitischen Spiegel (T495LP) und 500-550 nm Emission Filter (Chroma ET). Setzen Sie den Montageblock mit der Fliege unter dem Mikroskop. Positionieren Sie den Ausgang der Olfaktometer ca. 0,5 cm vor der Fliege Antennen. </li><li> Senken Sie das Ziel, bis es der Ringer-Lösung auf der Fliege Kopf berührt. Beim Blick durch den Betrachter unter Hellfeldbeleuchtung, Position der Vorbereitung, so dass das Loch in der Kopfkapsel zentriert ist und seine Grenzen sind im Fokus. Wechseln Sie in fluoreszierendes Licht und stellen Sie den Fokus, bis Sie die markierten Neuronen (ergibt sich aus Basal-grüne Fluoreszenz der G-cAMP) sehen kann. </li><li> Fein Fokus auf die Glomeruli von Interesse durch den Erwerb von Bildern mit einer Charge-coupled Device (CCD) Kamera (zB CoolSNAP HQ2-Digitalkamera-System) auf dem Mikroskop mit Hilfe geeigneter Software zur Erfassung (zB Metafluor) (Abbildung 3A) montiert. Schließen der Blende im Beleuchtungsstrahlengang um Anregungslicht zu dem abgebildeten Bereich zu begrenzen. </li><li> Für die Aufzeichnung Gerüche hervorgerufeneAktivität, stellen Sie den Erwerb Rate bis 4 Hz und stellen Sie die Belichtungszeit auf Fluoreszenz-Werte innerhalb des dynamischen Bereichs des CCD-Kamera zu erhalten, aber nicht niedriger als 1000 (willkürliche Einheiten), mit mindestens 12-Bit-Auflösung dynamisch. Die Belichtungszeit sollte nicht länger als 100 ms, wenn möglich, zu G-CaMP Ausbleichen zu reduzieren. Wenn die räumliche Auflösung der Kamera erlaubt, können Sie erhöhen die Binning (Anzahl der Brunnen auf dem Chip, die in eine digitale Pixel-Binning werden), um die Belichtungszeit zu reduzieren. Man erhält Bilder der 350x225 Pixel (mit Binning 2x2), entsprechend 210x135 um bei der Herstellung. Diese Einstellungen sind optimal zur glomerulären Geruchs-induzierten Reaktionen des G-Camp mit guter räumlicher und zeitlicher Auflösung zu erfassen und beschränkt Reporter Bleichen. </li><li> Stellen Sie die Messparameter. Wir in der Regel für 10 Sekunden (also 40 Frames) aufzeichnen, mit Duftstimulation sich zumeist in 4 Sekunden nach dem Beginn der Erfassungszeitraum (Bild 15) und einer Laufzeit von einem zweiten (until Frame 19). Eine Fliege Vorbereitung kann in der Regel mit getestet werden bis zu 25-30 verschiedenen Geruch Reize, die oft von einer irreversiblen Abnahme der Fluoreszenz-Signal des Reporters durch Ausbleichen begrenzt. Die Inter-Stimulus-Intervall wird von der Stärke der Reaktion beobachtet, und die von Photobleichen abhängen. Die entsprechende Länge der Inter-Stimulus-Intervall auf sensorische Anpassung vermeiden können, etwa durch wiederholte Vorlage einer positiven Kontrolle Geruch (falls bekannt) im Versuch ermittelt werden. Die Aufnahme dieses Geruchs alle ~ 10 Stimuli in einer bestimmten Serie können zulassen Überprüfung der Lebensfähigkeit und konsistente Reaktionsfähigkeit der Zubereitung. </li></ol> 5. Datenverarbeitung und-analyse Daten werden mit ImageJ (mit Mac Biophotonik-Plug-in, <a href="http://www.macbiophotonics.ca/">www.macbiophotonics.ca</a> ) und benutzerdefinierte Programme geschrieben in Matlab und R wie folgt: <ol><li> Korrigieren Sie für Probe Bewegungsartefakte:richten Sie alle Bilder, entsprechend einem Tier Zubereitung (zB 30 Messungen von 40 Bildern je) mit dem "starren Körper"-Modus der StackReg / TurboReg ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg">bigwww.epfl.ch / Thevenaz / stackreg</a> ) in ImageJ. Dieser Schritt ist erforderlich, um Veränderungen der Position der markierten Neuronen in Bezug auf die Erfassungsfrequenz in und zwischen den Messungen zu entfernen. Es ist jedoch nur möglich, Verschiebungen in der xy-Ebene zu entfernen. Die Daten sollten verworfen werden, wenn starke Veränderungen in der Konzentration auftreten werden. </li><li> Segment den Stapel in einzelne 10-Sekunden (40 Rahmen) Messungen. </li><li> Richtig zum Bleichen von Artefakten: Belastung durch fluoreszierendes Licht führt dazu, Fluoreszenz, die während einer einzigen Messung 10 zerfallen. In einigen Fällen ist es wichtig, um für diese zerfallen, bevor die Analyse der Daten zu korrigieren. Für jede Messung Berechnung eines Hintergrundbildes. Dies sollte der Mittelwert aus mehreren Frames vor Beginn des Stimulus (zB Rahmen 6-14) sein. Unterteilen Sie jedes Bild von diesem backgrunder Rahmen um die relative Fluoreszenz Änderungen zu erhalten. Den Mittelwert der relativen Fluoreszenz für jeden Frame durch Mittelung aller Pixel innerhalb des von G-CaMP markiert. Setzen Sie einen Doppelklick auf die exponentielle mittlere Fluoreszenz-Kurve, ein stärkeres Gewicht geben den Rahmen vor dem Stimulus und null Gewicht auf die Zeit des Geruchs Antwort (20 Frames nach Reizbeginn in unserem Fall). Subtrahieren Sie die angepasste Kurve von der relativen Fluoreszenz-Kurve eines jeden Pixels. Multiplizieren Sie die korrigierten Bilder von der Hintergrund-Frame neu zu erhalten Rohdaten. Diese Art der Korrektur kann zu einer Veränderung in der Dynamik Reaktion führen, wenn das Signal nicht auf die Grundlinie zurückzusetzen, indem das Ende der Messung (z. B. wenn inhibitorischen oder exzitatorischen sehr starke Reaktionen hervorgerufen werden) (Abbildung 4). Während Korrektur zum Bleichen Artefakte ist in vielen Fällen sollte Auslegung der zeitliche Parameter mit Vorsicht durchgeführt werden, wenn ein Bleichmittel Korrektur angewendet. </li><li> Berechnen der relativen Änderung in der Fluoreszenz (&amp; Delta, F / F) für jedes Bild jeder Messung (F i-F 0) / F 0 * 100, wobei F 0 die Hintergrund-Frame (siehe 5.3), und F i die Fluoreszenz-Wert für den i-ten Vollbild die Messung. </li><li> Berechnen Sie die mittlere &amp;Dgr; F / F in einem kreisförmigen Bereich von Interesse in einer Glomerulus (3B) mit einem Durchmesser von 10 Pixel, um die Aktivität Spuren (5A) zu erhalten. Wenn gewünscht, diese Spuren zu wandeln Heatmaps mit ImageJ (5A). </li><li> Berechnen Sie die Spitzenamplitude der Antwort durch Subtrahieren der mittleren &amp;Dgr; F / F von vier Rahmen vor der Stimulation von der mittleren &amp;Dgr; F / F von vier Rahmen in der Spitze der Antwort. Das gleiche Verfahren wird auch verwendet, um räumliche Antwortmuster (siehe Abbildung 3B) zu illustrieren und die Antwort Amplitude in bestimmten Regionen von Interesse über Fliegen zu quantifizieren (siehe Abbildung 5B). Die maximale Empfindlichkeit kann auch durch Integrieren der Fläche unter der Kurve während der Zeit des Reizes oder quantifiziert werden averaging die Rahmen um das Maximum der Reaktion. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Wir verwendeten die Protokolle über die Erfassung und Auswertung Propionsäure hervorgerufenen Reaktionen von Fliegen, welche G-28 unter CaMP1.6 der Kontrolle des Promotors für die olfaktorische Korezeptor IR8a, die aktiv ist in verschiedenen Populationen von OSN 29,30 ( Abb. 3-5). Stimulation mit 1% Propionsäure entlockt Anstieg der G-CaMP Fluoreszenz - was auf einen Anstieg der intrazellulären Calcium - in OSNs innervieren zwei Glomeruli, DC4 und DP1l (3B). Wir stellen verschiedene Arten der Darstellung von Daten aus mehreren Fliegen in Abbildung 5: Linie Aktivität Spuren, Heatmaps und eine Bar Grundstück von Peak Antworten. Propionsäure hervorgerufenen Reaktionen haben deutliche Spitzenamplituden und zeitliche Dynamik in DC4 und DP1l. Darüber hinaus, obwohl die Immunantworten generell sind robust, kann Variabilität zwischen den einzelnen Tieren auch in den beiden Glomeruli beobachtet werden (siehe eratmaps in 5A). Die Quantifizierung der Peak-Response (Abbildung 5B) ermöglicht eine einfache statistische Vergleich zwischen verschiedenen Glomeruli und verschiedener Riechstoffe über Tiere. Allerdings können Gerüche hervorgerufene Kalzium Antworten haben uneinheitliche zeitliche Dynamik und die Quantifizierung ihrer Größenordnung mit einem einzigen Wert wird diese Komplexität zu ignorieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="1"> 1. Schaltplan der Montageblock (A) vor und (B) nach dem Einbringen der Fliege, und (C) einer Draufsicht in Nahaufnahme (aus 31). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="2"> Abbildung 2. Schematische Darstellung der Versuchsanordnung. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. (A) Draufsicht der Fliege Vorbereitung nach der Stufe 2,8 (linkes Bild) und rohes Bild der Fluoreszenz-ante-NNAL Lappen mit G-CaMP1.6 (;: G-CaMP1.6:: IR8a Promoter GAL4 UAS Genotyp) beschriftet. DC4 und DP1l Glomeruli können durch ihre Morphologie, Größe und Position unterschieden werden und sind in rot und blau markiert, beziehungsweise. (B) Farbe-codiertes Bild aus der Antwort auf Propionsäure (1% v / v). Das Bild entspricht der &amp;Dgr; F / F des Peaks der Antwort berechnet, wie in Schritt 5.6 erläutert (siehe auch 5A). Die ColorScale auf der linken Seite zeigt den% &amp;Dgr; F / F-Wert. Die schwarzen Kreise zeigen die Position und Größe der Region von Interesse verwendet werden, um die Antworten zu quantifizieren (siehe Abbildung 5). <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Korrektur Ausbleichen der fluoreszierenden Reporter-Signal. Beispiele für die Wirkung des Bleichmittels Korrektur wie in Schritt 5.3 beschrieben. Musterdaten auf der linken Seite kann ohne größere Änderungen in der Form der Antwort korrigiert werden. Sample-Daten auf der rechten Seite ist stark beeinflussenHrsg. v. Bleich-Korrektur, wahrscheinlich, weil das Signal abfällt und wird unter den Ausgangswert nach Beendigung Geruch Stimulus aufrechterhalten. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 5 (A) Oben:. Zeitliche Dynamik von Kalzium Antworten der Glomeruli DC4 (links) und DP1l (rechts) zu Propionsäure (1% v / v). Die schwarzen Kurven zeigen den Median der Mittelwert &amp;Dgr; F / F in der Region von Interesse (siehe Abbildung 3B) über acht Tieren. Die graue Fläche zeigt den Bereich zwischen dem ersten und dritten Quartil der Verteilung. Präsentation der Median und Quartil-Werte enthält weitere Informationen über die Variabilität und Verteilung der beobachteten Reaktionen als Mittelwert und Standardabweichung. Die Grün und Magenta Kästen zeigen die Rahmen gemittelt, um die Peak-Response in 3B gezeigt, und quantifiziert in 5B zu berechnen. Unten: die Heatmaps für die Antwortdaten für die einzelnen Tiere in getrennten Reihen mit &amp;Dgr; F / F-Werte represented durch die ColorScale (ganz rechts). Die horizontalen schwarzen Balken zeigen die Uhrzeit und die Dauer des Reizes. (B) Median Gipfel Antworten auf Propionsäure in acht Tieren, die für DC4 und DP1l Glomeruli. Die Fehlerbalken geben den Bereich zwischen dem ersten und dritten Quartil der Verteilung.

<ol><li>Galizia, C. G., Rossler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+olfactory+systems+in+insects%3A+anatomy+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Parallel olfactory systems in insects: anatomy and function.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 399-420 (2010).</li>
<li>Vosshall, L. B., Stocker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Architecture+of+Smell+and+Taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular Architecture of Smell and Taste in Drosophila.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 505-533 (2007).</li>
<li>Wilson, R. I., Mainen, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+events+in+olfactory+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early events in olfactory processing.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 163-201 (2006).</li>
<li>Masse, N. Y., Turner, G. C., Jefferis, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+information+processing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Olfactory information processing in Drosophila.</a> Curr. Biol. 19, 700-713 (2009).</li>
<li>Hansson, B. S., Anton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+morphology+of+the+antennal+lobe%3A+new+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Function and morphology of the antennal lobe: new developments.</a> Annu. Rev. Entomol. 45, 203-231 (2000).</li>
<li>Galizia, C. G., Joerges, J., Kuttner, A., Faber, T., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-in-vivo+preparation+for+optical+recording+of+the+insect+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A semi-in-vivo preparation for optical recording of the insect brain.</a> J. Neurosci. Methods. 76, 61-69 (1997).</li>
<li>Galizia, C. G., Menzel, R., Holldobler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+odor-evoked+glomerular+activity+patterns+in+the+antennal+lobes+of+the+ant+Camponotus+rufipes%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of odor-evoked glomerular activity patterns in the antennal lobes of the ant Camponotus rufipes.</a> Naturwissenschaften. 86, 533-537 (1999).</li>
<li>Okada, K., Kanzaki, R., Kawachi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+voltage-sensitive+dye+imaging+of+an+in+vivo+insect+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">High-speed voltage-sensitive dye imaging of an in vivo insect brain.</a> Neurosci. Lett. 209, 197-200 (1996).</li>
<li>Carlsson, M. A., Knusel, P., Verschure, P. F., Hansson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+Ca2%2B+dynamics+of+moth+olfactory+projection+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal Ca2+ dynamics of moth olfactory projection neurones.</a> The European journal of neuroscience. 22, 647-657 (2005).</li>
<li>Galizia, C. G., Vetter, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGalizia%2C+CG+%22Methods+in+Insect+Sensory+Neuroscience+%28Frontiers+in+Neuroscience%29%22">Methods in Insect Sensory Neuroscience (Frontiers in Neuroscience)</a>. Christensen, T. A. 13, CRC Press. 349-392 (2005).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li>
<li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
<li>Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+quantitative+Ca2%2B+measurements+using+improved+cameleons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 2135-2140 (1999).</li>
<li>Martin, J. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brulet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+Ca+signalling+in+the+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of Ca signalling in the brain of Drosophila.</a> PLoS One. 2, 275-275 (2007).</li>
<li>Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+Ca2%2B+stores+contribute+to+odor-induced+responses+in+Drosophila+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons.</a> The Journal of Experimental Biology. 213, 4163-4173 (2010).</li>
<li>Yuste, R., Miller, R. B., Holthoff, K., Zhang, S., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapto-pHluorins%3A+chimeras+between+pH-sensitive+mutants+of+green+fluorescent+protein+and+synaptic+vesicle+membrane+proteins+as+reporters+of+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Synapto-pHluorins: chimeras between pH-sensitive mutants of green fluorescent protein and synaptic vesicle membrane proteins as reporters of neurotransmitter release.</a> Methods Enzymol. 327, 522-546 (2000).</li>
<li>Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+specificity+in+Drosophila+pheromone+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and specificity in Drosophila pheromone perception.</a> Trends Neurosci. 30, 512-519 (2007).</li>
<li>Elliott, D. A., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GAL4+system+%3A+a+versatile+system+for+the+expression+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The GAL4 system : a versatile system for the expression of genes.</a> Methods Mol. Biol. 420, 79-95 (2008).</li>
<li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).</li>
<li>Yagi, R., Mayer, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+LexA+transactivators+and+their+use+in+combination+with+the+Drosophila+Gal4+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Refined LexA transactivators and their use in combination with the Drosophila Gal4 system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16166-16171 (2010).</li>
<li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Q+System%3A+A+Repressible+Binary+System+for+Transgene+Expression%2C+Lineage+Tracing%2C+and+Mosaic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Q System: A Repressible Binary System for Transgene Expression, Lineage Tracing, and Mosaic Analysis.</a> Cell. 141, 536-548 (2010).</li>
<li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112, 271-282 (2003).</li>
<li>Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+expressed+cameleon+in+Drosophila+melanogaster+is+used+to+visualize+olfactory+information+in+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically expressed cameleon in Drosophila melanogaster is used to visualize olfactory information in projection neurons.</a> Curr. Biol. 12, 1877-1884 (2002).</li>
<li>Ng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+olfactory+information+between+three+populations+of+neurons+in+the+antennal+lobe+of+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly.</a> Neuron. 36, 463-474 (2002).</li>
<li>Sachse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+plasticity+in+an+olfactory+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit.</a> Neuron. 56, 838-850 (2007).</li>
<li>Pelz, D., Roeske, T., Syed, Z., de Bruyne, M., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+receptive+range+of+an+olfactory+receptor+in+vivo+%28Drosophila+melanogaster+Or22a%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The molecular receptive range of an olfactory receptor in vivo (Drosophila melanogaster Or22a).</a> J. Neurobiol. 66, 1544-1563 (2006).</li>
<li>Silbering, A. F., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+odor+mixtures+in+the+Drosophila+antennal+lobe+reveals+both+global+inhibition+and+glomerulus-specific+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Processing of odor mixtures in the Drosophila antennal lobe reveals both global inhibition and glomerulus-specific interactions.</a> J. Neurosci. 27, 11966-11977 (2007).</li>
<li>Reiff, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li>
<li>Abuin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+olfactory+ionotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of olfactory ionotropic glutamate receptors.</a> Neuron. 69, 44-60 (2011).</li>
<li>Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+ionotropic+glutamate+receptors+as+chemosensory+receptors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila.</a> Cell. 136, 149-162 (2009).</li>
<li>Pelz, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Functional+characterization+of+Drosophila+melanogaster+Olfactory+Receptor+Neurons%22">Functional characterization of Drosophila melanogaster Olfactory Receptor Neurons</a>. , Freien Universitat Berlin. (2005).</li>
<li>Ai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid+sensing+by+the+Drosophila+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Acid sensing by the Drosophila olfactory system.</a> Nature. 468, 691-695 (2010).</li>
<li>Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Brain+Imaging%3A+Fluorescence+or+Bioluminescence%2C+Which+to+Choose%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">In Vivo Brain Imaging: Fluorescence or Bioluminescence, Which to Choose?</a> Journal of Neurogenetics. , 1-23 (2008).</li>
<li>Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+a+genetically+encoded+optical+sensor+of+neural+activity+using+electrophysiology+in+intact+adult+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies.</a> Front. Neural Circuits. 1, 3-3 (2007).</li>
<li>Pfeiffer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9715-9720 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Aufbereitung und die Analyse hier beschriebenen Methoden können verwendet werden, um Geruchs-evozierte Potentiale in jeder Population von Neuronen im Antennallobus (OSN, LN und PNS), für die ein entsprechender Treiber verfügbar ist Transgen zu analysieren. Während wir seine Anwendung mit einem Fluoreszenzmikroskop beschreiben, können optische Bildgebung dieser Zubereitung ebenso durchgeführt mittels konfokaler oder Zwei-Photonen-Mikroskopie 22,32 werden. In der Tat, lindern diese letztgenannten Instrumente der Licht streuenden Problem der Weitfeld-Mikroskopie, die die Auflösung von Bildern reduzieren können, insbesondere wenn eine große Zahl von Neuronen Express der Reporter. Diese Zubereitung Regel erlaubt Aufnahmen Geruch hervorgerufenen Reaktionen für mindestens eine halbe Stunde, aber dieses Mal kann erheblich länger oder kürzer in Abhängigkeit von der Anzahl und Länge der aufgezeichneten Messungen, die Belichtungszeit für jeden Rahmen und der Inter-Stimulus-Intervall verwendet. Darüber hinaus können zwei-Photonen-Anregung reduzieren Ausbleichen der Fluoreszenz-reporter, sowie zelluläre Phototoxizität, um die Messung über einen längeren Zeitraum 22,32 ermöglichen. Unabhängig von der Wahl des Mikroskops ist die Bewegung der Fliege Gehirns im Kopf Kapsel die meisten immer wieder auftretendes Problem bei der Bildgebung bei gesunden Tieren. Während Bewegungskorrektur kleinere Probleme (Schritt 5.1) korrigieren kann, ist es meist besser nur aus sehr stabilen Vorbereitungen aufzunehmen. Strategien, um Bewegungsartefakte zu reduzieren sind: (i) richtig Einschränken der Rüssel der Fliege mit dem Kaktus Wirbelsäule, (ii) Immobilisierung der Fliege Beine durch Befestigung an der Bühne mit Eicosan (vor 2,6 Schritt) (Eicosan kann geschmolzen werden ~ 37 ° C; verwenden Sie einen Silberdraht zu erweitern und zu verfeinern, die Spitze des Lötkolbens für diesen Zweck), (iii) Nicking die Speiseröhre (sichtbar zwischen den Fühlern Nerven) mit feinen Pinzette. Neben den G-CaMP1.6 hier verwendet, gibt eine Reihe von optimierten Versionen von G-CaMP Calcium und andere Indikatoren,Sie unterscheiden sich in ihrer Signal-zu-Rausch-Verhältnis, Fluoreszenzbasismesswert und zeitliche Dynamik 12,28,33. Die genaue Wahl des Sensors sollte berücksichtigt werden, alle diese Eigenschaften, die Art der Neuronen zu analysieren und die biologische Frage angesprochen. Aktuelle Sensoren melden Kalzium Veränderungen, die ziemlich gut korrelieren mit Aktionspotentiale 12,34, und ihre weitere Verbesserung, mit steigender Anzahl von spezifischen genetischen Fahrer Linien 35 gekoppelt wird auch weiterhin das Potenzial der optischen Bildgebung neuronaler Aktivität im intakten Fliege zu verbessern.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Lieferant </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Cactus Wirbelsäule </td><td> Garten-Center </td><td></td><td> ~ 7mm langen, dünnen, nicht zu flexibel </td></tr><tr><td> Kolophonium </td><td> Saiteninstrument Shop </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zweikomponenten-Silikon </td><td> WPI </td><td> KWIK-SIL </td><td></td></tr><tr><td> Custom made Plexiglas Montageblock </td><td> Blueprints zur Verfügung <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kupfergitter </td><td> Athene Grids </td><td> G220-5 </td><td> Normalerweise für die Elektronenmikroskopie Proben verwendet. </td></tr><tr><td> Schrauben </td><td> Eisenwarengeschäft </td&gt; <td></td><td> 2 mm Durchmesser </td></tr><tr><td> Kunststoff-Deckgläschen </td><td> Plano-em </td><td> L4193 </td><td> 22 x 22 mm </td></tr><tr><td> Lötspitzen </td><td> Conrad Electronics </td><td> 830283-62 </td><td></td></tr><tr><td> Geregelte Stromversorgung </td><td> Conrad Electronics </td><td> 511407-62 </td><td></td></tr><tr><td> Dünner Draht </td><td> Isabellenhütte </td><td> Isa-Ohm- </td><td> 0,013 mm </td></tr><tr><td> Eicosan </td><td> Sigma </td><td> 21,927-4 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Axioexaminer D1 </td><td></td></tr><tr><td> CCD-Kamera </td><td> Visitron </td><td> CoolSnap HQ </td><td></td></tr><tr><td> Metafluor </td><td> Visitron </td><td></td><td> Acquisition Software </td></tr><tr><td> Monochromator </td><td> Visitron </td><td> Visichrome </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Breakable Klingen </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10050-00 </td><td></td></tr><tr><td> Halter für Klinge </td><td> WPI </td><td> 14134 </td><td></td></tr><tr><td> Sapphire Klinge </td><td> WPI </td><td> 500314 </td><td> Zweischneidige Klinge 1mm </td></tr><tr><td> Membran-Zapfsäulen </td><td> KNF Neuberger AG </td><td> NMP 830 KVE </td><td></td></tr><tr><td> Saphir Klingenhalter </td><td> WPI </td><td> 500317 </td><td></td></tr><tr><td> Drei-Wege-Ventil </td><td> Lee Company </td><td> LFAA1200118H </td><td> E-Konfiguration </td></tr><tr><td> Rotameter 500 ml / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 112-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Rotameter 5 l / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 102-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Bienenwachs </td><td> Siladent Technik </td><td> 209212 </td><td>; </td></tr><tr><td> Cellulose-Pad </td><td> Kettenbach Medical </td><td> 31003 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzette </td><td> Plano-em </td><td> T5130 </td><td> Dumont Biologie # 5 </td></tr><tr><td> Spritzen </td><td> BD </td><td> 300928 </td><td> 2ml, Discardit II, 2Stück </td></tr><tr><td> Needles </td><td> Braun Sterican </td><td> 4665120 </td><td> 1,2 mm OD </td></tr></tbody></table>

calcium imaging von geruchs-evozierte potentiale in der drosophila antennallobus

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Die Antennallobus ist das primäre olfaktorische Zentrum im Gehirn der Insekten und stellt die anatomischen und funktionellen Äquivalent der Wirbeltiere Riechkolben 1-5. Olfaktorische Informationen in der äußeren Welt ist mit dem Antennallobus von Riechzellen (OSN), die unterschiedliche Regionen des Neuropil genannt Glomeruli je nach der spezifischen olfaktorischen Rezeptor sie ausdrücken zu trennen übertragen. Hier können OSN Axone Synapsen mit lokalen Interneuronen (LNS), deren Prozesse innervieren viele verschiedene Glomeruli, und Projektion Neuronen (PNS), die olfaktorische Information an höhere olfaktorische Hirnregionen zu vermitteln. Die optische Bildgebung der Aktivität von OSN, LNS und PNS im Antennallobus - traditionell unter Verwendung von synthetischen Kalzium-Indikatoren (z. B. Calcium grün, Fura-2) oder spannungsabhängigen Farbstoffen (zB RH414) - ist seit langem eine wichtige Technik zu verstehen, wie olfaktorische Reize werden als räumliche und zeitliche Muster vertretender Glomeruliaktivität in vielen Insektenarten 10.06. Entwicklung genetisch kodierten neurale Aktivität Reporter, wie die fluoreszierende Calciumindikatoren G-CaMP 11,12 Cameleon 13, die Calcium-Indikator biolumineszierende Aequorin-GFP 14,15 oder ein Reporter der synaptischen Übertragung, hat im Gegensatz zu GFP Synaptosomen 16 die aus olfaktorische System der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, besonders zugänglich für neurophysiologische Imaging, ergänzt durch einen umfassend beschriebenen molekularen, elektrophysiologischen und neuroanatomischen Eigenschaften 2,4,17. Diese Reporter kann wahlweise über binäre Transkriptionskontrolle Systeme (z. B. GAL4/UAS 18, LexA / LexAop 19,20, Q-System 21) in definierten Populationen von Neuronen im olfaktorischen Schaltungen, um mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung, wie Gerüche hervorgerufene sezieren ausgedrückt werden neurale Aktivität dargestellt wird, moduliert und verändert 22-24 &lt;/ Sup&gt;. Hier beschreiben wir die Herstellung und Analyse-Methoden, um Geruchs-evozierte Potentiale in der Drosophila Antennallobus mit G-CaMP 25-27 zu messen. Das Tier Vorbereitung ist minimal-invasiv und kann auf Bildgebung mit Weitfeld-Fluoreszenz, konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie eingesetzt werden.

Wir beschreiben eine etablierte Technik zur Messung und Analyse Gerüche hervorgerufene Kalzium-Reaktionen im Antennallobus Lebensstandard<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Calcium Imaging von geruchs-evozierte Potentiale in der Drosophila Antennallobus

Der Antennallobus ist das primäre olfaktorische Zentrum im Gehirn von Insekten und stellt das anatomische und funktionelle Äquivalent zum olfaktorischen ... der Wirbeltiere dar.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die physiologische Aktivität olfaktorischer Neuronen in der Drosophila- und Antennenlappen mithilfe optischer Bildgebung von intrazellulären Kalziumänderungen zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst der Halter für den Montageblock, der Drahtträger und der Antennenschutz zusammengestellt werden. Anschließend wird eine Fliege, die den fluoreszierenden Kalziumsensor GCaMP exprimiert, auf dem Block montiert und fixiert. Nachdem die Fliege montiert ist, wird das Cuticula auf der Oberseite des Fliegenkopfs entfernt, um die Antennenlappen freizulegen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Fliege unter dem Mikroskop zu platzieren und sie mit einem Geruch zu stimulieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die geruchsinduzierte Aktivitätsmuster in den DLA-Antennenlappen mittels aufgezeichneter Änderungen der relativen Fluoreszenz des Kalziumsensors G camp zeigen.Diese Methode kann dabei helfen aufzudecken, wie Gerüche als räumliche und zeitliche Muster neuronaler Aktivität auf verschiedenen Ebenen der olfaktorischen Verschaltung dargestellt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden wie der Elektrophysiologie besteht darin, dass wir die Aktivität genetisch identifizierter Neuronen erfassen können, die für Ableitelektroden nicht zugänglich sind. Obwohl diese Methode Einblicke in die neuronale Verarbeitung von Gerüchen ermöglichen kann.Es kann auch auf andere Bereiche des joof-Gehirns angewendet werden, wie beispielsweise das auditorische und das gassy-System. Fädeln Sie zunächst die Schrauben von der Rückseite des Plexiglas-Montageblocks aus ein, sodass sie sich nicht über die Vorderseite hinaus erstrecken. Verwenden Sie einen Präzisionsbohrer, um eine Vertiefung am oberen Rand der kreisförmigen Kammer für die Fliege anzulegen, indem Sie unter die Oberfläche graben, um die Dicke des Blocks zu verringern.Unter einem Stereomikroskop schneiden Sie ein Kupfergitter mit einem Skalpell senkrecht und dicht an der Unterseite des Schlitzes durch, um einen Haltering zur Fixierung der Fliege zu erzeugen. Achten Sie darauf, dass die beiden entstehenden Laschen bündig sind, da dies die Einführung der Fliege erleichtert. Geben Sie mit einem Zahnstocher einen kleinen Tropfen Sekundenkleber auf den Montageblock oberhalb der kreisförmigen Kammer.Platzieren Sie für die Fliege das Kupfergitter auf den Kleber und positionieren Sie es so, dass der Schlitz mittig auf dem Block liegt. Drücken Sie das Gitter vorsichtig nach unten und entfernen Sie überschüssigen Kleber mit einer Pinzette. Geben Sie winzige Klebertropfen unter die Laschen auf jeder Seite und klappen Sie das Gitter über die Vorderseite des Blocks, sodass der Schlitz senkrecht nach unten zeigt.Stellen Sie sicher, dass die Oberseite des Rasters bündig mit dem Block abschließt, und lassen Sie es vollständig trocknen. Um eine Drahthalterung herzustellen, schneiden Sie eine Plastikobjektträgerabdeckung in zwei Hälften und entfernen Sie ein mittleres Stück, um eine U-Form zu erhalten. Befestigen Sie mithilfe von Bienenwachs einen Draht quer über die Oberkante des U, sodass der Draht nicht zu t ist.Konstruieren Sie eine Antennenabschirmung, indem Sie mit einem Locher ein Loch in eine Kunststoff-Deckfolie stanzen. Schneiden Sie die Kanten der Deckfolie auf 0,5 mal 0,7 Zentimeter zu. Kleben Sie die durchlöcherte Kunststoff-Deckfolie auf ein Klebeband und geben Sie dann einen Tropfen Ethanol auf das durch das Loch freiliegende Klebeband.Um den Klebstoff zu entfernen, betäuben Sie ein bis drei Wochen alte Fliegen des entsprechenden Genotyps, indem Sie sie auf Eis abkühlen. Unter dem Stereomikroskop fassen Sie eine Fliege am Flügelgelenk und schieben sie mit der dorsalen Seite zuerst entlang des Kupfergitters, sodass sie am Hals hängt. Falls erforderlich, drehen Sie die Fliege, bis sie nach unten blickt.Platzieren Sie eine feine Kaktusnadel vor dem Kopf der Fliege, um ein Entkommen zu verhindern, und positionieren Sie die Nadel vor dem Rüssel, um dessen Bewegung zu unterbinden. Befestigen Sie die Kaktusnadel mit Bienenwachs am Block und achten Sie darauf, dass die Oberseite des Kopfes bündig mit der Oberseite des Blocks ist. Fixieren Sie den Kopf der Fliege mit einem kleinen Tropfen Kolophonium, das in Ethanol gelöst ist, am Block.Stellen Sie den Block in eine befeuchtete Kammer und lassen Sie das Harz etwa eine Stunde lang aushärten. Ziehen Sie mit einer Pinzette die Antennenplatte nach vorne und legen Sie den Drahtträger in die Cuticularfalte zwischen Antenne und Kopf. Befestigen Sie den Träger mit weiterem Bienenwachs an der Vorderseite des Blocks.Drücken Sie mithilfe der in den Block eingebauten Schrauben den Drahtträger vorsichtig nach vorne, um etwas Platz zwischen der Antennenplatte und dem Kopf zu schaffen. Platzieren Sie die Antennenabschirmung so über dem Kopf einer Fliege, dass sie mittig sitzt. Befestigen Sie die Abschirmung mit Bienenwachs an der Oberseite des Montageblocks.Verwenden Sie einen Klingen-Spalt, um ein kleines Loch in das Klebeband auf dem Schild zu schneiden, wodurch die Kutikula des Fliegenkopfes hinter der Antenne freigelegt wird. Das Loch sollte sich nicht über die Augen hinaus erstrecken, um ein Austreten der Präparation zu verhindern. Versiegeln Sie die Öffnung zwischen dem Klebeband und der Kutikula mit zweikomponentigem Silikon.Entfernen Sie überschüssiges Silikon von der Oberseite des Fliegenkopfs. Geben Sie einen Tropfen Drosophila-Ringer-Salzlösung auf den Kopf der Fliege, wobei sichergestellt werden muss, dass keine Leckagen auftreten und die Antennen vollständig trocken bleiben. Verwenden Sie eine Saphir Klinge, um entlang der kutikulären Falte direkt hinter der Antenne leicht einzuritzen.Schneiden Sie dann entlang der Augen und über die Sella auf der Rückseite. Falten Sie schließlich das Stück Cuticula über die eingeritzte Kante und schneiden Sie von der Unterseite aus. Um die Antennennerve nicht zu durchtrennen, entfernen Sie vorsichtig die Drüsen und die Tracheen mit einer feinen Pinzette.Mehrfach mit Drosophila-Ringer-Lösung spülen und einen großen Tropfen auf dem Kopf belassen. Ein Zellulosepad mit sauberen Pinzetten in eine zwei Milliliter große Plastikspritze einbringen. Mit einer gefilterten Pipettenspitze 20 Mikroliter verdünntes Duftstoffgemisch auftragen.Spritze verstopfen und verschließen, bis sie für die Bildgebung benötigt wird. Das Präparat mit der Fliege unter dem Mikroskop platzieren. Das Objektiv absenken, bis es die Ringer-Lösung auf dem Kopf der Fliege berührt.Positionieren Sie die Präparation unter Verwendung der Hellfeldbeleuchtung so, dass die Öffnung in der Kopfkapsel zentriert ist und ihre Ränder scharf gestellt sind. Wechseln Sie zum fluoreszierenden Licht und stellen Sie so scharf, bis die markierten Neuronen sichtbar sind, die aufgrund der basalen grünen Fluoreszenz von GCaMP erkennbar sein sollten. Nehmen Sie Bilder mit einer an dem Mikroskop montierten CCD-Kamera und geeigneter Aufnahmesoftware auf und fokussieren Sie auf die gewünschten Glomeruli.Stellen Sie sicher, dass der Blendenverschluss im Beleuchtungspfad geschlossen ist, um das Anregungslicht auf den abgebildeten Bereich zu begrenzen. Positionieren Sie den Ausgang des Olfaktometers etwa 0,5 Zentimeter vor den Antennen der Fliegen. Hier sind die analen Lappen in einer Fliege dargestellt, die GCaMP 1.6 unter Kontrolle eines Promotors für olfaktorische sensorische Neuronen exprimiert, der die Expression in mehreren Glomeruli steuert. Stimulation mit 1 % Propionsäure führt zu einer Zunahme der GCaMP-Fluoreszenz, was auf erhöhte intrazelluläre Kalziumkonzentrationen in den olfaktorischen sensorischen Neuronen hinweist, die die Glomeruli DC4 und DP1l innervieren. Die zeitlichen Dynamiken der Kalziumantworten der Glomeruli DC4 und DP1l auf Propionsäure werden hier gezeigt.Die schwarzen Spuren zeigen den Median des mittleren Delta-F-über-F-Werts innerhalb des interessierenden Bereichs über acht Tiere hinweg, und die graue Fläche kennzeichnet den Bereich zwischen dem ersten und dritten Quartil der Verteilung. Die unten stehenden Wärmekarten zeigen die Reaktionen der einzelnen Tiere. Die grünlich gefärbten magentafarbenen Kästchen kennzeichnen die Bilder, die zur Berechnung der maximalen Antworten der Glomeruli über dem Basisfluoreszenzniveau von GCaMP gemittelt wurden, und sind hier quantifiziert dargestellt.Die Korrektur der Bleiche des fluoreszierenden Reporters kann Auswirkungen auf die Antwort haben. Die Spitzenproben-Daten im linken Panel können korrigiert werden, ohne dass sich die Form der Antwort wesentlich verändert. Die Daten im rechten Panel werden stark durch die Bleichkorrektur beeinflusst, wahrscheinlich weil das Signal nach Beendigung des Duftreizes abfällt und unterhalb des Grundwerts bleibt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in etwa 30 Minuten durchgeführt werden.Wenn das Verfahren korrekt durchgeführt wird, ist es wichtig, die Antennen vollständig trocken zu halten, da sie sonst nicht in der Lage sind, Gerüche wahrzunehmen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Gerüche präpariert, bildlich darstellt und analysiert.Lösen Sie neuronale Aktivität in der Fruchtfliege aus.

calcium-imaging-odor-evoked-responses-drosophila-antennal

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Bienen können in einer appetitive olfaktorischen Lernparadigma (PER-Konditionierung) konditioniert werden. Mit Gerüche als Stimuli, haben wir ein Verfahren, bei welchem ​​Verhalten aufgezeichnet, während gleichzeitig Calcium Imaging wird verwendet, um Geruchs-evozierte Aktivität im Pilzkörper Neuronen zu messen...

In vivo Ca 2 + - Imaging von Pilzkörper Neuronen während olfaktorischen Lernen in der Honigbiene

Dieses Video beschreibt die In-vivo-Calcium-Bildgebung in Drosophila-Neuronen mit GCaMP. Der vorgestellte Protokollclip zeigt, wie Veränderungen der GCaMP-Fluoreszenz von Pilzkörperneuronen während eines olfaktorischen Konditionierungsexperiments aufgezeichnet werden können.

Drosophila In Vivo Calcium Imaging: Eine Methode zur funktionellen Bildgebung neuronaler Aktivität

Dieses Video demonstriert eine Methode zum Nachweis sensorischer Neuronenreaktionen in Drosophila mittels Ligandenbindung und Fluoreszenzbildgebung. Liganden binden an Neuronenrezeptoren und verursachen so den Kalziumeinstrom. Das Kalzium bindet an Indikatorkomplexe, was zu einer Fluoreszenzemission führt, die die neuronale Reaktion auf den Liganden bestätigt.

Detektion physiologischer Reaktionen von sensorischen Neuronen in Drosophila

Dieses Video demonstriert eine Methode zur in vivo Kalziumbildgebung mit synaptisch lokalisierten Kalziumsensoren in Fliegen. Es beschreibt die Schritte zur Vorbereitung der Fliegen für die Mikroskopie, zur Durchführung der olfaktorischen Konditionierung und zur Visualisierung des geruchsinduzierten Kalziumeinstroms.

im lebenden Organismus Calcium-Imaging mit synaptisch lokalisierten Calciumsensoren in Drosophila melanogaster

Quelle: Ishimoto, H. et. al., Ex-vivo-Calcium-Bildgebung zur Visualisierung der Gehirnreaktionen auf endokrine Signalwege bei Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) Dieses Video zeigt die Kalziumbildgebung zur UntersuchungDrosophila Gehirnreaktionen auf Neuropeptide. Neuronen, die einen fluoreszierenden Kalziumindikator exprimieren, zeigen die intrazelluläre Kalziumdynamik und funktionelle Reaktionen auf Signalmoleküle.

Ex-vivo-Calcium-Bildgebung zur Untersuchung der Reaktionen des Drosophila-Gehirns auf Neuropeptide

Die Vorderbeine und der Rüssel von Drosophila enthalten ein reiches Repertoire an geschmacklichen sensorischen Neuronen. Hier stellen wir eine Methode vor, die Calcium-Imaging verwendet, um physiologische Reaktionen von sensorischen Neuronen im Vorderbein und Rüssel lebender Fliegen nach exogener Applikation eines gustatorischen Pheromons zu messen.

Mess physiologischen Reaktionen von<em&gt; Drosophila</emNeurone&gt; Sensory zu Lipid Pheromone Verwendung von Live-Calcium Imaging

Dieser Artikel beschreibt ein anpassungs ex vivo - Protokoll zur Visualisierung von Ca 2+ während Eiaktivierung in Drosophila.

Imaging Calcium in<em&gt; Drosophila</em&gt; Bei Eiaktivierung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, mit dem vor- und/oder postsynaptisches Kalzium im Kontext des Drosophila-Lernens und -Gedächtnisses visualisiert werden kann. In vivo Kalzium-Bildgebung mit synaptisch lokalisierten Kalziumsensoren wird mit einem klassischen olfaktorischen Konditionierungsparadigma kombiniert, so dass die synaptische Plastizität, die dieser Art des assoziativen Lernens zugrunde liegt, bestimmt werden kann.

In Vivo Optische Calcium-Bildgebung der lerninduzierten synaptischen Plastizität bei Drosophila melanogaster

Ein Calcium-Imaging-Ansatz ermöglicht die Aufzeichnung von geschmacksinduzierten Reaktionen im Gehirn wacher Fliegen, während eine Lösung auf das Labellum aufgetragen wird. Primäre gustatorische Reaktionen in Drosophila melanogaster werden als Beispiel verwendet, aber dieses Protokoll kann angepasst werden, um nachgeschaltete Neuronen oder andere Spezies zu untersuchen.

Im lebenden Organismus Kalzium-Bildgebung von geschmacksinduzierten neuronalen Reaktionen bei adulten Drosophila

Ein wesentliches Hindernis für die Untersuchung der zellulären Aktivität während kognitiver Prozesse wie Lernen und Gedächtnis ist die Verwendung von Anästhetika für die Vorbereitung von In-vivo-Bildgebung . Die Anästhesie beeinträchtigt das Kurzzeitgedächtnis und die Kognition in mehreren Modellen, einschließlich Drosophila. Diese Studie stellt eine einzigartige Methode zur Vorbereitung adulter Drosophila für die In-vivo-Bildgebung ohne Anästhesie vor.

Im lebenden Organismus Bildgebung der neuronalen Aktivität in nicht anästhesierten erwachsenen Drosophila-Fliegen

Wir stellen Calcium-Bildgebungsprotokolle  für ein Drosophila-Larven-Geruchsneuron vor, bei denen ein topischer Gewebekleber zur Immobilisierung verwendet wird. Diese Methode erhöht die Stabilität und ermöglicht zuverlässige in-vivo- und ex-vivo-Experimente. Benutzerdefinierte R-Skripte analysieren Kalziumsignale und bieten eine effiziente Plattform für detaillierte neurophysiologische Forschung.

In-vivo- und ex-vivo-Calcium-Bildgebung eines Neurons des olfaktorischen Schaltkreises in der dritten Larve von Drosophila melanogaster im dritten Stadium

Lernen Sie Calcium-Imaging geruchs-evozierter Potentiale im Antennallobus von Drosophila melanogaster. Diese optische Methode mit GCaMP ermöglicht die Erfassung neuronaler Aktivitätsmuster in Echtzeit.

Calcium Imaging von geruchs-evozierte Potentiale in der Drosophila Antennallobus

Weitere Videos entdecken